Genética y pollos: proteína CSF1-Fc humana en proteína de huevo



√Črase una vez un abuelo y una mujer. Y ten√≠an un pollo Ryaba. El pollo puso un test√≠culo, pero no uno simple, sino gen√©ticamente modificado. Un giro inesperado, ¬Ņverdad? Pero esto es precisamente lo que se discutir√° hoy. Los productos farmac√©uticos han cambiado mucho en las √ļltimas decenas, o incluso cientos de a√Īos. Ya no usamos sanguijuelas y no consideramos que la lobotom√≠a sea un excelente remedio para la migra√Īa. Ahora hay una gran cantidad de medicamentos que pueden curar una amplia variedad de enfermedades. La base de estas drogas, naturalmente, son ciertos compuestos qu√≠micos, cuya producci√≥n a veces est√° llena de grandes dificultades. Y luego, a los cient√≠ficos se les ocurri√≥ una idea brillante: ¬Ņpor qu√© necesitamos todos estos biogeneradores complejos, si pueden usar pollos? S√≠, has o√≠do bien, son las gallinas las que transportar√°n los huevos que contienen los compuestos qu√≠micos necesarios, como las prote√≠nas. C√≥mo los cient√≠ficos han cambiado los pollos para lograr estos objetivos, qu√© surgi√≥ y si no debemos temer capturar el planeta con gallinas carn√≠voras modificadas gen√©ticamente de dos metros, aprendemos del informe del grupo de investigaci√≥n. Vamos

Base de estudio

Vale la pena comenzar con el hecho de que el uso de animales como biorreactores no es algo revolucionario nuevo. Por ejemplo, la Antitrombina III, un medicamento obtenido de la leche de cabras genéticamente modificadas (GM), fue aprobado para su uso en 2006. En otras palabras, las cabras actuaban como un "laboratorio" que producía leche, que incluía el compuesto químico utilizado en la preparación.

Sin embargo, seg√ļn los cient√≠ficos, el uso de animales grandes para tales fines es bastante costoso, dado el peque√Īo n√ļmero de cr√≠as, un largo per√≠odo de gestaci√≥n y luego el crecimiento, etc. Es por eso que centraron su atenci√≥n en los pollos, y tambi√©n por el hecho de que los huevos de gallina contienen una cantidad suficiente de prote√≠nas. El promedio de 60 g de huevo de gallina contiene aproximadamente 3,5 gramos de prote√≠na. En un a√Īo, una gallina puede poner unos 300 huevos. Agregamos aqu√≠ la cr√≠a barata de pollos y el r√°pido crecimiento de los n√ļmeros en condiciones normales.

Adem√°s, adem√°s de las ventajas econ√≥micas, los cient√≠ficos notan m√°s ventajas cient√≠ficas. Entonces, en pollos y humanos, los patrones de glicosilaci√≥n, el proceso de adici√≥n de az√ļcares a las mol√©culas org√°nicas, est√°n muy cerca. Y esto significa que habr√° una baja inmunogenicidad de las preparaciones de prote√≠na de huevo que necesitan glicosilaci√≥n para activarse.

Todo esto suena muy, muy interesante, pero sabemos que hasta ahora los huevos de gallina se usan más para tortillas que como fuente de bases medicinales. Es decir, los pollos en este estudio no son simples (no, no son de oro, aunque desde un punto de vista financiero pueden serlo) y están genéticamente modificados.

Los cient√≠ficos se√Īalan que anteriormente, los lentivirus se usaban para llevar a cabo modificaciones de genes de pollo, ya que transfieren perfectamente la informaci√≥n gen√©tica a la c√©lula hu√©sped. La expresi√≥n transg√©nica puede limitarse en el oviducto utilizando la secuencia del gen ovoalb√ļmina (alb√ļmina de alb√ļmina de huevo). Este m√©todo permiti√≥ la creaci√≥n de dos prote√≠nas biol√≥gicamente activas en la prote√≠na del huevo, sin embargo, el nivel de expresi√≥n fue significativamente menor de 1 g / l. Y esto no es suficiente para que tal t√©cnica sea atractiva desde un punto de vista comercial e industrial.

En este estudio, los cient√≠ficos decidieron implementar un m√©todo m√°s avanzado para producir dos nuevas prote√≠nas, incluido un d√≠mero de citocina, as√≠ como un m√©todo de purificaci√≥n mejorado. El interfer√≥n őĪ2a, una preparaci√≥n biol√≥gica patentada para el tratamiento de ciertas formas de c√°ncer y hepatitis (ya obsoleto), se utiliz√≥ como modelo.

El principal participante en el estudio fue el factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF1), que es un paquete de 4 hélices, es decir, es estructuralmente similar a muchas citocinas, incluidas la insulina, la hormona del crecimiento, el lactógeno placentario, etc. Bueno, el principal "productor" en el estudio son las gallinas. Qué resultados mostraron los experimentos y los consideraremos más a fondo.

Resultados de la investigación


Imagen No. 1

Se sintetizaron 0,5 cl (miles de pares de nucle√≥tidos / mil bases emparejadas) de la secuencia codificante de interfer√≥n őĪ2a y se clonaron en el vector lentiviral del virus de la anemia infecciosa equina defectuosa en la replicaci√≥n de caballos con el promotor EREOVA.

Para aumentar el grado de expresi√≥n, se a√Īadieron 0,9 TPN de la secuencia promotora de ovoalb√ļmina entre el elemento de respuesta al estr√≥geno y el elemento regulador dependiente de esteroides ( 1a ). Fue este vector lentiviral el que permiti√≥ obtener aves transg√©nicas, entre las cuales se revel√≥ un macho (G1), que es portador de un transgen intacto (entero / intacto). En consecuencia, fue de este macho a quien se fue la l√≠nea de aves transg√©nicas (cr√≠as).

Mediante el uso de anticuerpos que responden al interfer√≥n őĪ humano, se detect√≥ la presencia de interfer√≥n őĪ2a en la prote√≠na del huevo de los pollos de prueba ( 1b ) utilizando inmunotransferencia de prote√≠nas.
Protein immunoblot * es un método analítico para determinar la presencia de proteínas en una muestra.
Cuantitativamente, se describi√≥ őĪ2a utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas, cuando los anticuerpos se unen a ant√≠genos espec√≠ficos, lo que permite determinar su cantidad.

Para confirmar la actividad biológica, antes del proceso de limpieza, los científicos colocaron la clara de huevo diluida en un transfector celular con el gen informador del elemento de respuesta estimulada por interferón que controla la expresión de luciferasa ( 1c ).
Reporter gene * : se une a las secuencias reguladoras de otros genes para estudiar las manifestaciones de genes en cultivos celulares.
Luciferasa * : enzimas oxidativas que desencadenan una reacción, una de cuyas características es la bioluminiscencia.
Después de todas las verificaciones, se inició el proceso de limpieza, que consistió en:

  • clarificaci√≥n de la ovomucina (glucoprote√≠na en la prote√≠na del huevo) disminuyendo el pH;
  • eliminaci√≥n de ovomucina usando una centr√≠fuga;
  • purificaci√≥n de interfer√≥n őĪ2a usando captura HiTrap Blue y cromatograf√≠a de exclusi√≥n por tama√Īo adicional.

El grado de purificación (> 95%) se confirmó por electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida ( 1d ).

Fue posible obtener 15 mg de interfer√≥n őĪ2a a partir de 100 ml de prote√≠na de huevo, y esto representa aproximadamente el 60% del volumen de interfer√≥n őĪ2a (25 mg) detectado por inmunoensayo enzim√°tico ( 1e ).

Puede que tenga una pregunta, pero ¬Ņqu√© pasa con las enfermedades que pueden pasar de los pollos a los humanos usando este interfer√≥n őĪ2a? Los cient√≠ficos han comprobado esto, y m√°s precisamente, las propiedades antivirales de őĪ2a mediante la introducci√≥n del virus tipo A H1N1 en las c√©lulas previamente tratadas con őĪ2a. Y los resultados de este an√°lisis fueron m√°s que positivos ( 1f ): la actividad antiviral del interfer√≥n de la prote√≠na del huevo fue de 1x10 9 U / mg, que es un orden de magnitud mayor que el de las prote√≠nas producidas por bacterias.


Imagen No. 2

Una de las proteínas más importantes en la diferenciación, proliferación y funcionamiento de los macrófagos es CSF1.

La secuencia de codificación CSF1 de cerdo, combinada con F c , se sintetizó (pCSF1-F c ) y se clonó en el vector lentiviral pLenti6 (aislado del VIH) entre el promotor EREOVA2 y el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de marmota ( 2a ).
F c * (fragmento de cristalizaci√≥n de la inmunoglobulina) es parte de una mol√©cula de inmunoglobulina que interact√ļa con el receptor F c en la superficie celular y con algunas prote√≠nas.
Después de la eliminación del macho (G0), que se convirtió en la base de una nueva línea de descendencia, entre las cuales se reveló un transgen intacto en dos hembras y un macho. Estos individuos posteriormente participaron en la cría de la progenie de la próxima generación (G2). La electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida confirmó la presencia de pCSF1-F c en la proteína de huevo ( 2b ).

El CSF1 de cerdo se expresó en células Ba / F3. Esto condujo al hecho de que la existencia misma de estas células dependía de CSF1-F c . Por lo tanto, fue posible evaluar la viabilidad celular de la proteína de huevo de prueba, que era bastante alta en comparación con el grupo de control (proteína de huevos ordinarios), donde la tasa de supervivencia era casi cero ( 2c ).

A continuación, la proteína de huevo de pCSF1-F de los huevos se purificó de ovomucina y se transfirió al estado sobrenadante (sobrenadante, líquido por encima del residuo seco), como se muestra en la imagen 2d .

La forma dim√©rica activa de pCSF1-Fc se purific√≥ por absorci√≥n de MabSelect SuRe y pulido adicional usando cromatograf√≠a de exclusi√≥n por tama√Īo ( 2e ). La tasa de pureza fue superior al 97%.

Como resultado, el peso molecular promedio fue de aproximadamente 95.1 kDa (kilodaltons), la monodispersidad de la prote√≠na tambi√©n fue satisfactoria - Mw / Mn = 1.011 (Mw es el peso molecular promedio en peso, Mn es el peso molecular promedio en n√ļmero). El an√°lisis del modelo de copol√≠mero mostr√≥ la presencia de prote√≠na de 85,6 kDa y oligosac√°rido de 9,5 kDa.

Tambi√©n se prob√≥ la viabilidad celular: algunos de los huevos se colocaron en un refrigerador a -20 ¬į C durante 1 mes, y parte durante el mismo per√≠odo, pero a -80 ¬į C. En ambos casos, las c√©lulas sobrevivieron ( 2 g ), lo que indica la posibilidad de almacenamiento a largo plazo y su uso posterior incluso antes de la purificaci√≥n sin p√©rdida de actividad.

También se realizó un análisis de la capacidad de la proteína purificada para interactuar con el receptor CSF1. Esto se realizó utilizando células de médula ósea de ratón y los resultados fueron satisfactorios ( 2 h ).


Imagen No. 3

Luego, los cient√≠ficos decidieron probar la actividad de pCSF1-F c de la prote√≠na del huevo en condiciones de campo, es decir, en ratas de laboratorio que fueron inyectadas con 1 őľg / g de control o prote√≠na pCSF1-F c purificada. Despu√©s de eso, se verific√≥ el peso y la histolog√≠a del h√≠gado, el bazo y la sangre de las ratas. Ambas variantes de pCSF1-F c condujeron a un aumento en el n√ļmero de c√©lulas F4 / 80 + CD11b + en la sangre ( 3a ) y macr√≥fagos de tejido F4 / 80 + en el h√≠gado ( 3b ). Tambi√©n se observ√≥ un aumento significativo en el peso del h√≠gado y el bazo ( 3c y 3d ).


Imagen No. 4

Las pruebas, análisis y experimentos anteriores mostraron muy buenos resultados. Ahora solo queda demostrar que tales métodos pueden permitir la producción de una citocina humana, que puede usarse en medicamentos.

Los cient√≠ficos se√Īalan que pCSF1-F c muestra buena actividad en c√©lulas humanas y puede ser inmunog√©nico. Para confirmar esto, las ratas de laboratorio fueron inmunizadas con la prote√≠na CSF1-F c para producir anticuerpos monoclonales que reaccionan de forma cruzada con el CSF1 humano.

Antes de realizar pruebas reales y analizar sus resultados, los científicos prepararon pollos que expresan la proteína CSF1-F c humana (hCSF1-F c ). Para hacer esto, utilizamos la técnica y el sistema vectorial descritos anteriormente. En dos pollos, se reveló un transgen intacto que mostró la expresión de proteína necesaria de 1 mg / ml ( 4a ). Seguido por el proceso de limpieza anterior ( 4b ). La tasa de supervivencia de la hCSF1-Fc purificada también fue alta, incluso después del secado al vacío y la reducción ( 4c ).

Para un conocimiento más detallado de los matices del estudio, le recomiendo que consulte el informe de los científicos .

Epílogo

El resultado de este estudio es la confirmaci√≥n de que el interfer√≥n őĪ2a y CSF1-F c se sintetizan perfectamente como componentes de la clara de huevo regular. La extracci√≥n de estas prote√≠nas tampoco requiere esfuerzos especiales, sino solo t√©cnicas cromatogr√°ficas est√°ndar. Las prote√≠nas obtenidas son activas tanto en el laboratorio como en el cuerpo de un sujeto vivo (ratas).

Muchos son muy escépticos sobre las modificaciones genéticas. Algunos incluso tienen miedo de esta frase y de todo lo que se puede conectar con ella. Sin embargo, solo vale la pena comprender un poco las perspectivas que pueden dar las modificaciones genéticas humanas, cómo se disipan los miedos y los dogmas obsoletos. En este caso en particular, examinamos un estudio en el que los científicos literalmente forzaron a los pollos a poner huevos con proteínas humanas, que se pueden usar para producir de manera económica, eficiente y rápida los componentes necesarios para crear medicamentos. Quizás estas gallinas no llevan huevos de oro, pero su valor es mucho mayor.

Y, por supuesto, el viernes fuera del tema:

Un poco de m√ļsica antes del fin de semana :)

Gracias por mirar, mantén la curiosidad y que tengan un gran fin de semana, muchachos.


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Source: https://habr.com/ru/post/438164/


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