No apto para selfies: ensayo inmunosorbente digital ligado a enzimas utilizando un nuevo chip integrado en un teléfono inteligente



¬ŅDesde qu√© oficina en cualquier hospital gritan de vez en cuando ni√Īos y adultos? ¬ŅQu√© padres, enga√Ī√°ndonos descaradamente en la infancia, en comparaci√≥n con una picadura de mosquito? Creo que ya has adivinado que este es un an√°lisis de sangre. Ahora este procedimiento se ha vuelto m√°s r√°pido y menos doloroso. Una cosa no ha cambiado: su importancia. El diagn√≥stico en medicina juega el papel m√°s importante en las primeras etapas de la lucha contra una enfermedad. Despu√©s de todo, para vencer una dolencia, primero debe ser descubierta. Despu√©s de haber sobrevivido al procedimiento de muestreo de sangre para el an√°lisis, se puso en marcha con calma para esperar sus resultados. En este momento en los laboratorios, las personas que utilizan dispositivos complejos, voluminosos y muy caros analizan su sangre, descubriendo qu√© contiene y en qu√© cantidad. Es bueno tener un laboratorio as√≠ en su hospital local, pero este no es siempre el caso. Pero, ¬Ņqu√© pasar√≠a si hubiera un laboratorio de bolsillo, peque√Īo y econ√≥mico, pero al mismo tiempo analizando muestras con la misma precisi√≥n y eficiencia que uno ordinario? Suena a ciencia ficci√≥n, ¬Ņverdad? La frase "analizador de az√ļcar en sangre de bolsillo" en su momento tambi√©n sonaba futurista. Hoy conoceremos la investigaci√≥n e implementaci√≥n de la tecnolog√≠a para el an√°lisis cuantitativo de prote√≠nas y amino√°cidos a trav√©s de un nuevo tipo de dispositivo compacto. ¬ŅEn qu√© consiste este milagro, c√≥mo funciona y qu√© tan efectivo? Recibiremos respuestas a estas y otras preguntas en el informe de los cient√≠ficos. Vamos

Base de estudio


Vivimos en la era de la tecnolog√≠a digital, que se est√° implementando con √©xito en varias √°reas de nuestras vidas. Los estudios de laboratorio (diagn√≥stico) no son una excepci√≥n. Los cient√≠ficos se√Īalan que el an√°lisis de goteo digital es 1000 veces m√°s preciso que el tradicional y permite realizar millones de an√°lisis en paralelo dentro de una sola gota de una muestra con un volumen medido en femtolitros (fl, 1 fl = 10-15 L).

El uso del an√°lisis digital es extremadamente √ļtil para detectar √°cidos nucleicos y prote√≠nas, analizar c√©lulas individuales e incluso exosomas.
Exosomas * : vesículas extracelulares (diámetro: 30-100 nm), que son secretadas por las células en el espacio intercelular. Los exosomas están involucrados en el trabajo de inmunidad, secreción de proteínas, etc.
Por el momento, los métodos de análisis digital más famosos son dELISA (ensayo de inmunosorción enzimática digital / DIA) y qPCR (reacción en cadena de la polimerasa digital). Estas técnicas le permiten trabajar con células individuales, mientras obtiene resultados muy precisos que no requieren corrección. Recientemente, utilizando estos métodos, se realizó un análisis cuantitativo exitoso de proteínas y ARNm en una célula al mismo tiempo.

T√©cnicas similares y una demostraci√≥n de sus talentos muestran una vez m√°s que la implementaci√≥n del an√°lisis paralelo dentro de un entorno extremadamente peque√Īo (muestra) es bastante posible. Sin embargo, como cualquier otra tecnolog√≠a, estos m√©todos tambi√©n tienen desventajas. Son bastante triviales: dimensiones, precio y complejidad de fabricaci√≥n. Los investigadores nos recuerdan que una instalaci√≥n para un amplificador digital (Quanterix's Simoa) cuesta alrededor de $ 100,000. Y no todas las cl√≠nicas privadas pueden pagar tal cantidad, ya no tengo en cuenta las estatales.

Por supuesto, esta "bestia" Simoa de Quanterix es muy poderosa, si es exagerada. Utiliza tabletas con microcélulas con 200,000 células de 40 fl cada una.


La simoa de Quanterix

Al mismo tiempo, este dispositivo puede procesar en paralelo hasta 4 tabletas ELISA de 96 c√©lulas cada una. Por lo tanto, un dispositivo es capaz de producir los resultados de 66 muestras en una hora, cada una de las cuales puede someterse a un an√°lisis de 10 plex (es decir, 1 muestra se analiza para 10 indicadores a la vez). Los n√ļmeros son realmente incre√≠bles. Pero nuevamente, surge la pregunta sobre el precio y las dimensiones de una m√°quina de milagros.


Imagen No. 1

Y aqu√≠, los cient√≠ficos proponen volver la vista hacia los sistemas de gotas microflu√≠dicas. Los sistemas cl√°sicos de este tipo no pueden presumir de un rendimiento colosal Simoa de Quanterix, sin embargo, pueden servir como base para un nuevo dispositivo. La t√©cnica de gotitas microflu√≠dicas de flujo continuo te√≥ricamente puede analizar hasta 1 mill√≥n de c√©lulas. Sin embargo, en la pr√°ctica, estos indicadores a√ļn no se han logrado por varias razones. En primer lugar, el rendimiento (menos de 104 gotas por segundo), cuando las gotas se generan secuencialmente (no en paralelo) y son monodispersas. En segundo lugar, la detecci√≥n de fluorescencia de cada gota se lleva a cabo pas√°ndolas una a la vez a trav√©s de un punto l√°ser. En otras palabras, todo est√° en l√≠nea, uno a la vez. Este proceso se muestra en la imagen 1a (separaci√≥n, incubaci√≥n y determinaci√≥n; 3 horas para el an√°lisis de 10 7 gotas).

Los principales problemas de convertir este método a un formato compacto son la dificultad de paralelizar la óptica para la detección multicolor de fluorescencia, la complejidad de integrar el proceso de preparación de muestras y la necesidad de ciertas herramientas para generar flujos de gotas estrictamente controlados. Sin embargo, los científicos no están acostumbrados a rendirse ante las dificultades, no importa cuán impresionantes sean.

Micro-drop Megascale Detector (MD, macro detector) es la creaci√≥n de nuestros h√©roes hoy. Este dispositivo no solo se puede implementar en cualquier dispositivo m√≥vil (de bolsillo), sino que tambi√©n cumple con los est√°ndares de an√°lisis cuantitativo de los laboratorios comunes de tama√Īo completo. El proceso se muestra en la imagen 1b (separaci√≥n, incubaci√≥n y determinaci√≥n; 10 minutos para el an√°lisis de 10 7 gotas).

Para lograr esto, seg√ļn los investigadores, se implementaron tres tareas principales:

  1. En lugar de generar 1 gota cada una, se utilizó la generación paralela de gotas microfluídicas, que funcionaban 100 veces más rápido. Y los logros de otros científicos en el campo de la producción de gotas monodispersas ( enlace a este estudio ) hicieron posible deshacerse de la dependencia de la monodispersidad de las gotas en la velocidad de flujo. Esto permite el uso de bombas peristálticas muy económicas que pueden integrarse en un dispositivo móvil (de mano).
  2. La lectura r√°pida de la fluorescencia de gotas a una velocidad de m√°s de 105 por segundo (recuerde el l√≠mite de 104, que mencion√© anteriormente) se logr√≥ gracias a la visualizaci√≥n basada en un tel√©fono m√≥vil, que es 100 veces m√°s r√°pido que la lectura convencional (cuando las gotas se leen a su vez). En este caso, no hay necesidad de √≥pticas costosas, y la implementaci√≥n en dispositivos m√≥viles de mano es obvia. La principal caracter√≠stica distintiva de esta innovaci√≥n es la capacidad de superar las limitaciones de la baja velocidad de cuadros de una imagen digital y proporcionar detecci√≥n de fluorescencia multicolor al modular varias fuentes de excitaci√≥n de LED o diodos l√°ser de diferentes colores con se√Īales √ļnicas no peri√≥dicas. El video se puede decodificar para obtener datos de fluorescencia de gotas, superando los l√≠mites de velocidad de cuadros de la c√°mara. Por lo tanto, es posible lograr las mismas (mencionadas anteriormente) de 1 mill√≥n de gotas por segundo.
  3. Y, por √ļltimo, la integraci√≥n de una unidad de procesamiento de microgr√°nulos (o microperlas, objetos esf√©ricos microsc√≥picos), un generador de gotas, l√≠neas de retardo de se√Īal para la incubaci√≥n de gotas y un detector de fluorescencia. En conjunto, esto proporciona un dispositivo econ√≥mico, compacto y eficiente para ingresar suero no tratado (muestra) y generar datos moleculares (resultado).

Como demostración de su invención, los científicos implementaron un DIGA multiplexado utilizando diferentes microgránulos de color obtenidos de tintes fluorescentes. Cada color es el "código" de color de la proteína a la que se dirige el anticuerpo microperla ( 1c ).

Se realiz√≥ un an√°lisis m√ļltiple de suero GM-CSF e IL6 en suero usando gr√°nulos fluorescentes ultravioleta y verde, cuando las gotas conten√≠an un microgr√°nulo con un inmunocomplejo rojo fluorescente. Se us√≥ suero bovino como medio para el an√°lisis cuantitativo, y el l√≠mite de determinaci√≥n fue 0,004 pg / ml (picogramo por mililitro, 1 pg = 10-12 g). Esto es 1000 veces m√°s preciso que el ELISA est√°ndar y corresponde al nivel de precisi√≥n del ELISA digital.

Solo lleva 10 minutos procesar 10 millones de gotas. En este caso, el proceso en sí incluye la generación e incubación de gotas, así como la detección de gotas fluorescentes para cada muestra.

Estructura del dispositivo y proceso de an√°lisis.



Imagen # 2: estructura del dispositivo MD.

Un poco m√°s sobre la imagen de arriba: 2a - diagrama de chip, vista superior e inferior; 2b es una foto de un chip MD en el que todos los canales optofluidos son visibles; 2c es una micrograf√≠a del proceso de encapsular microperlas en gotas con un di√°metro de 40 őľm; 2d es una micrograf√≠a de fluorescencia de gotas despu√©s de una l√≠nea de retardo; 2e es una representaci√≥n esquem√°tica de una plataforma MD (tel√©fono m√≥vil, 3 fuentes de luz y el chip MD en s√≠).

Los componentes principales de MD pueden llamarse procesadores de microgr√°nulos, donde estos √ļltimos capturan prote√≠nas diana del suero. Despu√©s de esto, los gr√°nulos se marcan con inmunocomplejos para su posterior amplificaci√≥n dentro de las gotas. Entre cada uno de estos procesos, se produce una limpieza iterativa (varias veces). Tambi√©n est√° presente un generador de gotas, donde los microgr√°nulos se mezclan con un sustrato enzim√°tico y se encapsulan en gotas de agua y aceite.

Luego viene un canal microflu√≠dico a trav√©s del cual pasan las gotas durante 3.2 minutos. Este canal es necesario como retraso / desaceleraci√≥n del proceso, lo que permite amplificar enzim√°ticamente la se√Īal fluorescente. La parte final es un detector (o esc√°ner) basado en un tel√©fono m√≥vil (c√°mara), donde se detecta la fluorescencia de las gotas.

El procesador de microgránulos consta de una membrana semipermeable para inmovilizar los gránulos. Se suministran varios reactivos y tampones de lavado a los gránulos inmovilizados. Después de esto, los gránulos se liberan para su posterior análisis.

La membrana en s√≠ est√° hecha de policarbonato. Una huella grabada de 300 mm 2 con poros de 3 őľm de di√°metro fue grabada en la membrana.

En este experimento, hab√≠a dos grupos de microgr√°nulos: (d = 5.4 őľm, ex / em = 470/490 nm, CFH-5052-2), funcionalizados con anticuerpo anti-GM-CSF (MAB2172) y (d = 4.5 őľm, ex / em = 370/410 nm, CFP-4041-2) funcionalizado con anticuerpo anti-IL6 (MAB206).

En primer lugar, los microgránulos pasan por el proceso de incubación junto con la muestra durante 1 hora, y solo después de eso se capturan en la membrana mencionada anteriormente.

En esta etapa (dentro de la membrana), los gránulos se lavan con 1 ml de tampón T20 a una velocidad de flujo de 10 ml / h, se incuban con 0,1 ml de anticuerpo de detección 0,7 nM en tampón T20 durante 0,5 horas, se lavan nuevamente con 1 ml de tampón T20 a 10 ml / h, y después de eso se liberan de la membrana cambiando el caudal a 6 ml / h.

Despu√©s de eso, las microperlas liberadas se mezclan con un sustrato ELISA y se encapsulan en gotas con un di√°metro de 40 őľm. Para garantizar una mezcla precisa de gr√°nulos y sustrato y para minimizar la se√Īal de fondo de las enzimas que generan una se√Īal fluorescente, se utiliza un canal especial con una longitud de 14 mm.

El generador de gotas est√° dise√Īado para que el di√°metro de las gotas sea independiente del caudal. Este dispositivo tiene solo 100 de estos generadores, que en la salida dan un rendimiento de 100,000 gotas por segundo.

Cada gota se encapsula con 1 gránulo o permanece intacta. Al mismo tiempo, se logra una cierta concentración: 10 gotas más que los microgránulos (por ejemplo, 20 gotas - 10 con gránulos y 10 sin). Esto reduce la probabilidad de que en una gota haya dos gránulos hasta 0.5%.

Despu√©s de los generadores de gotas, hay una l√≠nea de retardo similar a una espiral con un ancho de canal de 1.8 mm y una altura de 1.5 mm. La l√≠nea de retraso debe ser lo suficientemente larga, pero no puede aumentar el tama√Īo del dispositivo. Por lo tanto, se hicieron 4 espirales uno a uno, para pasar completamente, lo que a un caudal de 67 ml / h, las gotas tomar√≠an 3,2 minutos.

Para introducir dicho dispositivo en una plataforma móvil, fue necesario resolver ciertas tareas relacionadas con la cámara del teléfono. El uso de una excitación de luz constante de tiempo constante conduce al hecho de que las gotas que se mueven en el campo de visión de la cámara se visualizan como rayas. La longitud de esta tira establece la distancia mínima entre las gotas y, por lo tanto, limita seriamente el rendimiento.

Si usamos la excitación de la luz con una secuencia pseudoaleatoria (en el tiempo), esto nos permitirá "ver" las gotas individuales. La velocidad de modulación de la luz es 10 veces el tiempo de exposición de la cámara. Debido a esta diferencia, las gotas forman tiras, la distancia entre las cuales (tres diámetros de gotas) es suficiente para su determinación individual. En este caso, puede omitir 120 canales de goteo paralelos frente a la cámara.

Otro punto importante en la detecci√≥n y exploraci√≥n es la fluorescencia. Para llevar a cabo el ELISA multiplex, se necesitan varias se√Īales fluorescentes diferentes, para esto se utilizaron 3 fuentes de luz a la vez, cada una de las cuales tiene la longitud de onda necesaria para excitar un determinado colorante fluorescente. Este sistema triple consta de dos l√°seres de diodo (azul, verde) y un LED (UV).


Imagen No. 3: proceso de "resultado de muestra" (decodificación de datos de la cámara del teléfono).

Para la decodificación precisa del video desde la cámara del teléfono, fue necesario realizar una detección de correlación para los tres patrones de modulación esperados ( m ), que corresponden a cada una de las tres fuentes de luz.

El resultado fue un vector de correlación ( 3a ), donde: k - cuadros; n = 1: 120 canales en el dispositivo; R , G , B - canales de color de la cámara digital; r , g , b - excitación de color.

El patrón de gotas se creó a través de una secuencia de longitud máxima (MLS) con | m | = 63 bits. Además, cada bit tiene 10 píxeles en una imagen digital, es decir, un total de 63 bits es 630 píxeles (1/3 de un marco de ancho en 1920).

Es necesario un escaneo de fluorescencia para determinar si una gota contiene un microgránulo, si es así, para determinar el color (UV o proteína verde, molécula roja objetivo). Después de recibir estos datos, deben ser extraídos. Para hacer esto, el cuadro de video se divide en componentes rojo, verde y azul de acuerdo con los sensores de la cámara ( 3d ).

Este dispositivo utiliza tecnolog√≠a en la nube. Esto se hizo para reducir la carga en la plancha (es decir, en el tel√©fono). En lugar de controlar la velocidad o fase de las gotas, se realiz√≥ la computaci√≥n en la nube para determinar las gotas con una fase o velocidad desconocida ( 3s ). Despu√©s de determinar las fases √≥ptimas y la velocidad de la gota, se pueden determinar con precisi√≥n los picos en el espacio de correlaci√≥n ő® r, g, b k, n (x, ŌÖ c , őł c ) ( 3f y 3g ).

Los datos recopilados se cargan en una aplicaci√≥n especial (hasta ahora solo en el sistema operativo Android), que los env√≠a a la nube para procesarlos utilizando MATLAB en un servidor remoto. Despu√©s de eso, los datos ya procesados ‚Äč‚Äčse devuelven al tel√©fono inteligente y se muestran en la pantalla.

Después de todo el trabajo preparatorio y de prueba, los científicos decidieron llevar a cabo un "combate" con la participación de su creación y el dispositivo comercial existente Simoa.

En el duelo de prueba, se utilizaron tres versiones del medio de trabajo: PBS - tampón de fosfato de sodio, FBS - suero bovino fetal y suero sanguíneo humano. El indicador más importante fue el límite de detección (LOD), es decir, el contenido mínimo del analito en la muestra.


Resultados de la prueba de chip MD.

Se realizaron varias mediciones de un solo complejo de M-CSF (Imagen A arriba) e IL6 (Imagen B ) en medio PBS midiendo diluciones en serie de 104 a 102 pg / ml. En esta prueba, se obtuvieron límites de detección muy buenos: LOD = 0.0045 pg / ml para GM-CSF y LOD = 0.0070 pg / ml para IL6.

También se realizaron mediciones similares en solución de FBS (1: 4). En esta etapa, la muestra para análisis se dividió a la mitad entre el dispositivo en estudio y el Simoa comercial "pesado". Como resultado, la creación de científicos mostró excelentes resultados, que prácticamente no fueron inferiores a los de Simoa (R2 = 0.95, imagen C arriba).

Pero fue un an√°lisis de un solo plex, es decir, un an√°lisis de un indicador. Ahora era necesario verificar c√≥mo el chip MD lidiar√° con el an√°lisis paralelo de varias prote√≠nas, es decir, con el an√°lisis d√ļplex de GM-CSF e IL6 simult√°neamente. Para empezar, se a√Īadi√≥ una cierta cantidad de GM-CSF al FBS, y la concentraci√≥n de IL6 fue cero (im√°genes F y G ). Luego se hizo lo contrario: concentraci√≥n cero de GM-CSF y algo de IL6.

En ambos casos, el límite de detección no difirió mucho de los resultados del análisis one-plex realizado anteriormente (p> 0,88 para GM-CSF y p> 0,90 para IL6).

Despu√©s de eso, se a√Īadi√≥ una cierta cantidad de GM-CSF e IL6 (imagen h) a la muestra. La precisi√≥n de detecci√≥n fue excelente: R2> 0:99 para GM-CSF y R2> 0:99 para IL6.

La prueba m√°s significativa fue el an√°lisis de suero humano. Se tomaron muestras de sangre de 14 sujetos. Los investigadores cuantificaron el GM-CSF e IL6 de estas muestras usando un chip MD y Simoa.


Resultados cuantitativos de suero humano GM-CSF e IL6 usando MD y Simoa.

Los resultados del an√°lisis con el chip MD resultaron ser muy similares a los resultados de Simoa (R2 = 0: 96), que actualmente es el analizador m√°s preciso.


Demostración del dispositivo.

Para un conocimiento más detallado de los matices y detalles del estudio, le recomiendo que consulte el informe del grupo de investigación y los materiales adicionales .

Epílogo


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Source: https://habr.com/ru/post/442618/


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