Antes de leer esta actualización, es recomendable familiarizarse con el código fuente publicado anteriormente .El primer y más popular secuenciador de poros nanion MinION (el mínimo establecido en el Reino Unido es de $ 1000, en Rusia - 150 mil rublos), desarrollado por Oxford Nanopore Technologies (ONT), opera en celdas desechables, cada una de las cuales cuesta $ 900 (en Rusia - 135 mil rublos). Dichas células le permiten digitalizar ADN 10 ... 20 Gb en 2 ... 3 días. Esto es demasiado poco para secuenciar el genoma humano (necesita> 100 Gb), pero demasiado para todos los demás fines de diagnóstico clínico (<1 Gb es suficiente).
Recientemente comenzó a vender modelos más productivos (y más caros): PromethION 24/48 ($ 165,000 / $ 285,000), dirigido principalmente a la secuenciación en línea de genoma completo. Más caros son sus consumibles más eficientes ($ 2,000 / unidad,> 100 Gb). Es cierto que pueden ser más baratos a granel ($ 1,800,000 por 2,880 piezas, $ 625 / piezas), pero tales adquisiciones (200 ... 250 millones de rublos por lote) no están permitidas para el presupuesto ruso.
Y no solo para ruso. Por lo tanto, la atención de los visitantes a la reciente conferencia ONT (22-24 de mayo) fue atraída por el anuncio del inicio de las ventas de Flongle, un inserto adaptador para el secuenciador MinION, que permite trabajar con celdas desechables menos eficientes (~ 1 Gb), pero relativamente baratas ($ 90).
https://nanoporetech.com/productsLa aparición de Flongle puede causar un aumento explosivo en el uso de NGS (secuenciación de próxima generación) en la práctica clínica y desplazar los diagnósticos de PCR convencionales, cuyo tamaño de mercado en Rusia supera los mil millones de rublos, y en el mundo se mide en miles de millones de dólares. Pero para la mayoría de los pacientes rusos, los diagnósticos NGS seguirán siendo un lujo inadmisible, ya que el costo de las células para Flongle en el mercado interno será de más de 10 mil rublos. Y si le sumamos el costo de los reactivos prescindibles, los costos de transporte y los gastos generales, entonces el costo estimado de secuenciar una muestra de ADN / ARN no será inferior a 20 mil rublos.
Esto implica la necesidad de desarrollar secuenciadores domésticos de nanoporos y proporcionarles consumibles y reactivos baratos.
Nanorider
Es posible reducir significativamente el costo de la secuenciación de nanoporos reutilizando las células para Flongle e importando la sustitución de los reactivos necesarios para trabajar con ellos. Pero primero debe obtener un dispositivo de prueba que le permita controlar la formación de membranas lipídicas de bicapa (BLM) en 126 pozos de la célula de trabajo, y evaluar la cantidad y calidad de los nanoporos incrustados en estas membranas. Tal dispositivo ("Nanorider"?) Debería rastrear los cambios en la conductividad eléctrica (y / o impedancia) de los pozos individuales durante la formación de BLM en ellos, y registrar las corrientes picoamperosas que fluyen a través de canales de iones individuales.
Es posible componer un lector conectado a la computadora a través de USB 2.0 a partir de elementos estándar: FPGA (100 ... 200 $), amplificadores de corriente (MAX9923FEUB - 200 ... 300 rublos), ADC (1 ... 2 mil rublos), etc. solo una placa con una almohadilla de contacto no estándar (10x13) tipo LGA (Land Grid Array) para acoplar con una celda de Flongle. O con su contraparte doméstica simplificada que contiene un número menor (16 ... 32) de pozos sensores.
Touch Pad Cell FlongleReducir la productividad celular calculada en 4 ... 8 veces (hasta 10 ... 20 Mb) no es crítico para resolver muchos problemas (determinar patógenos, tipificación HLA, establecer paternidad, identificar a una persona, etc.), pero le permite ensamblar un secuenciador de nanoporos usando amplificadores convencionales corrientes picoamperias. Y prescindir del uso de chips especiales de 512 canales, cuyo desarrollo los Oxfordianos han invertido decenas de millones de dólares. Es cierto que cada nanorreactor multicanal debe contener más de una docena de amplificadores de corriente + ADC, pero aún puede costar varias veces menos que la combinación patentada MinION + Flongle (> 200 mil rublos). En cuanto al bajo rendimiento del nanoreader, para los usuarios rusos que no tienen computadoras decentes (médicos, biólogos, biohackers, etc.), incluso puede ser útil.
Kilorider
Los amplificadores de corriente picoamperios de 512 canales desarrollados por los Oxfordianos están contenidos en cada celda desechable para el MinION. Las células de desecho se pueden tirar, pero es mejor usar los chips que contienen para producir análogos de Flongle que se caracterizan por una mayor productividad. Si estos chips están equipados con contactos de superficie, podrán trabajar con celdas de contacto que contengan 2048 (512x4) pocillos sensores.
Diseñar celdas con tales LGA no será fácil, pero debe tener en cuenta que los requisitos de contacto aquí son menos estrictos que los procesadores y las placas base, en los que un mal contacto puede desactivar todo el sistema. Para un secuenciador, la inoperabilidad de incluso la mitad de los contactos celulares puede considerarse aceptable. La mitad restante es suficiente para garantizar un rendimiento en el nivel de 5 ... 10 Gb.
El desarrollo lógico de esta idea será la combinación de varios lectores similares en un solo dispositivo. Esto le permitirá obtener un secuenciador analógico GridION X5, diseñado para trabajar simultáneamente con cinco (o más) celdas reutilizables de producción nacional. Tal secuenciador puede estar en demanda en muchos laboratorios de diagnóstico clínico.
https://store.nanoporetech.com/devicesLas celdas desechables del secuenciador PromethION contienen 9,000 pocillos sensores en chips. Y los chips mismos son amplificadores de 3000 canales de corrientes picoamperias. El flujo de información que entregan con 24 (PromethION 24) o 48 (PromethION 48) celdas de información es tan grande que en forma cruda no se puede transferir a una computadora externa normal. Por lo tanto, los secuenciadores de este tipo deben estar equipados con su propia supercomputadora. Pero si el secuenciador funcionará solo con una celda, entonces se puede conectar a una computadora portátil para juegos normal con un puerto Thunderbolt 3.0.
La alteración de chips libres (expulsados) de ONT para trabajar con células de contacto no es un problema insoluble. Pero los secuenciadores basados en el uso de dichos chips solo pueden funcionar con el software ONT. Y los esfuerzos que deberán invertirse para rehacer estos programas pueden negar los beneficios del uso de chips disponibles en el mercado. Y desarrollar tales chips desde cero es demasiado costoso.
Mega Rider
Este año, comenzarán las pruebas beta del secuenciador nanopore de AXBIO (EE. UU.). Utiliza chips con un millón de canales de amplificación actual producidos en Japón por la compañía israelí Tower Semiconductor Ltd ... Los consumibles y la venta de estos secuenciadores serán manejados por la sucursal china de AXBIO.
En los Estados Unidos y la Unión Europea, más de 7,000 patentes están dedicadas a la secuenciación de nanoporos, lo que crea riesgos financieros impredecibles para las compañías locales que intentan lidiar con tales tecnologías. Aparentemente, esta es la razón principal de una internacionalización tan alta de este desarrollo. Y permite a las compañías y laboratorios rusos participar sin restricciones en las pruebas y mejoras de la tecnología AXBIO, así como en la producción (o recolección) de secuenciadores en su territorio.
Terabytes de datos en bruto obtenidos por un secuenciador de nanoporos con chips de megapíxeles (megalector), es deseable filtrar. Y transfiera a la computadora solo las lecturas más largas y de mayor calidad. Esto no solo mejorará la calidad de la secuenciación, sino que también reducirá los requisitos para la computadora, que también es importante para la producción en masa y el uso generalizado de secuenciadores genómicos. Además, la productividad excesiva de los mega lectores puede reducir la duración de la secuenciación del genoma humano de 2 ... 3 días (para ONT) a varias horas.
Suma de tecnología
El éxito de ONT fue facilitado por la organización de la optimización de tuberías paralelas de los cinco elementos principales de la tecnología de secuenciación de nanoporos: membranas, nanoporos, "motores" (helicasas), condiciones de secuenciación y algoritmos de decodificación para señales leídas.
https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000La vida útil garantizada de las células para la secuenciación de nanoporos depende principalmente de la estabilidad de la membrana lipídica bicapa. Ahora son 6 semanas, aunque generalmente tales membranas se destruyen en unos pocos días. Para aumentar su vida útil, se utilizan aditivos poliméricos hidrófobos, copolímeros de bloque tensioactivos, colesterol, antioxidantes, reticulación de ácidos grasos, etc., y tales modificaciones pueden interferir con la formación de canales iónicos. Por lo tanto, es muy difícil lograr la estabilidad BLM.
Resolver radicalmente este problema permite la formación de membranas en las células de trabajo del secuenciador y la introducción de nanoporos en ellas inmediatamente antes de su uso. La preparación propia de las células para el trabajo proporcionará la oportunidad para su regeneración y reutilización. En cuanto a la vida útil, para las células secas es casi ilimitado, y los reactivos necesarios para su activación y regeneración pueden almacenarse durante meses.
El cuello de botella en la tecnología de secuenciación de nanocables es al mismo tiempo el cuello de botella del nanoporo, del cual depende la calidad de la información leída. Por lo tanto, una de las principales tareas de ONT fue la búsqueda de una proteína de membrana, que permita obtener resultados de calidad aceptable.
La primera de estas proteínas fue CsgG, una proteína de membrana externa que se encuentra en muchas bacterias gramnegativas. Nueve de sus subunidades forman un canal iónico en la membrana con amplios vestíbulos de entrada y salida, y un cuello de botella. Pero fue posible obtener nanoporos de calidad suficientemente alta (R9, R9.4.1, R9.5.1) solo después de enumerar y analizar cientos de variantes de CsgG modificadas. Este verano, las celdas con los poros de la próxima generación (R10 o R10b) deberían aparecer a la venta, con una mayor precisión en la lectura de repeticiones de homopolímeros.
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenaryONT es un componente obligatorio de la tecnología de secuenciación de nanoporos ONT, una helicasa, un motor molecular que desenrolla el ADN bicatenario e inhibe el progreso del ADN monocatenario a través de un nanoporo. La velocidad máxima de desenrollado de ADN por un motor de este tipo ahora alcanza 450 pares de nucleótidos por segundo, aunque la velocidad de los componentes electrónicos MinION le permite aumentar a 1000 nucleótidos por segundo. Teóricamente, acelerar el trabajo de helicasa puede duplicar el rendimiento de MinION, pero en la práctica esto puede conducir a una secuenciación deficiente. Por lo tanto, es poco probable que las helicasas más rápidas y más eficientes mejoren el rendimiento de los secuenciadores de nanoporos como MinION y PromethION.
La calidad de la secuencia depende de muchas condiciones: la magnitud del voltaje aplicado a la membrana, la conductividad eléctrica y la composición iónica de la mezcla de reacción, la cantidad y la naturaleza de las impurezas que obstruyen los poros, la capacidad de limpiar los poros obstruidos al cambiar la polaridad del potencial, la estructura de los adaptadores utilizados, etc., etc. la secuenciación requiere una optimización cuidadosa de todos sus parámetros y composiciones de soluciones de trabajo (condiciones de ejecución), lo que puede afectar negativamente la calidad de la digitalización de secuencias de nucleótidos aristas. Por ejemplo, recientemente se demostró que una disminución en la concentración de ATP escindida por helicasa disminuye gradualmente la precisión de los resultados de secuenciación, y ahora los Oxfordianos están tratando de eliminar este problema al introducir un sistema de regeneración de ATP en la mezcla de reacción.
El quinto elemento de la tecnología de secuenciación de nanoporos es la inteligencia artificial basada en redes neuronales recurrentes (RNN) y en el uso de algunos algoritmos y programas especiales que mejoran el reconocimiento de repeticiones homogéneas (Flip-flop, Medaka). En julio, debería aparecer la próxima versión de los programas Guppi y MinKNOW, en la cual los Oxfordianos prometen agregar la capacidad de determinar bases metiladas (5mC y 6mA). Esto es importante no solo para los estudios epigenómicos, sino también para mejorar el reconocimiento de las bases convencionales.
Los grandes volúmenes de información leída por los secuenciadores de nanoporos y la complejidad de su procesamiento imponen mayores requisitos sobre el hardware de dicho software y sistemas de hardware. Por lo tanto, no todas las computadoras son adecuadas para conectar MinION, la última generación de aceleradores gráficos se instala en GridION y PromethION, y Oxford Nanopore Technologies se convirtió en uno de los primeros compradores de un gran lote de módulos Jetson AGX Xavier (NVIDIA) destinados a dispositivos con inteligencia artificial.
Más recientemente, se consideró que la tecnología de nanoporos no era más que un complemento útil para las tecnologías de fluorescencia y secuenciación de semiconductores más precisas. Pero un aumento gradual en la precisión de la lectura de ADN, combinado con una gran cantidad de secuencias legibles, le permitió, si no adelantarse a todos los competidores, al menos determinar el vector principal de desarrollo de tecnologías de secuenciación genómica.
Puede llevar bastante tiempo dominar todos los elementos de la tecnología de secuenciación de nanoporos, pero este no es el mayor problema. El principal problema es la falta de financiación específica para tales desarrollos integrados en Rusia. Es cierto que el recientemente aprobado Programa Federal Científico y Técnico para el Desarrollo de Tecnologías Genéticas para 2019-2027 (sección "Instrucciones de implementación del programa") dice que a corto plazo (3 ... 6 años) se desarrollará un dispositivo prototipo para la secuenciación genómica de alto rendimiento. Pero encontrar esta línea única en 30 páginas de texto no es tan fácil. Más fácil de negociar con los chinos en la compra de secuenciadores AXBIO.
Aún más simple es encontrar artesanos que puedan ensamblar el nanorider más simple "en la rodilla". Y luego camine con la mano extendida en busca de inversores que acepten financiar el desarrollo de la tecnología nacional de secuenciación de nanoporos.