En California, a la edad de 74 años, murió el Premio Nobel de Química estadounidense Carey Mullis. Según su esposa, la muerte ocurrió el 7 de agosto. La razón es la insuficiencia cardíaca y respiratoria debido a la neumonía.
James Watson, el descubridor de la molécula de ADN, nos contará sobre su contribución a la bioquímica y por lo que recibió el Premio Nobel.
Extracto del libro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis.
ADN La historia de la revolución genética.
Capítulo 7. El genoma humano. Guión de la vida
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada en 1983 por el bioquímico Cary Mullis, que trabajó en Cetus. El descubrimiento de esta reacción fue bastante notable. Más tarde, Mullis recordó: “Una vez, un viernes por la noche en abril de 1983, pareció iluminarme. Estaba conduciendo, rodando por un sinuoso camino de montaña iluminado por la luna hacia el norte de California, al borde de los bosques de secoyas ”. Es impresionante que fue en tal situación que fue visitado por inspiración. Y no es para nada que en el norte de California haya caminos especiales que promuevan el conocimiento; fue solo que su amigo una vez vio a Mullis corriendo imprudentemente por un camino helado de dos vías y esto no lo molestó en absoluto. Un amigo le dijo al New York Times lo siguiente: “Mullis soñó que moriría al estrellarse contra la secoya. Por lo tanto, no tiene miedo de conducir si las secuoyas no crecen a lo largo del camino ”. La presencia de secuoyas a lo largo del camino hizo que Mullis se concentrara y ... aquí está, una idea. Por su invención en 1993, Mullis recibió el Premio Nobel de química y desde entonces se ha vuelto aún más extraño en sus acciones. Por ejemplo, es partidario de la teoría revisionista de que el SIDA no está relacionado con el VIH, lo que socava significativamente su propia reputación y evita los médicos.
La PCR es una reacción bastante simple. Para llevarlo a cabo, necesitamos dos cebadores sintetizados químicamente complementarios a los extremos opuestos de las diferentes cadenas del fragmento de ADN deseado. Los cebadores son secciones cortas de ADN monocatenario, cada una de aproximadamente 20 pares de bases de largo. La peculiaridad de los cebadores es que corresponden a las regiones de ADN que desea amplificar, es decir, la plantilla de ADN.
(Imagen en la que se puede hacer clic) Cary Mullis, inventor de PCRLa especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre la matriz y los cebadores, oligonucleótidos sintéticos cortos. Cada uno de los cebadores es complementario a una de las cadenas de la matriz bicatenaria y limita el comienzo y el final de la región amplificada. De hecho, la "matriz" resultante representa un genoma completo, y nuestro objetivo es aislar fragmentos que nos interesan. Para esto, la plantilla de ADN bicatenario se calienta a 95 ° C durante varios minutos para que las cadenas de ADN se dispersen. Esta etapa se llama desnaturalización, ya que los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN se destruyen. Cuando las cadenas están abiertas, la temperatura disminuye para que los cebadores puedan contactar con la plantilla de cadena única. La ADN polimerasa comienza la replicación del ADN uniéndose a una longitud de una cadena de nucleótidos. La enzima ADN polimerasa replica la cadena de plantilla utilizando un cebador como ejemplo de semilla o copia. Como resultado del primer ciclo, obtenemos duplicación secuencial múltiple de una región de ADN específica. A continuación repetimos este procedimiento. Después de cada ciclo, obtenemos el área objetivo en doble cantidad. Después de veinticinco ciclos de PCR (es decir, en menos de dos horas), tenemos una región de ADN de interés en una cantidad 225 veces mayor que la original (es decir, la amplificamos aproximadamente 34 millones de veces). De hecho, en la entrada obtuvimos una mezcla de cebadores, ADN molde, enzima ADN polimerasa y bases libres A, C, G y T, la cantidad de producto de reacción específico (limitado por cebadores) crece exponencialmente, y el número de copias de ADN "largas" es lineal, por lo tanto Los productos de reacción dominan.
Amplificación de un sitio de ADN deseado: reacción en cadena de la polimerasaAl comienzo de la PCR, el problema principal era el siguiente: después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, la ADN polimerasa tenía que agregarse a la mezcla de reacción, ya que se inactivaba a 95ºC. Por lo tanto, fue necesario volver a agregarlo antes de cada uno de los 25 ciclos. El procedimiento de reacción fue relativamente ineficaz, requirió mucho tiempo y la enzima polimerasa, y el material es muy costoso. Afortunadamente, la Madre Naturaleza vino al rescate. Muchos animales se sienten cómodos a temperaturas muy superiores a 37 ° C. ¿Y por qué la cifra de 37 ° C se volvió importante para nosotros? Esto sucedió porque esta temperatura es óptima para E. coli, de la cual se obtuvo originalmente la enzima polimerasa para PCR. En la naturaleza, hay microorganismos cuyas proteínas se han vuelto más resistentes a las altas temperaturas durante millones de años de selección natural. Se ha propuesto utilizar ADN polimerasas de bacterias termofílicas. Estas enzimas eran termoestables y podían soportar muchos ciclos de reacción. Su uso permitió simplificar y automatizar la PCR. Una de las primeras ADN polimerasas termoestables se aisló de la bacteria Thermus aquaticus que vive en las aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone y se llama Taq polimerasa.
La PCR se convirtió rápidamente en el principal caballo de batalla del proyecto Genoma Humano. En general, el proceso no difiere del desarrollado por Mullis, solo fue automatizado. Ya no dependíamos de la multitud de estudiantes graduados de ojos ciegos que vertían minuciosamente gotas de líquido en tubos de plástico. En los laboratorios modernos que realizan investigación genética molecular, este trabajo se realiza en transportadores robóticos. Los robots de PCR involucrados en un proyecto de secuenciación a gran escala como el Genoma Humano están trabajando incansablemente con grandes volúmenes de polimerasa resistente al calor. Algunos científicos que trabajan en el proyecto del Genoma Humano se indignaron por las contribuciones injustificadamente altas que el titular de la patente de PCR, el gigante industrial y farmacéutico europeo Hoffmann-LaRoche, agrega al costo de los consumibles.
Otra "fuerza impulsora" fue el método de secuenciación del ADN en sí. La base química de este método en ese momento ya no era nueva: el Genoma Humano del Proyecto Interestatal (HGP) adoptó el mismo método ingenioso que desarrolló Fred Senger a mediados de la década de 1970. La innovación estuvo en la escala y el grado de automatización que se logró durante la secuenciación.
La secuencia automática se desarrolló originalmente en el laboratorio de Lee Hood en el Instituto de Tecnología de California. Se graduó de la escuela secundaria en Montana y jugó fútbol americano como delantero; Gracias a Hood, el equipo ha ganado el campeonato estatal más de una vez. Las habilidades de trabajo en equipo fueron útiles para él en su carrera científica. El laboratorio de Hood empleó una variada compañía de químicos, biólogos e ingenieros, y pronto su laboratorio se convirtió en un líder en innovación tecnológica.
De hecho, el método de secuenciación automática fue inventado por Lloyd Smith y Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que luego trabajó en el laboratorio de Hood, recurrió a Lloyd Smith, ofreciéndole un método de secuenciación mejorado en el que las bases de cada tipo se pintarían en su propio color. Tal idea podría cuadruplicar la efectividad del proceso Senger. Sanger, al secuenciar en cada uno de los cuatro tubos (según el número de bases) con la participación de la ADN polimerasa, forma un conjunto único de oligonucleótidos de diferentes longitudes, incluida una secuencia de cebador. A continuación, se añadió formamida a los tubos para separar las cadenas y se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida en cuatro pistas. En la variante Smith y Hunkapiller, los didesoxinucleótidos se marcan con cuatro colorantes diferentes y la PCR se realiza en un tubo. Luego, durante la electroforesis en gel de poliacrilamida, un rayo láser en una ubicación específica del gel excita la actividad de los colorantes, y el detector determina qué nucleótido está migrando actualmente a través del gel. Al principio, Smith era pesimista: temía que el uso de dosis ultra bajas del tinte llevaría al hecho de que las regiones de nucleótidos serían indistinguibles. Sin embargo, al estar bien versado en tecnologías láser, pronto encontró una salida usando tintes especiales de fluorocromo que fluorescen bajo la influencia de la radiación láser.
(Versión completa por clic - 4.08 MB) Letra pequeña: secuencia de ADN decodificada usando un secuenciador automático obtenido de una máquina de secuenciación automática. Cada color tiene una de cuatro bases.En la versión clásica del método Sanger, una de las cadenas del ADN analizado actúa como una matriz para la síntesis de una cadena complementaria por la enzima ADN polimerasa, luego la secuencia de fragmentos de ADN se clasifica por tamaño en un gel. Cada fragmento que se incluye en el ADN durante la síntesis y posteriormente permite la visualización de los productos de reacción se marca con un colorante fluorescente correspondiente a la base terminal (esto se discutió en la página 124); por lo tanto, la fluorescencia de este fragmento será un identificador para una base dada. Entonces solo queda llevar a cabo la detección y visualizar los productos de reacción. Los resultados se analizan usando una computadora y se presentan como una secuencia de picos multicolores correspondientes a cuatro nucleótidos. Además, la información se transmite directamente al sistema de información de la computadora, lo que elimina el proceso de entrada de datos que lleva mucho tiempo ya veces es doloroso, lo que complica enormemente la secuencia.
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PCR