Oisin Biotechnologies es una de las muchas compañías que han aparecido en nuestra comunidad de simpatizantes e investigadores relacionados con la
Fundación Matusalén y la
Fundación de Investigación SENS .
Los representantes de Oisin están trabajando en una plataforma que puede destruir selectivamente las células en función de la expresión de proteínas específicas por parte de estas células. Sus objetivos iniciales son las células senescentes y las células cancerosas. Primero, llevarán la terapia anticancerosa a los ensayos clínicos, ya que los tratamientos exitosos contra el cáncer son más fáciles de regular que muchas otras terapias.
Esto les permitirá reutilizar la tecnología, preparándose para posteriores ensayos de
terapia senolítica , capaces de eliminar muchas células senescentes de diferentes tejidos. En la conferencia
Undoing Aging organizada por SENS Research Foundation y
Forever Healthy Foundation a principios de 2018, el CSO de Oisin Biotechnologies, John Lewis, habla sobre su tecnología y nuevos resultados.
Rendimiento
Buenas tardes a todos! Es muy agradable estar en esta reunión. Agradezco sinceramente a
Aubrey de Gray y
Michael Greve por la invitación. Ni siquiera podría pedir una secuencia mejor, porque el orador anterior hizo un trabajo fantástico al destacar las razones por las cuales las células senescentes son importantes y por qué son un problema. Soy un científico académico en
oncología y un principiante en el campo del envejecimiento, aunque tengo mucha experiencia en matar células, y me gustaría hablar sobre esto ahora: cómo Oisin Biotechnologies desarrolla una terapia muy selectiva para la destrucción de células senescentes y cáncer.
No hablaré mucho sobre qué son las células senenscentes o qué hacen. En pocas palabras, se trata de células que surgen en el cuerpo, como reacción al estrés externo:
el estrés oxidativo , el
estrés genotóxico , y principalmente inhiben el desarrollo del cáncer. También es importante tener en cuenta que a medida que las células se vuelven senescentes, también envían señales que se
propagan en el cuerpo . Repito que no tenemos marcadores universales de células senescentes. Hay características comunes que podemos usar en su reconocimiento.
Por ejemplo, la acumulación de
enzimas activas en
lisosomas . Podemos
teñir la
β-galactosidasa activa. Pero, de hecho, es una población muy heterogénea, y surgen de diferentes maneras. No quiero detenerme en las conexiones, solo enfatizo que el inicio de la
finalización del ciclo celular se rige por varios factores:
p16 ,
p21 ,
p53 . Lo pensamos y preguntamos: ¿cuáles son los caminos comunes a los que podríamos aspirar para crear una terapia dirigida que elimine estas células? No necesito repetir que si bien las células senescentes están involucradas en el proceso de envejecimiento, también hay enfermedades muy específicas que son síntomas del envejecimiento y que pueden tratarse clínicamente con las mismas técnicas.
Fue un punto importante en la última conversación que p16 puede no ser toda la historia. Pero debe mirar los datos que se han estudiado en los últimos años, y realmente me convenció, de que, por supuesto, todas las células senescentes pueden no expresar p16, pero en el modelo de mouse es muy claro que si lo diseña de tal manera que podría destruir selectivamente todas las células que expresan p16, obtendrá cambios fenomenales en el fenotipo. Para mí fue muy impresionante.
Por ejemplo, el trabajo de John van Deyrsen , en el que había ratones genéticamente modificados que expresaban un gen suicida impulsado por el promotor p16, utilizando el llamado sistema INK-ATTAC caspase-9 , que les permite usar un dimerizador que activa la apoptosis en las células que expresan p16. Y estos ratones mostraron cambios fenomenales en su fenotipo. Mejoras significativas en la salud, un aumento del 25% en la esperanza de vida promedio, 50% menos de cáncer, así como cambios funcionales: una disminución en la formación de cataratas , una disminución en la debilidad y una disminución en la pérdida de cabello.
Mostraré, como introducción a mi conferencia, algunos datos que se han publicado recientemente. Me hicieron pensar que valdría la pena como terapia: este es el
trabajo de Peter de Keyser , publicado el año pasado, utilizando los mecanismos p53 y
FOXO4 . Pudo usar un modelo acelerado de envejecimiento, los ratones que pierden cabello se debilitan y demostró que eliminar las células senescentes después de que estos cambios ya ocurrieron puede cambiarlos. Esto para mí realmente confirmó el hecho de que la destrucción de las células senescentes es el camino correcto para el desarrollo.
Por lo tanto, esta es la base de la tecnología Oisin. Como grupo de ingeniería, pensamos que, incluso durante el desarrollo de la terapia que podemos usar en el tratamiento de una enfermedad específica, pensamos en el envejecimiento en general y en cómo se puede usar en el futuro después de verificar clínicamente la efectividad. Por lo tanto, queríamos utilizar una estrategia similar, utilizando modelos animales modernos desarrollados en nuestro tiempo. Queríamos desarrollar algo que tenga un perfil de baja toxicidad que sea bien tolerado, y algo que pueda repetirse cíclicamente. Algo que
no es
inmunogénico y no tiene efectos secundarios. Obviamente, muchos fenotipos de envejecimiento son específicos del tejido, y la capacidad de dirigir la terapia a diferentes tejidos sería una ventaja.
Lo que les voy a decir hoy es la tecnología Oisin que hemos desarrollado. Se llama la plataforma SENSOlytic . Esta es una plataforma de nanopartículas lipídicas (LNP) que contiene un plásmido de ADN no integrable. Está diseñado para ser activado por un dimerizador químico que inicia una respuesta apoptótica muy rápida e irreversible. Quizás la parte más importante de esto es el sistema de administración de fármacos: la capacidad de administrar el ADN plasmídico de forma sistémica a diferentes tejidos sin toxicidad significativa. Oisin ha desarrollado una tecnología multipropósito basada en plásmidos y, a diferencia del ARN de interferencia o ARN mensajero , los plásmidos pueden diseñarse elegantemente para activarse solo cuando se activa una vía específica, como p16, p21 o p53. Pero también pueden diseñarse con potenciadores o represores y atacar tejidos o enfermedades específicas. Hemos creado un sistema y una biblioteca de diseños que están activos en diversas condiciones. Dos de ellos, que les mostraré hoy, son versiones del promotor p16 y p53, incluidos los genes suicidas.
Hemos creado una biblioteca de plásmidos, que son básicamente un promotor selectivo específico asociado con el gen suicida inducido por iCas9, que luego se incorpora o dimeriza usando un dimerizador químico. Muchos de ustedes pueden haber visto esto antes, pero iCas9 es una caspasa modificada, por lo que se ha truncado,
el dominio de inclusión se ha eliminado y reemplazado con el
dominio de dimerización
FKBP . Estas áreas interactúan muy fuertemente con el dimerizador químico AP20187 o su análogo clínico AP1903, que es seguro, como se demostró durante los ensayos clínicos de fase II. Lo que es realmente bueno en este sistema es que solo expresa temporalmente los genes de su plásmido en células con expresión activa de p16 o p53 en nuestro caso. Y no pasa nada hasta que agrega un dimerizer.
El dimerizador de bajo
peso molecular es muy bien tolerado, satura todos los tejidos en pocos minutos y provoca una respuesta apoptótica irreversible. iCas9 se dimeriza en estas condiciones, se auto-corta, activa la formación de
apoptosomas y causa la muerte celular muy rápida en 2 a 3 horas. Las células no pueden resistir esto. No pueden evolucionar o resistirlo.
Algunos de nuestros
estudios in vitro utilizaron la línea celular de
miofibroblastos placentarios IMR-90. En este caso, indujimos senescencia usando 10
grados de irradiación y células
transfectadas usando iCas9. iCas9 es ligeramente menor que caspase-9 y puede detectarse con
anticuerpos contra caspase-9. En las células que no fueron irradiadas, no hubo expresión de iCas9. En los casos en que las células se vuelven senescentes al expresar p16, comienza la inducción iCas9, y cuando agregamos un pequeño dimerizador a estas células, desaparece. El cultivo se elimina muy rápidamente de estas células. Luego, cuando observamos la capacidad de matar estas células, vemos en las pruebas de viabilidad que cada célula que se transfecta con éxito con un plásmido muere. Realizamos otros experimentos. Solo estoy mostrando un ejemplo en el que usamos
citometría de flujo y confirmamos que estamos causando apoptosis en estas células.
Por lo tanto, tenemos un plásmido que es muy selectivo para las células que expresan p16. Podemos matarlos muy rápidamente agregando un dimeriser. La pregunta es cómo convertimos esto en una terapia que funcione en humanos. Necesita un mecanismo de entrega, muy eficiente y seguro. Decidimos usar nanopartículas lipídicas. Las nanopartículas lipídicas se han utilizado durante muchos años, y diría que ha habido muchas promesas e inversiones, y muy pocos éxitos.
Alnylam Pharmaceuticals en Boston recientemente realizó un exitoso ensayo de Fase III con una preparación de ARNm, y el problema es que las nanopartículas lipídicas generalmente se acumulan en el hígado y su mecanismo de suministro de
ácido nucleico a las células usa una carga positiva. Esta es una tecnología muy simple. Crearon lípidos con una carga positiva. Si usa una carga positiva, perforan muy fácilmente los agujeros en las
membranas , y puede depositar material de manera eficiente en las células, excepto que son muy tóxicas. Por lo tanto, tienen una dosis segura muy baja.
En respuesta a esto, varias compañías han desarrollado el llamado
lípido condicionalmente catiónico . Este
lípido , generalmente neutro en el torrente sanguíneo, ingresa a los endosomas y se vuelve
catiónico en un ambiente ácido. Son objeto de programas en curso que pasan por ensayos clínicos de nanopartículas lipídicas. Funcionan, pero siguen siendo muy tóxicos. Un sistema de administración ideal es aquel que puede usar lípidos neutros con un mecanismo alternativo para la administración celular de ácidos nucleicos. Te voy a contar un poco sobre cómo llegamos a él. Si tiene una nanopartícula lipídica y necesita ingresar a la célula, debe pasar a través de la membrana plasmática con toda su protección. Los virus han evolucionado durante millones de años, resolviendo este problema, y han desarrollado muchas
proteínas fusogénicas . Estas proteínas son hermosas, gigantescas y elegantes, y la forma en que conectan las membranas juntas, crean poros y mezclan lípidos es realmente fantástica, pero no puede unirlas a una nanopartícula lipídica, porque son proteínas grandes con centros activos gigantes y alta inmunogenicidad.
Afortunadamente, hay un científico canadiense que ha estudiado estos ortorevirus
fusogénicos toda su vida, y descubrió que no usan la proteína fusogénica para penetrar en las células, pero tan pronto como ingresan en las células, hacen que todas las células a su alrededor se fusionen rápidamente. Pasó su carrera caracterizando esta clase de
proteínas transmembrana relacionadas con la fusión, que son dos órdenes de magnitud más pequeñas que la proteína fusogénica más pequeña expresada por otros virus, pero son suficientes para iniciar la fusión de las células y, lo más importante, las nanopartículas y células lipídicas.
Cuando estas proteínas se incluyen en una plataforma basada en nanopartículas de lípidos neutros, encontrará que los lípidos neutros solos son extremadamente pobres en la entrega de la carga. En nuestro ejemplo, usamos el plásmido
mCherry contra las células cancerosas y, por lo tanto, sin proteínas fusogénicas, no hay entrega en absoluto, y con ellas obtenemos una entrega fantástica. Por lo tanto, aumentan la entrega de una partícula lipídica neutra en 80-350 veces, y son bien tolerados
in vivo . En un experimento con
luciferasa, inyectamos ARNm que expresa luciferasa en la vena de la cola. Obtenemos la expresión de luciferasa en todo el cuerpo. Notamos una acumulación en los pulmones y el hígado, pero obtenemos una buena expresión en muchos tejidos, incluida la piel y los tejidos blandos de todo el cuerpo.
Utilizamos nuestra plataforma para entregar carga útil contra células senescentes. La plataforma se llama
Fusogenix . Utiliza una nanopartícula lipídica neutra, que no es tóxica y es bien tolerada. Y ella usa estas proteínas fusogénicas para ingresar a la célula. No quiero entrar en todas las pequeñas cosas. Nos llevó tres años crear anticuerpos contra estas proteínas, que en realidad no son inmunogénicas. La razón de esto es que la mayoría de ellos son dominios transmembrana. Son
lipofílicos , por lo que acumulan lípidos a su alrededor y no son inmunogénicos. Pasamos mucho tiempo mejorando estas proteínas fusogénicas para mejorarlas. No voy a profundizar en todas las pequeñas cosas, pero ahora tenemos una plataforma para su producción industrial en grandes cantidades y
liofilización , y podemos enviarlas a pedido para su uso.
Permítame mostrarle los datos obtenidos en un experimento, en el que tomaron caspasa-9 p16 activada y la introdujeron en ratones. En este caso, realizamos un experimento con 16 ratones, un grupo de ratones mayores de 80 semanas. Los dividimos en tres grupos, les presentamos el LNP de control, sin un dimerizador, o dos dosis, 5 y 10 mg / kg, y 10 mg / kg, esta es una dosis grande. Tratamos a estos animales una vez por inyección en la vena de la cola. Esperamos 96 horas y luego introdujimos un dimerizador, también por vía intravenosa. Luego esperamos dos días más, recolectamos tejido, sangre, realizamos
RT-PCR sensible y lo controlamos con varios genes. Recibimos una disminución convincente dependiente de la dosis en la expresión de p16 en varios tejidos.
Le voy a mostrar un par de imágenes en las que pasamos mucho tiempo optimizando la tinción de β-gal en ratones. Estas son las mejores imágenes que tenemos, pero en varios tejidos recibimos una disminución dependiente de la dosis en la expresión de β-galactosidasa. Información muy alentadora. Por supuesto, trabajar en el laboratorio es bueno, pero si vamos a traducirlo en personas, hay muchas cosas que deben aclararse. La toxicología es extremadamente importante. Esto es importante para un medicamento que está a punto de realizar cíclicamente para asegurarse de que su cuerpo no forme anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, realizamos muchos estudios sobre dosis repetidas y no registramos ningún anticuerpo, por lo que podemos administrarlo en dosis repetidas sin ninguna disminución en la efectividad. CARPA es algo que aprendí recientemente, una
pseudoalergia activa complementaria , una respuesta inmune que muchos pacientes que reciben terapia de nanopartículas como
doxil pueden tener . Realizamos todos los análisis y tienen un perfil más bajo que doxil, por lo que son muy bien tolerados.
Me complace decir que realizamos varios estudios piloto con primates, les administramos una dosis humana máxima de diez veces, y fue muy bien tolerado. Estos monos en realidad recibieron tratamiento, tanto p53 como p16, por separado y en combinación, y un dimerizador, por lo que contamos con buenos datos. Ahora estamos trabajando en ellos.
La tolerancia de estas partículas es muy importante. Estoy mostrando esta diapositiva porque muestra todos los esfuerzos realizados en los ensayos clínicos de las nanopartículas lipídicas y por qué fallaron. Si nos fijamos en los primeros tres programas, hace diez años eran prometedores con el uso de
liposomas catiónicos y nanopartículas lipídicas. Puede ver que su dosis máxima tolerada es inferior a 1 mg / kg, y todos estos programas han fallado debido a la toxicidad hepática. La segunda generación, los lípidos condicionalmente catiónicos, se transfirieron en mayor o menor medida, y algunos de estos programas tuvieron éxito y darán lugar a la aprobación de medicamentos, pero todos los objetivos son el hígado. Como las nanopartículas lipídicas se acumulan en el hígado, verá una toxicidad limitante de la dosis si no está usando una composición lipídica neutra. Luego puede ver el trabajo utilizando una composición lipídica neutral como la nuestra, y no pudieron encontrar la dosis máxima tolerada en un estudio. Según nuestros estudios de primates no humanos, esperamos que nuestras partículas sean igualmente tolerables.
Actualmente estamos evaluando varios constructos para descubrir cuál se usa mejor en humanos, y obviamente hablamos de esto en esta conferencia: la creación de biomarcadores que son buenos indicadores de ensayos clínicos, así como en modelos animales para evaluar la efectividad. Realmente queremos hablar con cualquier científico que tenga un buen biomarcador. Tenemos grupos de ratones en los que observamos la vida útil y la salud de estos ratones. Estamos pensando en pasar a la fase clínica cuando recibamos el
análisis de toxicidad GMP y
GLP .
Por lo tanto, voy a cambiar al cáncer, porque es nuestro camino principal a la clínica. Mi trabajo principal es estudiar
el cáncer de próstata . Una cosa que realmente me intrigó con la conexión entre el envejecimiento y el cáncer es la activación de la vía p53. El gen p53 es el gen más mutado en el cáncer, y hay muchos tipos de cáncer que tienen una alta carga mutacional en p53. Tomo la próstata porque tiene tasas bajas, en promedio representan el 10%, la mayoría de los cánceres de próstata son de baja movilidad.
Tan pronto como tenga una enfermedad metastásica , esta tasa de mutación es superior al 50%. Por lo tanto, es un buen objetivo en el tratamiento del cáncer. Aunque la proteína p53 en sí misma aún no se ha dirigido a las terapias contra el cáncer, creo que son muy prometedoras. En p53, puede obtener dos tipos de mutaciones. Durante la replicación o mutaciones celulares, activan p53 para reparar el daño o sufrir apoptosis. Por lo tanto, las células mutan o se deshacen de p53 para evitarlo. Como resultado, las rutas de activación reales están muy reguladas. Entonces, ¿se puede usar esta activación para matar las células cancerosas?in vitro , , in vivo , . , . p53, iCas9, . . NOD/SCID . 500 3 . , , . , 90-95% 48 – , , , , .
La prueba real es la capacidad de hacer inyecciones sistémicas, y realizamos estos estudios. Este es solo un ejemplo de cuatro ratones en este grupo. Crecimos estos tumores muy grandes, haciéndolos crecer hasta un tamaño de 500 mm 3 . En este caso, hacemos cuatro inyecciones diarias de LNP en la vena de la cola, y al quinto día les damos una dosis del dimerizador por vía sistémica. Nuevamente, vimos resultados notables: una reducción tumoral del 50-98% en solo dos días. Esto condujo a un aumento significativo en la supervivencia después de una sola inyección en estos animales. En promedio, en seis ratones por grupo, los volúmenes tumorales se reducen en casi un 70%.Una cosa que es muy importante: los tumores primarios no matan a los pacientes en la mayoría de los casos. Esta es una enfermedad metastásica, por lo que estamos muy interesados en saber si podemos curar el cáncer metastásico. Obviamente, tomaremos tales casos en los primeros ensayos clínicos. Por lo tanto, hemos realizado una serie de modelos que estudian la capacidad de LNP para controlar la enfermedad metastásica, en este caso tenemos un modelo de metástasis sistémica de cáncer de próstata y un modelo de melanoma inmunocompetente . En ambos casos, en el modo reutilizable, pudimos controlar eficazmente esta enfermedad.Estamos en el buen camino. Claramente, el objetivo prometedor de Oisin es desarrollar agentes que maten las células senescentes. Pero estoy seguro de que a corto plazo es muy importante, no solo para la tecnología de nanopartículas, sino para toda la plataforma, mostrar su seguridad y eficacia en la clínica. Por lo tanto, ya hemos desarrollado ensayos clínicos de fase I / fase IIb para el tratamiento del cáncer, y ahora nos estamos preparando para probar la toxicología de GLP, lo que facilitará estos estudios. Esperamos un CI por persona a principios de 2019. Nos complace acelerar el uso de esta tecnología. También mencionaré una cosa importante: hay muchos tipos de cáncer en los que puede funcionar. En Canadá, podemos realizar ensayos de fase I con todos los tipos de cáncer, principalmente colorrectal, de próstata, de pulmón y otros. Buscaremos el mayor éxito en el tratamiento y el cáncer más significativo,para poder expandir este grupo y luego completar la fase II.