Los virus resistentes a CRISPR construyen refugios para proteger los genomas de las enzimas que penetran el ADN

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Las bacterias y los virus que los infectan participan en su propia carrera armamentista: tan antigua como la vida misma. La evolución le ha dado a las bacterias un arsenal completo de enzimas inmunes, incluidos los sistemas CRISPR-Cas que pueden destruir el ADN viral. Pero los virus que matan las bacterias (fagos) han desarrollado sus propias herramientas con las que puede superar incluso las defensas bacterianas más formidables.

Científicos de la Universidad de California han descubierto una nueva estrategia maravillosa que utilizan algunos fagos para protegerse contra las enzimas que penetran en su ADN. Después de que las bacterias se infectan, estos fagos crean un refugio impenetrable, una especie de "sala de seguridad" en el cuerpo que protege el ADN del fago vulnerable de las enzimas antivirales. Este compartimento , muy similar al núcleo celular, puede llamarse el escudo CRISPR más efectivo que se haya encontrado en los virus.

En experimentos realizados en el laboratorio del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de California, San Francisco (UCSF), estos fagos no cedieron a ninguno de los sistemas CRISPR. "Esta fue la primera vez que alguien descubrió fagos que demuestran tal nivel de resistencia a CRISPR", dijo Joseph Bondi-Denomi, profesor asociado de UCSF. Describió su descubrimiento en un artículo publicado el 9 de diciembre de 2019 en la revista Nature .

Una búsqueda de ADN que CRISPR no puede penetrar

Joseph Bondi-Denomi dirigió el equipo de investigación que abrió el "refugio" de los fagos

Para encontrar fagos resistentes a CRISPR, los investigadores seleccionaron virus de cinco familias de fagos diferentes y los usaron para infectar bacterias comunes que fueron diseñadas genéticamente para desplegar cuatro enzimas Cas diferentes, el componente penetrante de ADN de los sistemas CRISPR.


La enzima de restricción HsdR (roja), una proteína que normalmente corta el ADN del fago (azul), no puede penetrar el ADN. La membrana similar al núcleo recogida por el fago rodea el ADN del fago, creando una barrera que hace que el genoma del fago sea inaccesible para HsdR y otras enzimas que ingresan al ADN.

Estas bacterias mejoradas con CRISPR salieron victoriosas contra la mayoría de los fagos que encontraron. Pero los dos fagos gigantes (obtuvieron su nombre porque sus genomas eran 5-10 veces más grandes que los genomas de los fagos mejor estudiados) resultaron ser impenetrables para los cuatro sistemas CRISPR.

Los científicos decidieron realizar pruebas adicionales de estos fagos gigantes para explorar los límites de su resistencia a CRISPR. Los expusieron a bacterias equipadas con un tipo completamente diferente de CRISPR, así como a bacterias equipadas con sistemas de restricción-modificación . Es decir, una enzima de escisión de ADN que es más común que CRISPR (los sistemas de restricción se encuentran en aproximadamente el 90 por ciento de las especies bacterianas, mientras que CRISPR está presente en solo aproximadamente el 40%)%, pero solo puede apuntar a un número limitado de secuencias de ADN.

Los resultados fueron los mismos que antes: las placas de Petri estaban llenas de restos destruidos de bacterias infectadas con fagos. Estos fagos eran resistentes a los seis sistemas inmunes bacterianos probados. Ningún otro fago fue capaz de esto.

Los fagos gigantes parecían casi indestructibles. Pero los experimentos in vitro mostraron lo contrario: el ADN de fago gigante era tan vulnerable a las CRISPR y las enzimas de restricción como cualquier otro ADN. La resistencia a CRISPR, que se observó en células infectadas con fagos, debería haber sido el resultado de algo que produjo virus que interfirieron con CRISPR. ¿Pero qué podría ser?


Modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa con fago φKZ. Ilustración: Mendoza et al., 2019.

El anti-CRISPR parecía ser el culpable. Estas proteínas, descubiertas por primera vez por Bondi-Denomi en 2013, eran poderosos inactivadores CRISPR codificados en algunos genomas de fagos. Pero cuando los investigadores analizaron las secuencias del genoma del fago gigante, no vieron rastros de anti-CRISPR. Además, cada anti-CRISPR conocido puede desactivar solo ciertos sistemas CRISPR, mientras que los fagos gigantes eran resistentes a todas las enzimas antivirales secretadas en ellos. Todo lo que protegía el ADN del fago gigante debería haberse basado en algún otro mecanismo.

Escudo impermeable de CRISPR

Los científicos estaban perdidos y construyeron modelos. Alguien en la nube , algunos en papel. Después de una gran cantidad de experimentos, logré entender lo que estaba sucediendo. Cuando los fagos gigantes infectan bacterias, crean un compartimento esférico en el medio de la célula huésped, que inhibe las enzimas antivirales y proporciona un "refugio" para la replicación del genoma viral.

Un descubrimiento similar fue hecho en 2017 por otros dos científicos, Joe Polyano y David Agard. Estos investigadores han demostrado que el genoma del fago se replica en la membrana similar al núcleo. Pero hasta ahora nadie sabía que el proyectil también sirve como un escudo impenetrable contra CRISPR.

Curiosamente, la compartimentación es extremadamente rara en bacterias. En virus, no se supone en principio. Y aún más para que el compartimento fuera tan similar al núcleo eucariota. Sin embargo, vas, ¡este es el pseudo-núcleo!


La bacteria Pseudomonas chlororaphis infectada con el fago 201φ2-1: foto (a) y reconstrucción (b). El pseudo-núcleo es azul, la cápside recolectada de partículas virales es verde, los ribosomas son amarillos.

Sin embargo, muchas preguntas sobre el sobre y los virus que lo crean permanecen sin respuesta, incluida la información básica sobre la proteína de la que está hecho el sobre de la "sala de seguridad". Según Joseph Bondi-Denomi, al secuenciar estos fagos, su equipo logró encontrar una de las proteínas hipotéticas. Pero en algunos fagos estrechamente relacionados, tal proteína no se pudo detectar. Además, aún no está claro cómo se ve la estructura de la proteína a nivel atómico.

Pero la proteína de envoltura del edificio no es el único misterio que Bondi-Denomi y sus colegas tienen que resolver. Mientras observaban las bacterias infectadas con el fago, lograron notar algo más interesante: durante la construcción del "refugio" para el fago (esto toma aproximadamente 30 minutos), su genoma permanece en el lugar donde se introdujo en la célula huésped. Durante este tiempo, el genoma del fago parece ser vulnerable a las enzimas antivirales que flotan alrededor de la célula huésped. Pero de una forma u otra, el genoma permanece sin cambios mientras se construye su "habitación".

Quizás algún tipo de membrana temporal protege el ADN introducido del virus en una etapa temprana. Como una carcasa protectora que se reinicia cuando el arma está lista para la batalla. Eso es solo que los científicos aún no han podido entender qué tipo de protección.



Pero los científicos lograron descubrir que el caparazón no es tan impenetrable como lo mostraron los primeros experimentos. Utilizando un desarrollo complicado, el autor principal del estudio, Senen Mendoza, un estudiante graduado en el laboratorio Bondi-Denomi, encontró una forma de evitar un escudo nucleado al unir una enzima de restricción a una de las proteínas de la envoltura viral. Esta estrategia del caballo de Troya permitió que la enzima ingresara al refugio durante su ensamblaje y destruyera el genoma del fago dentro de la zona libre de inmunidad, gracias a lo cual las bacterias lograron sobrevivir.

Este experimento es especialmente interesante para los investigadores, ya que muestra que, de hecho, hay formas de penetrar el capullo "impermeable" de la protección del genoma del virus. Y dado el hecho de que las bacterias y los fagos siempre encuentran nuevas formas de romper las defensas de los demás, Bondi-Denomi cree que muy pronto los científicos descubrirán que las bacterias ya están armadas con las herramientas necesarias para romper o eludir este método de protección. La guerra continuará.

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