كيفية تسلسل الحمض النووي

تطور تسلسل الحمض النووي في العقود الأخيرة من مجال ضيق ، تم التعامل معه من قبل عدد قليل من العلماء ، إلى واحدة من أسرع التقنيات نموا. إن نمو الإنتاجية وانخفاض التكاليف يتقدمان حتى على قانون مور ، وبسبب المنافسة القوية في السوق والطلب الكبير ، سيستمر التطوير في التقدم بوتيرة عالية. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تطوير التسلسل إلى نفس الطفرة في المعلوماتية الحيوية وعلم الأحياء المتغير جذريًا ، وتغييرًا تدريجيًا أيضًا في الطب.



بواسطة kat ، أقول لك المزيد عن كيفية القيام بذلك.

ما هو DNA
بالنسبة للمبتدئين ، لفهم العملية نفسها ، نظرية قليلة ضرورية.
الحمض النووي هو سلسلة بوليمر تتكون من أربعة أنواع من المونومرات تسمى النيوكليوتيدات ، تسلسلها يشفر معلومات عن الجسم. بمعنى آخر ، يمكن تمثيل الحمض النووي كنص مكتوب بأبجدية من أربعة أحرف. DNA هو جزيء يتكون من سلسلتين ، وعلى الرغم من اختلاف تسلسل النيوكليوتيدات ، يمكن استعادة تسلسل سلسلة واحدة بشكل لا لبس فيه إذا كان تسلسل الآخر معروفًا. لذلك ، تسمى السلاسل التكميلية. (Eng. Complement - تكملة) تُستخدم هذه الخاصية عند نسخ خلية عندما تكون خيوط الحمض النووي غير ملفوفة ، وفي كل منها ، كما في المصفوفة ، يتم تصنيع الثانية ، وتتلقى كل خليتين ابنتين DNA الحمضي المزدوج. يسمى تسلسل الحمض النووي الكامل للكائن الحي الجينوم. على سبيل المثال ، يتكون الجينوم البشري من 46 كروموسوم.

على الرغم من العدد الكبير من الطرق المتنوعة ، التجريبية والقديمة على حد سواء ، فإن الطرق التجارية السائدة متشابهة تمامًا ، ومن أجل عدم إبداء تحفظات في كل مرة ، سأقول على الفور أنها ستكون حول هذه الأساليب السائدة.

كيف تبدو بشكل عام
قبل وصف تقنية التسلسل ، من أجل فهم بديهي ، سأرسم التشابه التالي: يفجرون مجموعة من الصحف المتطابقة بحيث تطير إلى أجزاء صغيرة مع أجزاء من النص ، ثم تتم قراءة كل من هذه القطع ، ومن هذه القراءات ، يتم استعادة النص الصحيفة الأصلية.

لتسلسل الحمض النووي ، يتم عزله أولاً من عينة الاختبار ، ثم يتم تقطيعه إلى شظايا صغيرة عشوائيًا ، وتسمى الشظايا قراءات. يتم ترك سلسلة واحدة من كل قراءة ، ويتم تصنيع الثانية في هذه السلسلة ، كما هو الحال في مصفوفة ، ويتم الكشف عن نوع كل نيوكليوتيد لاحق متصل بطريقة أو بأخرى. وبالتالي ، تسجيل تسلسل النيوكليوتيدات المرتبطة ، استعادة تسلسلها في كل قراءة. ثم يتم إعادة بناء الجينوم من قراءات الكمبيوتر باستخدام برامج الكمبيوتر.

نقطة مهمة. يجب أن يكون الطول الإجمالي للقراءات أكبر بكثير من طول الحمض النووي المدروس. يتم ذلك لأنه عندما يتم استخراج الحمض النووي من العينة ، وعندما يتم قطعه ، يتم فقد جزء منه ، لذلك لا يضمن أحد أن كل قسم من أقسامه سيقع في قراءة واحدة على الأقل. لذلك ، من أجل ضمان قراءة كل قسم ، يتم أخذ الحمض النووي بهامش كبير. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحدث أخطاء أثناء التسلسل ، ولقراءة الحمض النووي بشكل أكثر موثوقية ، يجب قراءة كل قسم منه عدة مرات.


يتم قطع الحمض النووي إلى قراءات تقرأ ، ومنهم يستعيد التسلسل الأصلي

لا يتم استخدام هذه التقنية لحياة جيدة. يضيف العديد من الصعوبات ، وإذا تمكن الباحثون من أخذ وقراءة التسلسل الكامل للجينوم في وقت واحد ، فسيكونون سعداء ، لكن هذا غير ممكن في الوقت الحالي.
هناك سببان لذلك. الأول هو الأخطاء التي تحدث عند قراءة كل نيوكليوتيد. إنها تتراكم تدريجيًا ، وكل نيوكليوتيد لاحق يقرأ بشكل أسوأ من السابق ، وفي مرحلة ما يتم تقليل جودة القراءة لدرجة أنه من غير المجدي مواصلة العملية. بالنسبة لطرق التسلسل المختلفة ، يكون طول القراءة ، الذي يمكنهم قراءته جيدًا ، بترتيب عشرات أو مئات النيوكليوتيدات. والثاني هو أن الحمض النووي جزيء طويل جدًا ، ومع قراءة دقيقة لكل حرف بعد صديق ، فإن التسلسل يستغرق وقتًا غير لائق ، وفي هذه الحالة يتم موازاة هذه العملية بسهولة ، ويمكن قراءة الملايين والمليارات من القراءات في نفس الوقت.



Illumina
يوضح هذا المخطط جميع تقنيات التسلسل الشائعة. وهي تختلف فقط في طرق الكشف عن النوكليوتيدات المرتبطة أثناء التوليف ، وفي طريقة تحضير المادة.

حتى الآن ، يتم استخدام الطريقة الأكثر شيوعًا في متواليات Illumina. في هذه الطريقة ، أولاً ، يتم إرفاق العديد من القراءات المختلفة باللوحة الزجاجية. ثم ، من كل قراءة ، يتم عمل العديد من النسخ على سطح اللوحة بحيث توجد نسخ متطابقة فقط على كل قسم صغير منها. يتم ذلك حتى أثناء التسلسل اللاحق لاستقبال إشارة ليس من جزيء واحد ، ولكن من مجموعة من الجزيئات المتطابقة الموجودة في مكان قريب. لذا فإن الإشارة أسهل للقراءة ، وتزداد موثوقية القراءة. هذه الجزيئات عبارة عن حمض نووي أحادي الجديلة ، ويتم تصنيع سلاسل تكميلية عليها أثناء التسلسل. يتم تنفيذ تفاعل التوليف على النحو التالي: يتم إرفاق نوكليوتيد واحد ببداية كل جزيء. يتم حظر هذا النوكليوتيد كيميائيًاأنه بعد إضافته ، فإن التوليف لا يذهب إلى أبعد من ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إرفاق علامة عليها ، والتي تحت تأثير مصابيح الليزر. علاوة على ذلك ، لكل نوع من النيوكليوتيدات ، يختلف لون التألق. بعد توصيل النيوكليوتيد ، تضيء اللوحة بالليزر وتلتقط الكاميرا الألوان التي تتألق فيها اللوحة. بعد ذلك ، تتم إزالة القفل ، كما تتم إزالة الملصق ، ويتم إرفاق النوكليوتيد التالي بنفس الطريقة. يتم ترجمة تسلسل إشارات الضوء في كل قسم من أجزاء اللوحة في الكمبيوتر إلى سلسلة من النيوكليوتيدات ، وعند الإخراج ، يتم الحصول على ملف يحتوي على تسلسل القراءات.بعد توصيل النيوكليوتيد ، تضيء اللوحة بالليزر وتلتقط الكاميرا الألوان التي تتألق فيها اللوحة. بعد ذلك ، تتم إزالة القفل ، كما تتم إزالة الملصق ، ويتم إرفاق النوكليوتيد التالي بنفس الطريقة. يتم ترجمة تسلسل إشارات الضوء في كل قسم من أجزاء اللوحة في الكمبيوتر إلى سلسلة من النيوكليوتيدات ، وعند الإخراج ، يتم الحصول على ملف يحتوي على تسلسل القراءات.بعد توصيل النيوكليوتيد ، تضيء اللوحة بالليزر وتلتقط الكاميرا الألوان التي تتألق فيها اللوحة. بعد ذلك ، تتم إزالة القفل ، كما تتم إزالة الملصق ، ويتم إرفاق النوكليوتيد التالي بنفس الطريقة. يتم ترجمة تسلسل إشارات الضوء في كل قسم من أجزاء اللوحة في الكمبيوتر إلى سلسلة من النيوكليوتيدات ، وعند الإخراج ، يتم الحصول على ملف يحتوي على تسلسل القراءات.


Illumina
1 — 2 — 3 — , 4 — 5 — 6 — 7 —


إذا لم يتم تسلسل جينومات الكائنات الحية المتقاربة من قبل ، فعندئذ من القراءات ، ثم باستخدام البرامج ، يحاولون تجميع تسلسل واحد من النيوكليوتيدات. تتداخل القصب جزئيًا ، وباستخدام هذه التداخلات ، يحاولون بناء تسلسل واحد. هناك العديد من النقاط التي تعقد المسألة بشكل كبير. على سبيل المثال ، يمكنك تلويث عينة ، وسيحاول البرنامج بناء تسلسل واحد من الحمض النووي لكائنات مختلفة. قد يرتكب جهاز التسلسل خطأ عند قراءة القراءة ، أو يربط المكانين في الجينوم بشكل غير صحيح ، لأنهما متشابهان جدًا. في الواقع ، هناك العديد من الصعوبات التي لن تسرد الجميع هنا. وبعضها صعب للغاية في القضاء عليه حتى الجينوم البشري ، الجينوم الأكثر أهمية والذي تمت دراسته على نطاق واسع ، لا يزال غير متسلسل حتى النهاية.


تقرأ وتحت تسلسل الجينوم ، الذي أعيد بناؤه بناءً عليهما.

عندما يتم تجميع تسلسل الجينوم ، تحتاج إلى فهم ما يعنيه. تم العثور على مناطق تبدو مثل الجينات. يتم ذلك على النحو التالي: في بداية ونهاية الجينات هناك "تسميات" معينة من النيوكليوتيدات ، وإذا كان الحمض النووي يحتوي على مثل هذه التسلسلات على مسافة يمكن للجين أن يتناسب بينها ، يتم إدخال هذا المكان في قائمة الجينات المحتملة. بعد ذلك ، تتم مقارنة هذا مقدم الطلب بقاعدة بيانات للجينات المعروفة بالفعل للكائنات الحية الأخرى ، وإذا تم العثور على جين في ذلك مشابه تمامًا لهذا الموقع ، فإنه يتم تعيين وظيفة هذا الجين.

إذا تم بالفعل تسلسل جينوم كائن حي آخر من هذا النوع ، فسيتم استخدامه للتجميع. نظرًا لأن جينومات الكائنات الحية المختلفة من نفس النوع تختلف اختلافًا طفيفًا فقط ، فكل قراءة تقرأ مكانًا على الجينوم المتسلسل الأقرب إليه ، ويتم تجميع جينوم جديد على أساس هذا الجينوم.

Source: https://habr.com/ru/post/ar385865/