الهندسة الوراثية للبكتيريا: كيفية الحصول على البروتين الذي نحتاجه من البكتيريا

لذلك ، في مقالتين سابقتين عن الهندسة الوراثية للبكتيريا ( مرة ومرتين ) اكتشفنا كيفية جمع الجينات التي نحتاجها ، وفي أي شكل يمكن إدخالها في البكتيريا ، وكيف يمكن إدخالها بالضبط هناك. لنفترض أننا قمنا بكل هذه التلاعبات من أجل صنع مصنع حيوي لإنتاج البروتين. الآن حان الوقت للأعمال الصغيرة - الحصول على البروتين من البكتيريا في أنقى صورها.
هناك العديد من الطرق لحل هذه المشكلة ، معظمها يتعلق بالكروماتوغرافيا. اقرأ كيف تعمل هذه الأساليب تحت القطة.

المرحلة الثابتة "تلتقط" الجزيئات التي تمر بمجموعاتها (-OH).

لذا ، حصلنا على الضغط الذي نحتاجه وزاد من الكتلة الحيوية. الآن نحن بحاجة إلى إزالة البروتين لدينا بطريقة أو بأخرى.

بادئ ذي بدء ، نأخذ ثقافتنا ونصبها في زجاجات الطرد المركزي. البكتيريا هي أشياء كبيرة وثقيلة إلى حد ما ، لذلك ، من أجل التعجيل بها ، لا حاجة إلى قيم الحمل الزائد الوحشي أثناء الطرد المركزي: 10000 جرام سيكون أكثر من كافٍ لمدة 20 دقيقة. ونتيجة لذلك ، نحصل على رواسب في قاع الزجاجات وسائل (يسمى طاف). نسكب السائل ، لأن بروتيننا موجود في البكتيريا الموجودة في الرواسب. يمكنك المضي قدمًا وفقًا للظروف: إما العمل فورًا مع الراسب الذي تم الحصول عليه ، أو تجميده وتخزينه حتى الحاجة إليه. يمكن تخزينه لفترة طويلة جدًا. لا يعتمد الإجراء الإضافي للعمل مع الحمأة على ما إذا قمنا بتخزينه في المجمد أم لا.

لنفترض أن الوقت قد حان للعمل مع الرواسب. ما هي الخطوة التالية؟

بادئ ذي بدء ، نحن بحاجة إلى تدمير الخلايا حتى يتمكن البروتين من الخروج. للقيام بذلك ، استخدم الطرق التالية:

• تجميد تسلسلي ذوبان. ليست الأداة الأكثر فعالية لتدمير غشاء الخلية ، ولكنها آمنة للبروتين ، لذلك غالبًا ما تبدأ بعدة دورات كهذه ، ثم تنتقل إلى طرق أكثر فعالية ؛
  
• علاج الموجات فوق الصوتية (صوتنة). يتم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع ، فهي بسيطة وفعالة. عادة ما يتم توصيل الموجات فوق الصوتية مباشرة إلى حجم الماء باستخدام "مكبر صوت" مطول يتم إدخاله في السائل مع الخلايا بحيث تصل نهاية "مكبر الصوت" إلى القاع تقريبًا. هذه طريقة صعبة للغاية. هناك أيضًا بديل أكثر نعومة - يتم إدخال الموجات فوق الصوتية في الحمام المائي حيث تطفو الأنابيب.
  
  
  
  
  خريج معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا يحذر - شاهد أجهزتك بعناية.
  
  عند إجراء تدمير بالموجات فوق الصوتية للخلايا ، من المهم مراقبة درجة الحرارة: يسخن الماء بسرعة تحت تأثير الموجات فوق الصوتية ، ولا نحتاج إلى إفساد بروتيننا على الإطلاق ، بل وأكثر من ذلك ، لذا لا نرغب في غليه. لذلك ، في الحالة الأولى (مع "عمود ممدود") ، يتم إدخال أنبوب الاختبار مع الخلايا في كوب بالثلج والماء ، ويجب أن يكون هناك الكثير من الجليد. يعمل الماء في هذه الحالة كواجهة حرارية بين الجليد وأنبوب الاختبار المبرد به. في حالة "البديل اللين" ، يضاف الثلج مباشرة إلى الحمام المائي.
  
  
  إظهار المعالجة بالموجات فوق الصوتية "الصعبة". انتبه إلى الضوضاء الرهيبة التي تقف بالقرب من التثبيت ، حيث يتم سماعها بشكل جيد في الساعة 2:06 من هذا الفيديو. يتم حفظ شخص ما قدر الإمكان: يحاول شخص ما الخروج من الغرفة طوال فترة الصوتنة ، ويرتدي شخصًا سماعات خاصة تمتص الضوضاء.
  
  
  إظهار العلاج بالموجات فوق الصوتية "الناعم".
  
• إضافة عوامل lysing إلى الوسط. هذه هي المنظفات بشكل أساسي ، أي "الصابون" (بشكل عام ، كلمة "منظف" باللغة الإنجليزية تعني "منظف"). ترتبط المنظفات بشكل أساسي بالدهون في أغشية الخلايا. بمجرد دخول المنظفات إلى البيئة ، تبدأ المنظفات في الاندماج في الأغشية ، مما يؤدي إلى تدميرها. ونحن نحتاج هذا فقط. في بعض الأحيان يتم أيضًا إضافة الليزوزيم - وهو إنزيم يدمر جدار الخلية البكتيرية.
  
• الصحافة الفرنسية. يتم امتصاص تعليق الخلية من خلال صمام المدخل في أسطوانة العمل ، حيث يتم الضغط عليه بالضغط من خلال فتحة ضيقة. تؤدي القوى العرضية الناتجة عن انخفاض الضغط إلى الضغط الجوي عندما تمر الخلايا من خلال الفجوة إلى تدمير جدار الخلية والغشاء.

من تجربتي الخاصة ، أستطيع أن أقول أن الصوتنة مع المنظفات عادة ما تكون أكثر من كافية.

لذا ، حصلنا على lysate للخلية - "حساء" ، يتكون من البروتين الذي نحتاجه وكمية ضخمة من "القمامة" (الكروموسومات وال DNA البلازميدي ، قطع جدار الخلية ، البروتينات المختلفة ، إلخ). كيف تتخلص من كل هذا؟

السؤال الأول الذي يجب الإجابة عليه هو: "بأي شكل كان بروتيننا موجودًا في الخلية؟" هناك خياران رئيسيان:

• كان البروتين قابلاً للذوبان قبل التحلل ، ومع احتمالية عالية جدًا ، ظل كذلك بعده ، مما يعني أنه لا يمكننا ترسيبه بواسطة الطرد المركزي. ولكن يمكننا تعجيل "القمامة" الكبيرة المتبقية بعد التحلل: وبهذه الطريقة سنتخلص من قطع جدار الخلية ، والحمض النووي الكروموسومي وأجزاء كبيرة أخرى. يتم التخلص من الراسب ، ويتم إرسال المادة الطافية للكروماتوغرافيا ؛
  
• كان البروتين في ظروف السيتوبلازم البكتيرية غير قابل للذوبان وشكل ما يسمى الحفاظ على "الهيئات الدمج" بعد التحلل. الأجسام المتضمنة عبارة عن حبات بروتينية تتشكل إذا لم يكن للبروتين أثناء التوليف الوقت للطي (أي أخذ شكله الطبيعي القابل للذوبان) قبل أن يتصادم مع بروتين آخر غير مطوي مماثل. غالبًا ما تحتوي البروتينات غير المكشوفة على بقع مسعرة تبرز ، والتي تلتصق بعضها ببعض. بعد "تمسك السناجب" ببعضهما ، لم يعد لديهما درجات كافية من الحرية لإكمال طيهما. ثم يسبح إليهم ثالث أو رابع أو خامس .... نتيجة لذلك ، يتم تشكيل حبيبات البروتين. عادة ما يحدث هذا عندما نقوم بتجميع البروتينات حقيقية النواة في البكتيريا (كما كتبت سابقًا ، لا يمكن للبكتيريا طيها). ونتيجة لذلك ، لدينا كتلة بروتين ذات بنية مكانية "ضعيفة". لكن كل سحابة لها بطانة فضية ، لأنه في النهاية يتم تكوين حبيبات ، تتكون بالكامل تقريبًا من البروتين الذي نحتاجه!
  
  بما أن بروتيننا في هذه الحالة غير قابل للذوبان ، فعندما يتم طرده بالطرد المركزي ، فإنه مع "القمامة" يكون في الرواسب. نتخلص من المادة الطافية ، ثم يتم غسل الجثث في الرواسب من كل شيء غير ضروري على النحو التالي:
  
  1. تم سكب عازل الغسيل رقم 1 ، حيث تم حل "مكون القمامة من الرواسب رقم 1" ؛
  2. قلّب الراسب حتى يصبح ناعماً وضعه على شاكر (جهاز يهتز) ؛
  3. تم طرد وطاف طاف. ونتيجة لذلك ، تم فصل ما تم إذابته في منطقة عازلة الغسيل رقم 1 عن الراسب ؛
  4. تم سكب عازل الغسيل رقم 2 ، حيث تم حل "مكون القمامة من الرواسب رقم 2" ؛
  5. حسنا وهلم جرا. عادة ما تكون هناك حاجة إلى حوالي 5 غسالات.
  
  دعني أذكرك مرة أخرى أنه إذا كنا نتعامل مع هيئات الدمج ، فإننا نتعامل مع بروتين غير مكشوف ، مما يعني أنه غير قادر على أداء الوظائف المحددة فيه. لذلك ، قبل التنظيف اللاحق ، يتم تكريره ، أي يتم إحضاره إلى شكل نشط. تتكون طريقة إعادة التشكيل الأكثر شيوعًا من الخطوات التالية:
  
  1. حل الأجسام في ظروف "غير فسيولوجية". عادة ، تذوب الأجسام بشكل جيد عند درجة حموضة عالية (حوالي 12) في وجود اليوريا ثنائية القطب. فكرة هذه الطريقة هي أنه عند درجة الحموضة العالية في الوسط ، هناك عدد قليل جدًا من البروتونات وكل شخص يمكنه التخلص منها بسهولة. البروتون مشحون بشكل إيجابي ، مما يعني أن جميع المتبرعين بالبروتون يتلقون شحنة سالبة ، وبعد ذلك يقوم قانون كولومب بكل شيء - البروتينات ذات الشحنة السالبة الكبيرة تبدأ في صد بعضها البعض ؛
     
  2. قطرة قطرة تضيف الحجم الكامل لـ "محلول البروتين" من الفقرة الأولى إلى حجم أكبر بكثير من المادة العازلة المختلطة النشطة بظروف مريحة للبروتين. فكرة هذه المرحلة هي أنه ، عند تركيز البروتين المنخفض ، من المرجح أن ينثني قبل أن يجتمع مع نظيره غير المكتمل. عادة ، يتم نقل قطرات محلول البروتين في أحجام عازلة تتجاوز حجم المحلول نفسه 10 مرات على الأقل.

لذا ، نحن مستعدون لبعض أحجام حلول البروتين في حالة مطوية. الإجراء الإضافي هو نفسه بالنسبة لأي "شروط أولية" - نقوم بتصفية حلولنا من خلال فلاتر بحجم المسام 100-450 نانومتر (حتى لا تسد الأعمدة اللونية والكروماتوجراف نفسه) ، ثم ننفذ الكروماتوغرافيا.

أنواع اللوني

مبدأ أي كروماتوغرافيا هو أن المكونات المختلفة للحل تتحرك عبر العمود بسرعات مختلفة ، ونتيجة لذلك ، فإن المكونات التي ذهبت "عند مدخل العمود" تخرج في أوقات مختلفة.

ولكن أولاً ، لنتذكر طريقة أخرى - الرحلان الكهربائي للبروتين في الهلام.

تسمح هذه الطريقة بفصل البروتينات وفقًا لكتلها. للقيام بذلك ، يتم إضافة حاجز يحتوي على SDS وصبغة (عادة ما يكون أزرق برومفينول) إلى العينة. في الوقت نفسه ، تكون كثافة العازلة أعلى من كثافة الماء ، ويتم ذلك بحيث يكون من السهل إضافة خليط العينة والعازلة إلى الآبار الموجودة على الهلام. تتم إضافة الصبغة للتحكم في إجراء إدخال العينة في البئر ، كما أنها بمثابة مؤشر على أن الوقت قد حان لإنهاء phoresis: يتحرك الطلاء أسرع من البروتين ، لذلك عندما يصل إلى نهاية الجل ، يتم إيقاف phoresis. هذا مريح للغاية ، لأننا لا نرى حركة البروتين على طول الهلام.


الكهربائي SDS-PAGE. من الأفضل أن تقرأ وتشاهد مرة واحدة من القراءة مائة مرة. يتم تطبيق علامة الوزن الجزيئي على البئر الأول في الطب الشرعي في الفيديو ، ويتم تطبيق العينات المدروسة على الآبار المتبقية.

SDS هو مكون رئيسي: هذا المنظف المشحون بالسالب (الفاعل بالسطح) ينكر البروتينات ، وبعد ذلك "يحيط بها" ، وتبين أن عدد جزيئات SDS الملتصقة بالبروتين يتناسب طرديا مع كتلته. ثم يتبع قانون كولوم أنه في غياب أي مقاومة للحركة ، فإن جميع البروتينات المحاطة بجزيئات SDS لها نفس التسارع في المجال الكهربائي (تنمو القوة بشكل خطي مع زيادة الشحنة ، لكن الكتلة تنمو أيضًا بشكل خطي مع الشحن).


مخطط عمل SDS المنظفات المشحونة السالبة على البروتين. أولاً ، يستنكرها ، ثم "يلفها". ونتيجة لذلك ، يتكون البروتين في قشرة ذات شحنة سالبة تتكون من SDS ، وتتناسب شحنتها مباشرة مع كتلة البروتين.

وهنا يأتي PAAG (PAAG - جل بولي أكريلاميد) لمساعدتنا. أثناء البلمرة ، تشكل شبكة من القنوات ذات القطر نفسه تقريبًا ، والتي من خلالها ، تتحرك ثغرات الأجسام الصغيرة بشكل أسرع من تلك الكبيرة. من الواضح أن البروتين الثقيل أكبر من الضوء ، لذلك تتحرك البروتينات الخفيفة بشكل أسرع.

بعد الانتهاء من إجراء الكهربائي ، يتم تلطيخ الجل. بتعبير أدق ، تلك الأماكن التي يوجد فيها البروتين في الهلام ملطخة - يتم الحصول على خطوط زرقاء (أو سوداء ، اعتمادًا على ما ترسمه). من أجل فهم الكتلة التي تتوافق معها فرقة أو أخرى ، تحتاج إلى مقارنتها بشيء ، لذلك يتم تطبيق ما يسمى بالهلام على كل هلام. "مؤشر الوزن الجزيئي" هو مزيج من المكونات ذات الكتل المعروفة.


مثال على شرائط علامة الوزن الجزيئي. هذه العلامة مريحة أيضًا من حيث أن شريطيها مطليان بلون فردي: أحمر (70 كيلودالتون) وأخضر (10 كيلودالتون). يساعد ذلك المجرب على التنقل في العلامة نفسها. 1 دالتون ، وهي وحدة ذرية من الكتلة ، يتم تعريفها على أنها 1⁄12 من كتلة ذرة الكربون الحر 12- ، وهي في حالة الأرض.

يبدو أن معجزة ، وليس طريقة - لا تتداخل الشرائط ، مما يعني أن البروتينات مقسمة تمامًا! ولكن في الواقع ، لم يتعلم العلماء كيفية إجراء الرحلان الكهربائي للبروتين على نطاق صناعي ، وبالتالي لا نزال نستخدم كروماتوغرافيا العمود.


مخطط تقريبي لأي كروماتوغرافيا. العمود عبارة عن أسطوانة مليئة بشيء. يسمى هذا "الشيء" "المرحلة الثابتة" ، و "المرحلة المتنقلة" هي الحل الذي نحتاج إلى فصل مكوناته. تتحرك المكونات بسرعات مختلفة وبالتالي تخرج العمود بشكل منفصل.

تعتمد معظم تقنيات الكروماتوغرافيا على حقيقة أن السناجب التي تمر عن طريق التمسك بحشو العمود الثابت "بحماس مختلف": أولئك الذين "يتشبثون" كثيرًا ويتحركون بشكل أبطأ بكثير من الجميع ، وأولئك الذين لا "يتشبثون" بأي شيء يغادرون العمود بسرعة. ونتيجة لذلك ، غالبًا ما يترك جزء كبير من الخليط العمود دون "الإمساك" به - حيث يخرجون معًا في بداية الفصل اللوني (يسمى هذا الجزء "الانزلاق" ، لأنهم انزلقوا عبر العمود دون "الإمساك" عليه). ولكن ماذا تفعل مع أولئك الذين "مدمنون"؟

أولاً ، دعنا نكتشف ما يحدث في العمود مع أولئك الذين "يتمسكون". يحدث "الخطاف" نفسه لأنه يوجد شيء على سطح الطور الثابت قادر على "التقاط" بروتين عابر (لبعض الوقت) حول كيفية حدوث ذلك. أي أن البروتين "المتشبث" يقضي بعض الوقت في الحالة المرتبطة بالمرحلة الصلبة ، ثم ينفصل عنها (بسبب حركته الحرارية الخاصة ، التصادمات ، وما إلى ذلك) ، يطفو على ، ويربط مرة أخرى بالمرحلة الصلبة ، ينكسر مرة أخرى وهكذا حتى يترك العمود. من الواضح أنه كلما زاد ارتباطه بالمرحلة الثابتة ، كلما كان تحركه أبطأ على طول العمود.


مبدأ اللوني. ما لا يرتبط بالعمود (الانزلاق) يتحرك بسرعة الطور المتحرك (المعدل للحجم). مكونات الربط لها سرعات مختلفة ، مما يؤدي إلى فصلها عند الإخراج.

بشكل عام ، فقط في حالة وجود الكثير من الحظ السيئ في الخليط ، سيكون هناك مكونات مختلفة تتحرك بنفس السرعة ، لذلك يمكننا الانتظار حتى خروجهم من العمود. ولكن غالبًا ما يكون الأمر مجرد "انتظار" لفترة طويلة جدًا ، حيث تتحرك المكونات ببطء. في هذه الحالة ، يجب أن تكون "مخصصة" ، وتعتمد طريقة "تخصيصها" على نوع العمود.

أخيرًا ، دعونا نفحص الطرق الكروماتوجرافية نفسها ، وهي مناسبة للإنتاج الصناعي للبيض.

1. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. فكرة الطريقة هي أن المرحلة الثابتة لديها شحنة تحت ظروف الكروماتوغرافيا. إذا كانت الشحنة موجبة ، فإنهم يتحدثون عن "كروماتوجرافيا تبادل الأنيون" ، إذا كانت سلبية ، فعندئذ عن "تبادل الكاتيون".
   
   منطق الاسم بسيط ، دعنا نفكر فيه باستخدام مبادل أنيون كمثال: مكونات الشحنة السالبة من الخليط "العصا" إلى المرحلة الصلبة المشحونة إيجابيا من العمود. علاوة على ذلك ، إذا اتبعنا مجموعة محددة ذات شحنة موجبة محددة على سطح الطور الصلب ، فإن عنصرًا أو آخر سلبيًا سوف "يلتصق" به ويخرج. وبالتالي ، يحدث نوع من تبادل الأنيون بين المرحلتين الثابتة والمتنقلة ، ومن هنا جاء اسم "كروماتوغرافيا تبادل الأنيون".
   
   من الواضح ، إذا أردنا استخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، فيجب علينا إجراء فصل الخليط في ظل هذه الظروف التي يتم فيها شحن الطور الصلب بشكل إيجابي. في الوقت نفسه ، لدينا خياران من أجل مزيد من التطوير للأحداث ، اعتمادًا على شحنة البروتين في ظل هذه الظروف: إذا كان "-" ، فإنه "سيجلس" على العمود ، وإذا كان "+" ، فسيكون في زلة.
   
   كيفية تسريع إخراج المكونات ذات الصلة ، أي كيفية تنفيذ "شطف"؟ يمكنك التصرف بطريقتين:
   
   • يمكنك تغيير شحنة المرحلة الثابتة والمكونات المرتبطة بتغيير الرقم الهيدروجيني للمرحلة المتنقلة. من المهم تنفيذ عملية تغيير الرقم الهيدروجيني تدريجياً ، ثم تسرع المكونات من حركتها ، لكنها لن "تسقط" في نفس الوقت دفعة واحدة ؛
     
   • أضف أنيونات أخرى إلى العمود. في الواقع ، يحتوي العمود على عدد محدود من الأماكن التي يمكن أن تلتصق بها الأنيونات وإذا احتلنا كل هذه الأماكن بشيء ما ، فإن مكونات الخليط ستتحرك بشكل أسرع. بالنسبة لكروماتوجرافيا تبادل الأنيون ، فإن إضافة الأنيونات الكلورية نموذجية. يجب أيضًا إدخال الأنيونات المتنافسة تدريجيًا.
   
   بشكل عام ، يكون إجراء كروماتوغرافيا تبادل الكاتيون هو نفسه ، عكس ذلك فقط.
   
   
   
   
   كروماتوغرافيا تبادل الكاتيون مع شطف بسبب تغير درجة الحموضة في الطور المتحرك.
   1 - عند الرقم الهيدروجيني = 2 ، هناك الكثير من البروتونات في الطور المتحرك ؛ وبالتالي ، تم التقاط جميع مكونات الخليط من السائل ، أثناء تلقي شحنة موجبة ؛
   2 - عند الرقم الهيدروجيني = 5 ، انخفض عدد البروتونات في الطور المتحرك ولم يعد المكون "الأرجواني" يعمل كمستقبل ، ولكن كمتبرع بالبروتون ؛ وبالتالي ، عند قيمة الأس الهيدروجيني ، تكون الشحنة سالبة وتترك العمود. لا يزال المكون "الأخضر" يعمل كمستقبل للبروتونات ويحافظ على شحنة موجبة عند قيمة pH معينة ، مما يعني أنه لا يزال متمسكًا بالعمود ؛
   3 - عند الرقم الهيدروجيني = 9 ، هناك عدد قليل جدًا من البروتونات في الطور المتحرك ، ويصبح المكون "الأخضر" أيضًا مانحًا للبروتون ، ويكتسب شحنة سالبة ويترك العمود الأخير.
   
   بشكل عام ، يعتمد اختيار نوع المبادل الأيوني وشروط الفصل على ما نريد عزله وما هو آخر في الخليط.
   
2. طريقة فصل أخرى تعتمد على رهاب الماء (~ عدم القطبية) والرطوبة (~ قطبية) مواد معينة. الفكرة هنا هي نفسها تمامًا كما هو الحال في المبادل الأيوني: وفقًا لخصائصها الفيزيائية ، فإن المكونات "تتسارع" بين الوسائط الكارهة للماء والرطوبة ، وبعضها لا يزال طويلًا ، وبعضها أقل.
   
   بادئ ذي بدء ، أذكرك أن غير القطبية تذوب في غير القطبية ، والقطبية في القطبية. غالبًا ما يكون "مسعور" و "غير قطبي" واحدًا مثل "مسعور" و "قطبي" ، على الرغم من أن الأمر ليس كذلك في الحالة العامة. الإيثانول هو مثال على مذيب غير قطبي ، والماء مثال قطبي.
   
   
   
   
   يشكو الدب القطبي من أنه يذوب في الماء ، وهو مذيب قطبي. هذا لا يهدده دب بني "غير قطبي".
   
   . , (). (). «» , «». , . «» . , . .
   
3. (His-tag). , ( — 20 ) . , , , .
   
   
   
   
   .
   
   , , . 6 , . , , , : .
   
   
   
   
   . , -« » His- . -« » .
   
   «» . , — His- ( , ). , .
   
   
   
   
   .
   1 — «» ; 2 — ; 3 4 — ; — ; 5-10 — . . , , «». . .
   
   , . , , . : , ( 75 100 , ), . , .
   
   His- - . , ( « < 1»), , . .
   
4. -. , : , - , , .
   
   « » , . - : , , . , - - , ( , ), . : - 1-2% . , , , 10 400 : , . - .
   
   
   
   
   -: , .
   
   - ? , , . , , , . - , .
   
   
   
   
   -. . , . — . .
   
   -, . , , , . - — , .

حسنا إذن. لذلك قمنا بعزل بروتيننا والآن يمكن استخدامه للدراسات الهيكلية أو الوظيفية ، ككاشف في مختبر علمي أو للتحليلات البيئية ، للأغراض الطبية أو في الصناعة.