مرحباً بالجميع ، اسمي ألكسندر سوكولوف ، وأود أن أخبركم كيف صنعت جهاز تسلسل في المنزل - جهاز لفك شفرة DNA. يبلغ سعر السوق لمثل هذا الجهاز حوالي 10 مليون روبل.
رحلة قصيرة إلى علم الوراثة. إذا تذكرت فجأة ، في عام 2003 ، تم إصدار بيان مثير: فك العلماء في النهاية فك رموز الجينوم البشري. تم بناء الجينوم من الحمض النووي ، والحمض النووي هو رمز المصدر للجسم. DNA هو سلسلة مزدوجة تتكون من 4 أنواع من النيوكليوتيدات ، والتي تتكرر في الجينوم البشري حوالي 3 مليار مرة. مثلما يتم تشفير جميع المعلومات الموجودة على جهاز الكمبيوتر الخاص بك في أجزاء ، يتم تشفير تعليمات تجميع جميع بروتينات جسم الإنسان في النيوكليوتيدات. بمعنى ، بمعرفة تسلسل النيوكليوتيدات الموجودة في الحمض النووي ، يمكننا نظريًا جمع كل البروتينات الضرورية والحصول على نموذج بشري. لذلك ، بالمعنى القياسي ، لم يقم العلماء بفك شفرة الحمض النووي ، ولكن ببساطة ترجموا التسلسل الكيميائي إلى مجموعة من الأصفار والأخرى على الكمبيوتر. الخطوة التالية هي محادثة منفصلة. على سبيل المثال ، نحن واضحون في الوقت الحالي حول وظيفة 5٪ فقط من مجموعة الجينوم بأكملها (هذا هو تشفير البروتين). ما يفعله 95 ٪ المتبقيين ، يمكن للمرء فقط التكهن.
في عام 2003 ، كانت تكلفة تسلسل الحمض النووي البشري حوالي 100 مليون دولار. مع مرور الوقت ، انخفض هذا الرقم ويقترب الآن من ألف دولار. أنت تدفع ، يتم تسلسل الحمض النووي الخاص بك ويعطيك محرك أقراص ثابتة يحتوي على 3 غيغابايت من المعلومات - الجينوم الخاص بك في شكل رقمي.
هناك ثلاثة متسلسلين رئيسيين في السوق اليوم. الأكثر إنتاجية ، Hiseq ، وجهاز استقبال NovaSeq ، يوفر أرخص تسلسل (فلوري). يستمر أحد إطلاقه عدة أيام ، وخلال هذا الوقت تتم معالجة جينومات عدة أشخاص في وقت واحد. ومع ذلك ، يكلف الإطلاق نفسه حوالي عشرة آلاف دولار. بالمناسبة ، يكلف الجهاز نفسه حوالي مليون دولار ، ولأنه أصبح عفا عليه الزمن في حوالي 3 سنوات ، لكي يؤتي ثماره ، يجب أن يجلب لك 1000 دولار في اليوم.
ظهر الجهاز الثاني في السوق في الصيف الماضي فقط. يطلق عليه Nanopore ويستند إلى تقنية مثيرة للاهتمام للغاية عندما يتم تسلسل الحمض النووي عن طريق المرور عبر nanopore. يتم وضع أرخص متغير Nanopore كمسلسل منزلي يمكن التخلص منه ويكلف 1000 دولار.
الجهاز الثالث هو PGM ، وهو جهاز تسلسل أشباه الموصلات يكلف 50000 دولار في وطنه وحوالي 10 ملايين روبل (مع التسليم والتخليص الجمركي وما إلى ذلك) في روسيا. تستغرق عملية التسلسل حوالي عدة ساعات.
حسنًا ، لم يكن لدي عشرة ملايين ، لكني أردت PGM. كان علي أن أفعل ذلك بنفسي. أولاً ، بإيجاز عن كيفية حدوث تسلسل أشباه الموصلات. تنقسم سلسلة الحمض النووي بالكامل إلى شظايا طولها 300-400 نيوكليوتيدات ، تسمى القراءات. ثم يتم إرفاق القراءات بمجالات صغيرة ويتم نسخها عدة مرات - ونتيجة لذلك ، يتم تعليق مجموعة كاملة من أجزاء الحمض النووي المتطابقة على كل مجال. النسخ ضروري لتضخيم الإشارة من كل قراءة معينة. تسمى مجموعة مناطق مختلفة مكتبة DNA.
قلب PGM هو شريحة لمرة واحدة - مصفوفة تشبه المصفوفة في الكاميرا ، ولكن بدلاً من البكسلات التي تستجيب للضوء ، إليك ترانزستورات الأس الهيدروجيني التي تستجيب للتغيرات في توازن الحمض القاعدي. يتم تحميل مكتبة الحمض النووي الناتجة على شريحة تحتوي على 10 ملايين بئر ؛ في الجزء السفلي من كل منها يوجد ترانزستور الأس الهيدروجيني. مجال واحد فقط يتناسب مع الحفرة ، وبالتالي يقرأ من نوع واحد فقط (مع تسلسل محدد من النيوكليوتيدات). ثم يتم تغذية الكواشف إلى الشريحة بحيث يبدأ الحمض النووي في نسخ نفسه. ويتم نسخها خطياً ، أي أن النيوكليوتيدات مرتبطة بالسلسلة التي تم إنشاؤها حديثًا بالترتيب الذي تقف فيه في السلسلة الأم. لذلك ، يتم تغذية نوع واحد من النيوكليوتيدات إلى الرقاقة - ويتم تسجيل تغير درجة الحموضة في بعض الآبار على الفور (وهذا يعني أن النوكليوتيد تم إرفاقها). ثم يتم تغذية نوع مختلف من النيوكليوتيدات وتسجيل درجة الحموضة في الآبار ، وما إلى ذلك ، وبالتالي ، من خلال تطبيق جميع أنواع النيوكليوتيدات الأربعة على الشريحة عدة مرات ، يمكننا الحصول على معلومات حول تسلسل النيوكليوتيدات في كل قراءة. ثم ، من خلال الطرق الرياضية ، يتم تجميع الأجزاء القصيرة المقروءة على جهاز كمبيوتر في سلسلة واحدة. لجمعها بشكل أكثر أو أقل ثقة ، يجب قراءة كل قراءة حوالي 100 مرة.
الشكل 1. تسلسل أشباه الموصلاتالآن دعونا نكتشف ما يتكون الجهاز نفسه. هناك ، كما نعلم بالفعل ، رقاقة ، بالإضافة إلى نظام إمداد كاشف ولوحة أم. يتم تنفيذ جميع التسلسل بدقة على الشريحة - فباقي الجهاز ينقل إشارات معينة إليه فقط ، ويقدم الكواشف ، ويقرأ الإشارات التناظرية منه ، ويحولها إلى أرقام رقمية ويدفع تدفق المعلومات المستلمة إلى الكمبيوتر ، حيث يتم تجميع البيانات ومعالجتها.
التين. 2. جهاز التسلسليتم وضع الشريحة كمرة واحدة ويتم التخلص منها بعد الاستخدام. وفقًا لذلك ، حيث تعمل PGM ، يمكن الحصول على هذه الرقائق مجانًا بأي كمية. لماذا تحصل عليهم ، تسأل؟ الحقيقة هي أنني تمكنت بالفعل من استخدام الشريحة بشكل متكرر. في الواقع ، إنه أبدي: اشطفه جيدًا بما فيه الكفاية - ويمكن استخدامه مرارًا وتكرارًا. في الدقة ، لن يختلف عن الجديد. كانت فكرتي أن أصنع جهازًا لرقائق البرامج المجانية هذه.
لذا ، واجهت مهمة الهندسة العكسية للرقاقة. بالطبع ، لا يمكن العثور على وثائق للدائرة الصغيرة المرغوبة - لم تكن الشركة المصنعة تشارك أسرار الإنتاج ، لكنها أرادت بيع أجهزتهم بهدوء مقابل 50000 دولار. للبدء ، فعلت أكثر وضوحا وبساطة: رنّت جهات الاتصال مع أحد المختبرين. أصبح من الواضح أين توجد I / O الرقمية والتناظرية ، والطاقة ، وأكثر من ذلك. تم الحصول على بعض المعلومات من براءات الاختراع على الشريحة. لكن كل هذا ، بالطبع ، لم يكن كافياً لإنشاء منتج كامل. ما زلت أتعامل مع الشريحة ، وتحققت من تخميناتي المختلفة ، وجربت إعطاء الإشارات ، ولكن في الأساس لم تتقدم في أي مكان. اضطررت لإيقاف المشروع مؤقتًا.
التين. 3. رقاقةثم فجأة على Habrahabr ،
صادفت مقالة كتبها المدون الشهير
BarsMonster حول كيفية إجراء هندسة عكسية للرقائق! تم إلهامه ، وكتب له ، وكتب لعشاق آخرين ، وأرسل طلبًا إلى كييف ، حيث كان يعمل في تصوير الرقائق. أجابوا من كييف أنهم لا يعرفون كيفية التلميع في طبقات ، يمكنهم فقط تصوير الطبقة العليا ، وبما أن الشريحة الخاصة بي متعددة الطبقات ، فلن يكون واضحًا إلى أين تذهب المسارات من جهات الاتصال. ثم التقى بأمريكي منخرط أيضًا في الهندسة العكسية للرقائق ، وأرسل له دوائره الدقيقة ، ولكن حتى هنا ، لم يتجاوز تصوير الطبقة العليا. ثم قرأت مقالًا على الإنترنت حول أولئك الذين تمكنوا من عكس شريحة Sony PlayStation ، وما إلى ذلك ("المجد للأبطال!" وهذا كل شيء ، إذا كان أي شخص يعرف ذلك). قررت أن أكتب لهم أسئلة ، ووجدت ألقابهم - ثم أدركت أن أحدهم كان مألوفًا لي. في الآونة الأخيرة ، أحضرني صديق إلى صديق "منخرط أيضًا في علم الوراثة على مستوى الهواة" ، وتحدثنا مع هذا الصديق على Skype وانتهينا من هذا الحوار. والآن أفهم أن صديقي الجديد هو سيد رائع في رقائق الهندسة العكسية. لقد كتبت له هناك. ومع ذلك ، اتضح أنه على الرغم من استعداده للمساعدة ، إلا أنه لم يكن لديه مجهر. طريق مسدود مرة أخرى.
بعد بضعة أشهر ، تم العثور على المجهر الضروري في مختبر قريب! صحيح أن الكاميرا المدمجة فيه كانت فظيعة ، لقد التقطت صوراً على هاتف محمول من خلال العدسة واستلمت صوراً من هذه النوعية:
التين. 4. الشريحة تحت المجهرثم ، في السنة الجديدة الأخيرة ، ظهر مجهر ممتاز لـ 130 ألفًا في عملي (أنا متخصص في التشفير الكمي). الأحلام تتحقق. أخيرًا ، تمكنت عادةً من تصوير الشريحة من الأعلى.
التين. 5. مجهر عمليثم بعد ذلك ... كان لا يزال علي إتقان تقنية تلميعها بنفسي. صعوبة التلميع هي إزالة طبقات من المعدن بسماكة 1 ميكرون - في حين أن عرض الشريحة 1 سنتيمتر. للمقارنة ، سأقول أن الأمر يشبه تقريبًا السماح بخطأ لا يزيد عن 10 سم لكل كيلومتر. لقد حاولت جاهدًا جدًا. يتم عرض نتائج عملي في الصورة التالية:
التين. 6. الهندسة العكسية تحت المجهر الضوئيالطبقة السليكونية السفلية ، والطبقة العلوية التي تحتوي على ترانزستورات ، والطبقات الأولى والثانية والثالثة والرابعة من المعدن مرئية بوضوح.
تتكون الشريحة من مناطق متكررة (مثل سجلات التحول) ، ومن هذه الصور كان من السهل جدًا تحليلها: أصبح من الواضح على الفور ما يحدث على طبقات مختلفة. قمت "بعكس" الأقسام الأكثر "محشوة" مع وفرة من المنطق ، والتي تكررت عدة مرات. لكن أصعب شيء كان تتبع المسارات التي تسير على طول الشريحة بالكامل ، لفهم ما يشير إليه الاتصال الخارجي إلى ماذا. منذ عطلة رأس السنة الجديدة حتى نهاية فبراير ، كنت أسلح بميكروسكوب جميل جديد ، فكرت في هذه المهمة - جلست في العمل حتى العاشرة ليلاً ، "معكوس" ، على ما أعتقد. ثم حدثت معجزة جديدة: تمكن صديق من تنظيم تصوير مجاني للرقاقة في طبقات على مجهر إلكتروني في MIREA. فتات "Photosession" في الربع الأول سم كان 50 غيغابايت من الصور بالأبيض والأسود.
الآن يجب دمج كل هذه الصور الفردية بطريقة أو بأخرى في صورة واحدة كاملة. في نفس اليوم تقريبًا ، كتبت برنامجًا على python أنشأ ملف HTML - عندما فتحته في متصفح ، حصلت على ما أحتاجه. (بالمناسبة ، أقدم 10 أوبرا فعلها بشكل أفضل ، أوصي به!) ثم كتبت برنامجًا آخر على جافا سكريبت يسمح لك بمقارنة الطبقات ، والانتقال بسلاسة بينها ، ومحاذاةها ، وتحديد المقياس ، وما إلى ذلك. أخيرًا ، في يدي كانت هناك جميع الأدوات لحل المشاكل الرئيسية. لقد تتبعت المسارات التي اخترقت الشريحة ، وأعادت هيكلها بالكامل إلى الترانزستور الأخير.
صورة أخرى لشريحة رقاقة تم التقاطها تحت أشعة سينية (في MIREA):
التين. 7. المجهر الإلكترونيالآبار مرئية حيث تقع المجالات ذات القراءات. فيما يلي ثلاث طبقات من المعدن ، وحتى أقل - طبقة تحتوي على ترانزستورات.
كانت المرحلة التالية في النضال من أجل مستقبل أكثر إشراقًا هي إنشاء لوحة أم للشريحة. صممه وأرسل أمر إنتاج. في هذه الأثناء ، استخدمت المحكمة والقضية لوحة Mars Rover-2 مع FPGA للعمل مع الرقاقة. (FPGA ، تقريبًا ، مجموعة من 10000 عنصر منطق عالمي ؛ من خلال برمجة FPGA ، يمكننا الحصول على أي منطق يمكن بسهولة معالجة تدفقات المعلومات غيغابت.) لقد كتبت البرنامج الثابت لـ FPGA بنفسي ، بالإضافة إلى ذلك ، كتبت برنامجًا للتحكم الديناميكي في النظام الذي يحدد التكوين الكامل لـ FPGA. ثم عاد استراحة لمدة نصف عام (عاد في رحلة عمل إلى بحيرة بايكال ، أعد مصنعًا في المختبر ، تم عرضه على بوتين). لكن في النهاية اجتمعت النجوم: كان لدي وقت ، ووصلت الألواح الجاهزة - وقمت بتجميع نظامي.
التين. 8. إنشاء "حديد"أعطى كل الإشارات اللازمة و - معجزة! - رأيت إشارة من الرقاقة على مرسمة الذبذبات. (لقد اشتريت مرة واحدة مرسمة ذبذبات لـ 6000 روبل على eBay ، 1000 أخرى تستحق البرامج الثابتة لها.) البقع مرئية بوضوح في الصورة - قطرات من بعض الكاشف.
التين. 9. إشارة من رقاقة على الذبذباتالآن أنا بحاجة لمعرفة كيفية رقمنة هذه الصورة ونقلها إلى جهاز كمبيوتر. جمعت هذا الإعداد:
الشكل 10. دائرة الأجهزة
التين. 11. تركيب جاهزيوجد كمبيوتر يوفر بيانات التحكم إلى اللوحة باستخدام FPGA. يولد المجلس إشارات رقمية ويرسلها إلى الرقاقة. تنتقل الإشارة الواردة من الشريحة إلى مكبر الصوت ، ثم إلى ADC على اللوحة ، يتم ترقيمها وإرسالها عبر منفذ COM إلى الكمبيوتر. بشكل عام ، عرض النطاق الترددي لمنفذ COM صغير: 15 كيلو بت في الثانية (حيث يوجد من مليون إلى 10 مليون "بكسل" في شريحة واحدة ، وأقصى سرعة إرسال 115200 باود). ومع ذلك ، فإن الصورة تصل في النهاية إلى الكمبيوتر.
التين. 12. الإشارة المعالجة على الحاسب الآلى.تظهر الصورة أعلاه أنه عندما يتم توفير مكتبة DNA للشريحة المستخدمة ، يتم تعبئة الشريحة بشكل غير متساوٍ: إلى الحواف - إلى حد أقل. ترجع ألوان مختلفة إلى جهد مختلف عبر ترانزستورات الأس الهيدروجيني. أي أنه يمكننا التمييز بوضوح بين تلك الثقوب حيث تصطدم الكرات بالقراءات - في وقت لاحق سيساعدنا ذلك في التحكم في تدفق الشريحة.
وبناءً على ذلك ، كانت المهمة التالية هي مسح الشريحة. كان من الضروري التأكد من أنه أصبح جديدًا. لحسن الحظ ، كان لدي شريحة جديدة تمامًا كعينة مرجعية. في الشكل. ويمكن ملاحظة أنه في المنطقة النشطة ، تكون هذه الشريحة تقريبًا من نفس اللون (خطوط التكرار الرأسية هي مجرد ضوضاء ، تداخل).
التين. 13. مسح رقاقةفي الشكل. 13 B الرقائق غير مغسولة جيدًا - فهي متعددة الألوان. في الشكل 13 ، D عبارة عن رقاقة مستخدمة ولكنها مغسولة جيدًا. يُلاحظ أن التدرج على طول الحواف قد اختفى. ومع ذلك ، سيكون من المفيد إثبات أنها نظيفة حقًا ويمكن إعادة استخدامها.
نظرًا لأن مكتبات DNA مرتبطة بطبقة التنتالوم للرقاقة في وسط حمضي ومنفصلة في القلوية (أي عند درجة حموضة عالية) ، يتم غسل الشريحة باستخدام ماصات شبه آلية خاصة مع حلول ذات درجة حموضة مختلفة. حتى الآن ، تمكنت من تحقيق تنظيف كامل للرقائق.
كنت مهتمًا بالسبب ، عندما فهمت تمامًا هيكل الشريحة ، لم أطلب تصنيعها ، لكنني فضلت الاستمرار في البحث والحصول على تلك المستخدمة ، والتلاعب بغسلها ، وما إلى ذلك. نعم ، لأن تطوير الدائرة المصغرة يكلف الكثير من المال ، وملايين الدولارات ، وجزء كبير من هذا المبلغ يذهب إلى التصحيح المادي للمنتج الناتج: المناسب ، وضبط جميع معلمات الترانزستورات ، وما إلى ذلك ، أي ببساطة نسخ الدائرة المنطقية لا يكفي. لذلك ، فأنا أحمل الدائرة المصغرة الجاهزة المشروطة - الجاهزة ، المصممة ، المصححة - وبالتالي توفير أموال كبيرة ، ورخص المشروع بجدية.
كانت مهمتي التالية هي تجميع جهاز أكثر تقدمًا ، والذي سيسمح بنقل أسرع للمعلومات إلى جهاز كمبيوتر وفي نفس الوقت لن يتكون من عدد كبير من اللوحات المنفصلة.
التين .14 تطوير الإصدار التالي من الجهازأخذت لوحة أم جديدة مع FPGA - على نفس الشريحة كان هناك 2 نوى ARM مع Linux ، كان هناك Gigabit Ethernet و "الأشياء الجيدة" الأخرى ، ولكن على عكس الإصدار السابق ، لم يكن هناك ADC. في وقت لاحق قام بتصميم لوحة أخرى ، مع ADC عالية السرعة وجميع العناصر الضرورية الأخرى. أطلقت - عملت كل شيء.
ما الذي يجب القيام به لمظهر الجهاز النهائي؟ ثلاثة أشياء فقط.
الأول. تحتاج الإنترنت جيجابت ، ونقل البيانات بسرعة إلى جهاز كمبيوتر. أدركت هذا بالأمس فقط.
الثاني. نظام توريد كاشف. يجري بالفعل تصميم صمام خاص.
الثالث. برنامج لمعالجة المعلومات من الشريحة. لا يزال لدي أسئلة مع البرنامج ، لذلك أدعو المبرمجين للتعاون.
الجهاز النهائي يكلف 10 مليون روبل. تكلفة التسلسل عدة آلاف من الدولارات. تكلفة الرقائق من 100 دولار إلى 1000 دولار - اعتمادًا على عدد وحدات البكسل فيها. (بالمناسبة ، يمكن أن تكون استعادة الرقائق في حد ذاتها دخلاً جيدًا ، خاصة بالنظر إلى أنه يلزم فقط بضع نقرات للتدفق). يتم أيضًا شراء الكواشف ، ولكن سيتم إنشاؤها في المستقبل.
بشكل عام ، كل هذا مثير للاهتمام للغاية ، ولكن الشيء الرئيسي هو المستقبل. اليوم ، تحتل التكنولوجيا الحيوية نفس المكان في التقدم العلمي والتكنولوجي العالمي مثل تكنولوجيا الكمبيوتر في الثمانينيات. القرن الماضي. علاوة على ذلك ، يعد التسلسل أحد المجالات الرئيسية لعلم الأحياء والطب الحديث. وبطبيعة الحال ، فإن التكنولوجيا الحيوية مربحة للغاية.
في الآونة الأخيرة ، ظهر متسلسل أشباه الموصلات S5 في السوق ، وفي المستقبل القريب أخطط للتبديل إليه.
يسعدني أن أتحدث مع كل من يريد المشاركة بطريقة أو بأخرى في تطوير هذا المشروع!
لم يكن المشروع ممكناً لولا التدريب النظري
لفلاديمير زوبوف . أعبر عن امتناني له.
شكرا لكم على اهتمامكم!