بشكل عام ، تسلقنا الفلبين وبحثنا عن البكتيريا الماكرة. ثم ذهبنا إلى أيسلندا مع الكيميائيين ، وتحدثوا عن حملات علماء الأحياء إلى الجبال للبكتيريا المحبة للحرارة (الذين يعيشون بالقرب من الينابيع الساخنة) - واتضح أن هذه القصة بأكملها كانت ضرورية لتفاعل سلسلة البوليميراز. أصبح من المثير للاهتمام بالنسبة لي ما علاقة المختبر باختبارات الدم بمصدر الطاقة الحرارية الأرضية ، والآن سأخبرك بهذه القصة المثيرة.
وهذا يعني أنه بالأمس في فلاديفوستوك ، افتتحت Rospotrebnadzor وجامعة الشرق الأقصى الفيدرالية مركزًا للتدريب على PCR. قدت السيارة مع الصحفيين ووجدت علماء مجانين عاديين شرحوا كل شيء على الأصابع. لأن هذا هو بالضبط ما سيفعلونه هناك - لتعليم الفيتنامية والصينية. بشكل أساسي - تعلم التعامل مع التهديدات الحيوية.
إذن ما هو PCR؟
هذه قصة حول كيفية صنع عدة ملايين من نفس الشيء بالضبط من جزيء DNA واحد.
في الأساس ، هذا رد فعل من ثلاث خطوات: فصل الجينات الوراثية إلى حلزونات منفصلة ، ثم البحث عن بداية ونهاية المواقع المرغوبة ، ثم إكمال الجزيئات المصنفة بمساعدة البلمرة لإكمالها. أي أنها محاكاة لمضاعفة الحمض النووي في أجسامنا ، فقط في المختبر. وبسرعة بالغة.
أي أننا نقطع كل الحمض النووي إلى نصفين ، ونجد فقط أنصاف العامل الممرض ، ونضع علامة عليها ، ثم يتكون البوليميراز إلى أزواج مميزة. نكرر. نكرر.
يضاعف التفاعل الحديث كمية الحمض النووي في القارورة كل 40 ثانية. بتعبير أدق ، تكون كفاءة الدورة أقل قليلاً - من 78٪ إلى 99٪ ، لأنه ليس كل شيء وليس مرتبطًا دائمًا في العالم الحقيقي.
لماذا هذا مطلوب؟
إذا كان أي ممرض يطفو في دمك ، يمكنك بناء رد فعل خاص به ، والذي سيؤدي إلى تضخيم (زيادة الكمية) الحمض النووي. في مرحلة ما ، سيكون هناك الكثير منهم في الشراب الذي يمكنك ملاحظته. وهنا سوف يصرخ الروبوت: "نعم ، لقد فهمت الأمر!" ، وستكون النتيجة "إيجابية".
كبداية ، نحتاج فقط إلى 50 جزيء لكل مليلتر في الحالة العامة. للمقارنة ، لا يوجد فيروس الإنفلونزا في الدم ، ولكن في لعاب المريض مع الأعراض الأولى - حوالي 10 آلاف قطعة لكل مليلتر.
لماذا لا يزال هذا مطلوبًا؟
يمكنك شراء زوجين من الحمض النووي حرفيا من مومياء الفرعون أو جلد الماموث أو النمر وتسلسلها مع الجينوم. أي أنه من الممكن حقًا التفكير في الأمر تمامًا ، لأنه من خلال كمية لا تذكر من المواد للبحث ستحصل على الكثير من جزيئات الحمض النووي. ومن هنا التطبيق في علم الطب الشرعي - يمكنك تحديد أي من الملوك المتوفين كان له ابن. أو عن طريق جزيئات اللعاب في مسرح الجريمة للعثور على الجاني (مباشرة Gattaka). أو حتى أكثر برودة - يمكنك تكرار الجزيئات بالتغيرات ، وتحصل على طفرات محكومة. لكن هذا الأخير صعب.
و PCR هو نفس رد الفعل الذي يغير السلوك الاجتماعي للمجتمع. لأنه بمساعدته يتم تحديد الأبوة - يمكنك تحديد أقسام مختلفة فقط من الحمض النووي وتقييم أين وما هو مختلف (وكم) ، أي ابحث عن الأقارب المقربين. حسنا ، أو مجرد تسلسل وتقييم الاختلافات.
ولكن بعد ذلك نتحدث عن تشخيص الالتهابات الفيروسية والبكتيرية - وهذا هو الاستخدام الأكثر انتشارًا. وهنا يعلمونه في فلاديفوستوك.
كيف PCR بشكل عام؟
نأخذ مواد مثل الدم أو أي شيء آخر. نقوم بإعداد الدواء بعناية (عادة ما يتم أخذ 1/3 المادة ، بحيث في حالة حدوث أخطاء في التحليل ، تبقى جرعتان أخريان في الأرشيف حتى نهاية الدراسة). يتم خلط الدواء بنظام اختبار. في قارورة مغلقة نضع هذا "الحساء" في جهاز لتنفيذ رد الفعل.
بعد ذلك ، تبدأ دورات تفكيك الحمض النووي ، وتعلق البادئات به ومحاذاة الجزيئات الكاملة باستخدام البلمرة. تشير طرق PCR الحديثة في الوقت الفعلي إلى أن الملصقات المطلوبة تتراكم وتتوهج. هذا أمر رائع لأنه ليس عليك فتح الأنبوب للتفاعل مع عزل تسلسلات الحمض النووي المطلوبة. عندما يمكن تسجيل التوهج ، يتم اتخاذ قرار بأن السلالات المطلوبة في المواد.
تسمح لك بضع دورات أخرى بتقييم درجة تغير الإشارة وافتراض عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في المادة في البداية ، أي بدقة كافية لتحديد تركيز العامل الممرض.
كيف يعرف التمهيدي ما يتمسكون به؟
التمهيدي هو القرف الذي يلتصق بما يطابق كود النوكليوتيدات. إذا كنت بحاجة إلى فيروس داء الكلب ، فأنت بحاجة إلى تسلسله مع جينوم (بتعبير أدق ، نحن مهتمون ببداية ونهاية الحمض النووي) وتسجيل الأماكن على جانبي الجزيء حيث تكون سلاسل النوكليوتيدات فريدة. واصنع لهم بادئات لهم. تلتصق البادئات بأنصاف الحمض النووي ، وسيبدأ البوليميراز في العمل من الأعلى.
ثم لا شيء يتشبث بالحمض النووي لخلايا الدم ، فقط لداء الكلب.
التمسك بداء الكلب سوف يتمسك فقط بداء الكلب. لتشخيص بقرتك لداء الكلب والأنفلونزا ، ستحتاج إلى جرعتين من الدم ورد فعلين مختلفين.
الآن الجزء الممتع. لسنا بحاجة إلى بداية ونهاية جزيء DNA للتشخيص. نحن بحاجة فقط إلى الكثير من المواقع المعروفة. أي ، على الجينوم الكامل ، على سبيل المثال ، إنفلونزا الطيور ، يجب تمييز جزأين فريدين - بداية النسخ ونهاية النسخ. بحيث يوجد بينهما شيء يمكن تعريفه بشكل لا لبس فيه بأنه إنفلونزا الطيور دون محفزات سلبية كاذبة وإيجابية.
علاوة على ذلك ، تلعب الرياضيات دورًا مهمًا - من الضروري التمييز بين الأماكن الفريدة للجينوم ، بحيث تكون قصيرة جدًا ، ومن المثالي أن تكون من 15 إلى 30 نيوكليوتيدات. وذلك بينهما هو الشيء الصحيح. يعطي كتابان أساسيان شيئًا مثل التجزئة من جزيء DNA ، أي أنهما يسمحان بوصفه في 30-60 نيوكليوتيدات.
في هذه الحد الأدنى من المواقع الكافية للاعتراف و يتم إرفاق الاشعال. إذا تمسكون بشيء آخر - فقد كان هدفًا سيئًا ، وانخفضت الدقة.
إذن ما علاقة الينابيع الساخنة بها؟
والحقيقة هي أن التفاعل يحدث في درجة حرارة عالية ، وإلا فإن الحمض النووي لا ينكر. عادة ما ينهار البلمرة عند درجة الحرارة هذه. عادة - لأن البكتيريا المحبة للحرارة هي التي تقلقها بهدوء. لذلك ، كانت هناك حملات استكشافية إلى كامتشاتكا في القرن الماضي ، حيث كان الجيولوجيون يبحثون عن وسائل للطب الجزيئي ، ويطلقون الدببة. وفي أوروبا توجهوا إلى أيسلندا.
الشيء المضحك هو أنه في عام 1976 وفي عام 1980 كانت هناك منشورات حول البوليميراز (لنا والأمريكي) ، ولكن بدا للجميع كحقيقة مضحكة ، ولم يجدوا تطبيقًا عمليًا.
الان. اتضح أن Taq polymerase من Thremus aquaticus يعمل وفقًا لبروتوكول مثل UDP ، أي بدون تصحيح الخطأ. بشكل عام. يجمع ما يحدث - ويذهب إلى هناك بمفردك. لكن بسرعة.
تم عزل Pfu و Pwo polymerases من الأثريات - فهي تعمل مع تصحيح الخطأ ، أي أنها لا تعطي طفرات في عملية النسخ المتماثل (حسنًا ، لا تفعل ذلك تقريبًا) ، ولكنها تعمل بشكل أبطأ بكثير.
في السابق ، كانت مخزون هذا العطش يتم استخراجه مباشرة من المصادر ، والآن يتم تربية البوليميراز في المختبرات. وهم يصنعون خليطًا صعبًا من Pfu و Pwo و Taq - اتضح البرق بسرعة وبشكل صحيح نسبيًا.
كيف تبدو في العالم الحقيقي
في العالم الحقيقي ، لديك صندوق من أنظمة الاختبار مع النقش المثير للاهتمام "الزهري" ، على سبيل المثال. أو الأنفلونزا. داخل نظام اختبار واحد - جميع مكونات PCR ، باستثناء مصفوفة DNA ، أي دم المريض. أو قطعة أخرى حيث يتم البحث عن العامل الممرض.
بعد ذلك ، تحتاج إلى مزج الدم ونظام الاختبار ، والحرارة والتبريد عدة مرات تحت الضغط ، وسوف يقوم المحفز ، والبادئات ، والبوليميرز والمكونات الإضافية بكل شيء بأنفسهم. الناتج هو أنبوب اختبار مع 10 في جزيء DNA الثاني عشر لكل ملليلتر.
هل يمكن القيام به في المطبخ؟
نظريا. الجهاز نفسه بسيط للغاية ، وجميع التقنيات العالية في نظام الاختبار - وقليل من البرامج التي تسجل التغيير في إشارة الضوء للملصق. لا تزال بحاجة إلى دقة في درجة الحرارة من 0.1 درجة وبرامج لتغييرها. بالإضافة إلى مستشعر ضوئي. أي أن الحديد ليس معقدًا للغاية. لذلك ، هناك الكثير من هذه المختبرات - فهي رخيصة جدًا للنشر.
لكن في المطبخ ، لن ينجح ذلك ، لأن أسوأ قصة هي تلوث العينة (التلوث). بروتوكولات النقاء هي ما يتم تدريسه أكثر من ردود الفعل نفسها. إذا انكسر أحد الأنابيب الناتجة مع وجود DNA ممرض في المختبر ، فسيتم تغطية كل شيء بطبقة متساوية من النتائج الإيجابية الكاذبة. أي أن جميع التحليلات الحالية - على الفور من الغابة ، ثم تنظيف طويل ، والتحقق ، ثم استرجاع الدم المؤرشف ومرة أخرى إطلاق الخط.
حسنًا ، أذكركم بأن الحمض النووي للممرض والممرض نفسه شيئان مختلفان ، مثل شفرة المصدر والشفرة المترجمة. وخطر كسر أنبوب اختبار مع 10 في الحمض النووي الثاني عشر لممرض السل يماثل تقريبًا تشتت حزمة من أوراق الكود المصدري لإطلاق رأس نووي على الأرض.
4-7٪ من النتائج قد تكون إيجابية كاذبة بسبب العمل الغامض وميزات العالم الحقيقي. لذلك ، يتم إجراء تحقق شامل من موثوقية النتيجة ، على وجه الخصوص ، باستخدام الأساليب الرياضية.
جنبا إلى جنب مع مواد PCR التقليدية ، يتعرض أنبوب اختبار بالماء. إذا بدأ شيء ما بالتضخم هناك ، فسيتمزق الفني من يديه على اللوزتين.
هذه ليست آمنة ، إنها بوابة لنقل المواد إلى المختبر. يتم نقل الموظفين إلى المختبر في منطقة نظيفة بعد الاستحمام ، وتغيير الملابس واثنين من إجراءات الكرامة الإنسانية المهينة.كيف يمكنك فهم أن هناك خطأ ما في رد الفعل؟
حسب طبيعة تطوره. يبدأ رد الفعل المعتاد ببطء ، ثم مرحلة النمو الأسي ، ثم في منطقة الدورات الأخيرة - الخروج إلى الهضبة. لا تزداد كمية الحمض النووي مع الدورات الجديدة لعشرات الأسباب من استنفاد التمهيدي إلى إكمال أحد الموارد ، يتراكم البيروفوسفات. بالإضافة إلى ذلك ، أنصاف من الحمض النووي التي لم تتفاعل قبل السباحة في الحساء وتتسلق لبعضها البعض عناق. نتيجة لذلك ، يمكنك تحديد القطع الأثرية والمسار غير النمطي للتفاعل - وهذا يجعل بالفعل برنامجًا لاستخراج البيانات الصغيرة. محلي ، مجاني ، يتم تحديثه بانتظام ، ولكن ليس مفتوح المصدر.
ولماذا تحتاج إلى زيادة كمية الحمض النووي في الدواء ، إذا كان كل ما تحتاجه هو تحسين طرق الكشف؟
هناك مثل مسار التنمية. يجري تحسين الطرق الفيزيائية الكيميائية ، لكنها ليست كافية حتى الآن. أحدث تجربة - أخذوا بلازما الدم بالطرد المركزي ، وسقطت الفيروسات "الثقيلة" إلى قاع الأنبوب. ثم تم قليها بمطياف الكتلة بالليزر. نيفيغا. يعمل مع مستعمرات البكتيريا (لقد كانوا يفعلون ذلك في مختبرات موسكو منذ فترة طويلة بالفعل) ، لكنه لا يعمل مع الفيروسات. ولا تزال المستعمرة بحاجة إلى النمو. لذلك ، حتى الآن (وعلى ما يبدو ، السنوات العشر القادمة) ، سيكون PCR أسرع شيء للتحليل.
بالمناسبة ، يتم إجراء تحليل كامل في حوالي 45 دقيقة (مع إعداد المادة) ، أي نصف يوم من
cito أو 4 أيام إذا كان المختبر في المدينة وأنت في القرية.
بالنسبة لبعض الأمراض المعدية ، يكون تركيز الفيروس منخفضًا للغاية. على سبيل المثال ، كانت هناك حالة من التهاب الدماغ - رأى الطبيب الأعراض البؤرية (تلف الجهاز العصبي المركزي) ، أخذ الدم - حتى PCR لا يزال لا يظهر أي شيء ، والأجسام المضادة منتشرة بالفعل. وهذا يعني أن PCR سيعطي نتيجة في وقت لاحق عن تحليل الأجسام المضادة ، و مطياف الكتلة - حتى في وقت لاحق ، لا يزال الأمر أقل دقة من PCR.
أي أنه يتم تضخيم جينوم واحد فقط؟
في الحالة المعتادة ، نعم. تم العثور على أكثر سلالة من المرض تقدمًا وذات صلة بالمنطقة ، وتستهدف البادئات حمضها النووي. لكن هذا موقف طوباوي قليلاً ، لأنه في نفس الوقت تحتاج إلى البحث عن ست قطع من سلالات مختلفة في وقت واحد. للقيام بذلك ، تتم إضافة البادئات المختلفة إلى المجموعة ، بالإضافة إلى إجراء عدد من التغييرات. بطبيعة الحال ، فإن نظام الاختبار أكثر تكلفة. أو تحتاج إلى القيام بالعديد من ردود الفعل لمسببات الأمراض المختلفة.
هل يمكنني مضاعفة الحمض النووي الريبي؟
نعم ، تحتاج فقط إلى إخراج الحمض النووي منه. رد الفعل أكثر تعقيدًا ، ولكنه مثير للاهتمام لأنه يسمح لك بفصل الخلايا الميتة عن الخلايا الحية. الحمض النووي قوي بشكل لا يصدق ، لذلك يمكن أن يتم تقشيره من الماموث. إذا كان الفيروس قد قُتل بالفعل ، فإن الحمض النووي لعيناته الميتة سوف "يتوهج" لمدة 3 أسابيع أخرى. وسوف ينهار RNA بشكل أسرع. لذلك ، تكون طرق NASBA (البحث عن فيروسات RNA ، على سبيل المثال) أكثر دقة في بعض الحالات. لكن أكثر تكلفة بكثير.
زوجان من الأشياء أجمل
إن التاريخ الكامل لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بعد اختراع النظرية هو مشاكل فيزيائية وكيميائية صعبة بشكل مباشر. على سبيل المثال ، يمكن تضخيم أقسام غير معروفة من الحمض النووي. للقيام بذلك ، يتم قطع الجزيء في منطقة معروفة ، ثم يتم لصق القصاصات معًا. ينقلب بعضها لتكوين جزيئات برمز معروف في البداية والنهاية. التشبث التمهيدي - وعلى تلك التي توجد فيها بداية ونهاية ، وليس علامة واحدة فقط ، يتم تنفيذ التضخيم.
قصة مضحكة للغاية مع كيفية تجنب خطوات رد الفعل غير الضرورية عند تسخين الأنبوب. والحقيقة هي أن الجزء الأول من التفاعل يستمر عند درجة حرارة عالية ، ولكن بينما يسخن أنبوب الاختبار ، يمكنك البدء عن طريق الخطأ من الإيقاع الخاطئ - وهذا سيزيد بشكل حاد من الضوضاء واحتمال الخطأ. لذلك ، فإن الخيارات مع حقيقة أن أحد كواشف النظام يتم وضعها في كبسولة شمعية (لا تذوب إلا بعد المرور عبر النقطة المطلوبة وتحرر المكون في الوقت المناسب) إلى الخيار عند إضافة مادة إلى المحلول الذي يمنع التفاعل ، ولكن ينهار عند درجة حرارة عالية.
هناك حماية ضد التلوث - يمكن تصنيف الجزيئات على التضخيم بطريقة معينة ، ثم في بداية التفاعل ، قم بتدمير جميع تلك المسماة على هذا النحو. أي أنه إذا زحف شيء من أنبوب إلى أنبوب آخر ، فسيمتلئ تلقائيًا بردود الفعل الرئيسية.
الفلورة باردة أيضًا: يتم وضع مادة في الكواشف ، والتي يتم تدميرها نتيجة للتفاعلات مع الحمض النووي. أي أنه كلما تم تكوين الحمض النووي ، كلما تم كسر جزيئات أكثر من هذه المادة. كله لا يلمع ، ولكن يبدأ في القطع. وكلما تفاعلت جزيئات الحمض النووي أثناء التكاثر ، زاد توهج الأنبوب.
نظرًا لتزايد تعقيد أنظمة الاختبار ، فإن الاختراق بالحلول والحلول الأنيقة هو البحر.
لماذا مراكز التدريب PCR في الجامعات؟
لأن هذه لا تزال القصة الرئيسية حول تشخيص الأمراض ، وليس بالضرورة في الناس. هنا ، في الشرق الأقصى ، على سبيل المثال ، قد يكون التركيز على الفيروسات النباتية. هناك فيروس ثنائي في صناديق الوطن الأم مع توابل الأرز (بشكل أدق ، فيروسان متطابقان بشكل جيد) يمكن أن يأخذ ويضع المحصول بأكمله في جميع أنحاء آسيا للتوزيع. بطبيعة الحال ، هذا الشيء ليس لنا فقط - ولن يتم إطلاقه بالضرورة بشكل ضار ، يمكن أن يتطور وفقًا للبلاهة أو ببساطة في موقد طبيعي. مثل التهاب الدماغ الياباني في Primorye ، تنشأ بؤر موسمية من البعوض باستمرار هنا. والوفيات منه 60 في المئة.
لدى العدو المزعوم أيضًا فيروسات في الحيوانات والبشر.
لذا ، يمثل المتخصصون في PCR السلامة الحيوية للبلاد. إنهم يراقبون العدوى ، ويقبضون على جميع الركاب على متن الطائرة ، حيث يسعل بعض الناس ، وما إلى ذلك. طار مايكل ، على سبيل المثال ، على إيبولا ، على كل من أنفلونزا الطيور وأكثر من ذلك بكثير. قام بتسلسل الجينوم الكامل للنسخة الحية الوحيدة من فيروس داء الكلب في العالم.
ميخائيل ششيلكانوف ، أستاذ ، FEFU ، رئيس مركز الأبحاث الفيدرالي للفيروسات للتنوع البيولوجي ، فرع الشرق الأقصىمع الدب بشكل عام قصة رائعة. رفع الدب 5 كلاب ثم هاجم الجدة. لقد أدار رئتها وسحب فروة الرأس ، بالإضافة إلى سحق في كل مكان ومغطى بالدم. قرر الصيادون عن الوحش أنه كان نوعًا من الدب الخطأ. وأعطوا رفاته للعلماء لإجراء التجارب.
هنا مزيد من التفاصيل.
ميخائيل هو أيضًا من محبي فقمة الفراء ، لأنه يحب الجزر بالمخابز. ينقلون الفيروسات والطفيليات بسرعة كبيرة لجميع السكان. وجدوا في القطط في الخياشيم قملة باردة لا تحتوي على بكتيريا أقل برودة. عندما يغوص الختم ، يغلق أنفه. القمل في الداخل يشعر بالدفء والسحر.
بالإضافة إلى السلامة الحيوية ، القصة الثانية هي تدريب المتخصصين الأجانب. هناك شيئان مهمان: أولاً ، يدرسون على أنظمة الاختبار الخاصة بنا (ومن ثم سيكونون أكثر احتمالًا لشرائها) ، وهذا مهم للتصدير - نحن رواد في رابطة الدول المستقلة (حوالي 25 مليون تفاعل سنويًا) ، ولكن ليس في العالم . ثانيًا ، يسمح توحيد الخبرة بالمراقبة نفسها من خلال البروتوكولات الشائعة ، أي تغيير قواعد البيانات والخبرة. القواعد ، بالطبع ، أكثر أهمية. وهذا يعني استجابة أكثر اتساقًا للأوبئة المحتملة.
في فلاديفوستوك ، لم يتزامن الافتتاح الرسمي مع الافتتاحي - مجموعة من الأطباء الفيتناميين ينهون دروسهم الأخيرة. اثنان يعرفان الروسية ، والباقي يتعلمون من خلالها. هناك دورة لغة إنجليزية بالكامل. يعمل نفس المركز في نوفوسيبيرسك للأطباء والأطباء الروس من دول رابطة الدول المستقلة ، وقد تخرج المتخصصون هناك لمدة عام الآن.نحن نقوم أيضًا بكل شيء من أجل أنظمة الاختبار الخاصة بنا في روسيا ، وفي علم الأحياء الجزيئي العملي هي بعض من أقوى الأنظمة في العالم (من الناحية النظرية ، لا ، لكننا ننفذ كل شيء بسرعة وتقنية). لذلك ، سيساعد التعليم في توسيع هذا السوق بالنسبة لنا. في المجموع ، تم تدريب 3881 متخصصًا في هذه المراكز (مجموعات صغيرة ، لأن هناك الكثير من الممارسات) ، والآن المهمة هي الذهاب على نطاق واسع لتدريب المتخصصين الأجانب.
وهذا ما يسمى بالكامل بمركز التدريب الدولي في Rospotrebnadzor في كلية الطب الحيوي بجامعة الشرق الأقصى الفيدرالية. تم فتحه في الواقع من قبل ميخائيل ششيلكانوف مع الصورة أعلاه و German Shipulin (FBUN CRI من Rospotrebnadzor في موسكو). البراهين في وسائل الإعلام ستكون غدا ، على ما يبدو. حسنًا ، لست خبيرًا في علم الأحياء الدقيقة ، لذا إذا ارتكبت خطأً في مكان ما أعلاه ، من فضلك ، من فضلك.
UPD: إليك الأخبار عن
RG ، التي لا تزال لديها وجهة نظر حول هذه القصة.