قبل قراءة هذه الترقية ، يُنصح بالتعرف على الكود المصدري المنشور مسبقًا .جهاز التسلسل المسامي الأول والأكثر شهرة من Minion (الحد الأدنى المحدد في المملكة المتحدة هو 1000 دولار ، في روسيا - 150 ألف روبل) ، التي طورتها شركة Oxford Nanopore Technologies (ONT) ، ويعمل على خلايا يمكن التخلص منها ، تبلغ تكلفة كل منها 900 دولار (في روسيا - 135 ألف روبل). تسمح لك هذه الخلايا برقمنة DNA 10 ... 20 Gb في 2 ... 3 أيام. يعد هذا أقل مما يجب لتسلسل الجينوم البشري (تحتاج إلى> 100 جيجا بايت) ، ولكنه كثير جدًا لجميع الأغراض التشخيصية السريرية الأخرى (<1 جيجا بايت كافية).
بدأت مؤخرًا في بيع طرازات أكثر إنتاجية (وأكثر تكلفة) - PromethION 24/48 (165،000 دولار / 285،000 دولار) ، يهدف بشكل أساسي إلى التسلسل الكامل للجينوم. الأغلى ثمنا هي المواد الاستهلاكية الأكثر كفاءة (2000 دولار لكل وحدة ،> 100 جيجابايت). صحيح ، أنها يمكن أن تكون أرخص بكميات كبيرة (1،800،000 دولار لـ 2880 جهاز كمبيوتر شخصى. ، 625 دولار لكل جهاز كمبيوتر شخصى.) ، ولكن مثل هذه الاستحواذات (200 ... 250 مليون روبل لكل دفعة) غير مسموح بها للميزانية الروسية.
وليس فقط للروسية. لذلك ، تم جذب انتباه زوار مؤتمر ONT الأخير (22-24 مايو) من خلال الإعلان عن بدء مبيعات Flongle ، وهو مهايئ لمحول التسلسل MinION ، والذي يسمح بالعمل مع خلايا يمكن التخلص منها أقل كفاءة (~ 1 غيغابايت) ، ولكن رخيصة الثمن (90 دولارًا) يمكن التخلص منها.
https://nanoporetech.com/productsيمكن أن يتسبب ظهور Flongle في نمو هائل في استخدام NGS (تسلسل الجيل التالي) في الممارسة السريرية وإزاحة تشخيصات PCR التقليدية ، التي يتجاوز حجم سوقها في روسيا مليار روبل ، ويتم قياسها في العالم بمليارات الدولارات. لكن بالنسبة لمعظم المرضى الروس ، ستظل تشخيصات NGS رفاهية غير مقبولة ، لأن تكلفة خلايا Flongle في السوق المحلية ستكون أكثر من 10 آلاف روبل. وإذا أضفنا إليها تكلفة الكواشف القابلة للاستهلاك وتكاليف النقل والنفقات العامة ، فإن التكلفة المقدرة لتسلسل عينة واحدة من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي (RNA) لن تقل عن 20 ألف روبل.
هذا يعني الحاجة إلى تطوير متسلسلات nanopore المحلية وتزويدهم بالمواد الاستهلاكية الرخيصة والكواشف.
Nanorider
تخفيض كبير في تكلفة تسلسل nanopore هو ممكن من خلال إعادة استخدام الخلايا ل Flongle واستبدال استيراد الكواشف اللازمة للعمل معهم. لكن عليك أولاً الحصول على جهاز اختبار يسمح لك بمراقبة تكوين أغشية الدهون ثنائية الطبقة (BLM) في 126 بئر من خلية العمل ، وتقييم كمية وجودة نانوبوريس المدمجة في هذه الأغشية. مثل هذا الجهاز ("Nanorider"؟) يجب أن يتتبع التغييرات في التوصيل الكهربائي (و / أو المعاوقة) للثقوب الفردية أثناء تكوين BLMs عليها ، وتسجيل التيارات picoamperous التي تتدفق عبر قنوات أيون واحدة.
من الممكن تكوين قارئ متصل بالكمبيوتر عبر USB 2.0 من العناصر القياسية: FPGA (100 ... 200 دولار) ، ومكبرات الصوت الحالية (MAX9923FEUB - 200 ... 300 روبل) ، ADC (1 ... 2 ألف روبل) ، وما إلى ذلك ... من الضروري التطوير فقط لوحة مع لوحة اتصال غير قياسية (10x13) اكتب LGA (Land Grid Array) للالتحام مع خلية من Flongle. أو مع نظيره المحلي المبسط الذي يحتوي على عدد أصغر (16 ... 32) من آبار الاستشعار.
لوحة اللمس خلية Flongleإن تقليل إنتاجية التصميم للخلايا بمقدار 4 ... 8 مرات (حتى 10 ... 20 ميجابايت) ليس حاسمًا في حل العديد من المشكلات (تحديد مسببات الأمراض ، كتابة HLA ، إنشاء الأبوة ، تحديد الهوية ، وما إلى ذلك) ، ولكنه يسمح لك بجمع متسلسل nanopore على مضخمات الصوت التقليدية التيارات picoampere. ويمكنك الاستغناء عن استخدام رقائق 512 قناة خاصة ، والتي استثمر تطويرها في جامعة أكسفورد عشرات الملايين من الدولارات. صحيح ، يجب أن يحتوي كل nanoreader متعدد القنوات على أكثر من عشرة مكبرات صوت حالية + ADC ، لكن لا يزال من الممكن أن يكلف عدة مرات أقل من مجموعة MinION + Flongle الخاصة (> 200 ألف روبل). بالنسبة للأداء المنخفض لمقياس النانو ، بالنسبة للمستخدمين الروس الذين ليس لديهم أجهزة كمبيوتر لائقة (الأطباء ، علماء الأحياء ، المخترقون الحيويون ، إلخ) ، فقد يكون ذلك مفيدًا.
Kilorider
وترد مكبرات الصوت الحالية picoampere 512 قناة التي وضعتها أكسفورد في كل خلية المتاح لل MinION. يمكن التخلص من خلايا النفايات ، لكن من الأفضل استخدام الرقائق الموجودة فيها لإنتاج نظائر Flongle التي تتميز بزيادة الإنتاجية. إذا كانت هذه الرقاقات مجهزة بملامسات سطحية ، فستكون قادرة على العمل مع خلايا تلامس تحتوي على 2048 (512 × 4) آبار استشعار.
لن يكون تصميم الخلايا باستخدام مثل هذه LGAs أمرًا سهلاً ، ولكن عليك أن تأخذ في الاعتبار أن متطلبات الاتصال هنا أقل صرامة من المعالجات واللوحات الأم ، حيث يمكن لجهة اتصال واحدة سيئة تعطيل النظام بأكمله. بالنسبة لمسلسل ، يمكن اعتبار عدم قابلية التشغيل حتى لنصف جهات اتصال الخلية مقبولة. النصف المتبقي يكفي لضمان الأداء عند مستوى 5 ... 10 جيجابايت.
سيكون التطوير المنطقي لهذه الفكرة هو مزيج من العديد من القراء مماثلة في جهاز واحد. سيتيح لك ذلك الحصول على جهاز تسلسل تناظري GridION X5 ، مصمم للعمل في وقت واحد مع خمس (أو أكثر) خلايا قابلة لإعادة الاستخدام من الإنتاج المحلي. قد يكون مثل هذا التسلسل في الطلب في العديد من مختبرات التشخيص السريري.
https://store.nanoporetech.com/devicesتحتوي خلايا جهاز التسلسل PromethION المتاح على 9000 بئر استشعار على الرقائق. والرقائق نفسها عبارة عن مضخمات صوتية ذات 3000 قناة من التيارات picoampere. إن دفق المعلومات الذي يقدمونه مع 24 (PromethION 24) أو 48 (PromethION 48) خلايا معلومات كبير جدًا لدرجة أنه لا يمكن نقله بشكل أولي إلى كمبيوتر خارجي منتظم. لذلك ، يجب أن تكون أجهزة التسلسل من هذا النوع مزودة بحاسوب عملاق خاص بها. ولكن إذا كان جهاز التسلسل سيعمل فقط مع خلية واحدة ، فيمكن توصيله بجهاز كمبيوتر محمول عادي للألعاب باستخدام منفذ Thunderbolt 3.0.
لا يعد تغيير الرقائق المجانية (المقذوفة) من ONT للعمل مع خلايا الاتصال مشكلة غير قابلة للذوبان. لكن أجهزة التسلسل المبنية على استخدام هذه الرقاقات لا تعمل إلا مع برنامج ONT. والجهود التي يجب إنفاقها على إعادة صياغة هذه البرامج يمكن أن تلغي فوائد استخدام الرقائق الجاهزة. وتطوير مثل هذه الرقائق من الصفر مكلف للغاية.
ميجا رايدر
هذا العام ، من المقرر أن يبدأ اختبار بيتا لمسلسل nanopore من AXBIO (الولايات المتحدة الأمريكية). إنها تستخدم الرقائق التي تحتوي على مليون قناة من التضخيم الحالي الذي تم إنتاجه في اليابان من قِبل الشركة الإسرائيلية Tower Semiconductor Ltd ... وسيتم التعامل مع المواد الاستهلاكية وبيع هذه التسلسلات بواسطة الفرع الصيني لـ AXBIO.
في الولايات المتحدة والاتحاد الأوروبي ، يخصص أكثر من 7000 براءة اختراع لتسلسل النانو ، مما يخلق مخاطر مالية لا يمكن التنبؤ بها للشركات المحلية التي تحاول التعامل مع هذه التقنيات. على ما يبدو ، هذا هو السبب الرئيسي لمثل هذا التدويل العالي لهذا التطور. ويسمح للشركات والمختبرات الروسية بالمشاركة دون أي قيود في اختبار وتحسين تكنولوجيا AXBIO ، وكذلك إنتاج (أو جمع) هذه التسلسلات على أراضيها.
تيرابايت من البيانات الخام التي حصل عليها جهاز التسلسل nanopore مع رقائق ميغابيكسل (قارئ ميجا) ، فمن المستحسن التصفية. ونقل إلى الكمبيوتر فقط أطول وأعلى جودة القراءة. لن يؤدي ذلك إلى تحسين جودة التسلسل فحسب ، بل سيقلل أيضًا من متطلبات الكمبيوتر ، وهو أمر مهم أيضًا للإنتاج بالجملة والاستخدام واسع النطاق لمسلسلات الجينوم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للإنتاجية المفرطة للقراء العملاقة أن تقلل من مدة تسلسل الجينوم البشري من 2 ... 3 أيام (لـ ONT) إلى عدة ساعات.
مجموع التكنولوجيا
تم تسهيل نجاح ONT من خلال تنظيم خط أنابيب موازٍ للعناصر الخمسة الرئيسية لتكنولوجيا التسلسل النانوي - الأغشية ، nanopores ، "المحركات" (helicases) ، ظروف التسلسل ، وفك خوارزميات فك التشفير لإشارات القراءة.
https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000تعتمد مدة الصلاحية المضمونة للخلايا لتسلسل nanopore بشكل أساسي على ثبات الغشاء الدهني ثنائي الطبقة. الآن هو 6 أسابيع ، على الرغم من تدمير هذه الأغشية عادة في غضون بضعة أيام. لزيادة العمر الافتراضي ، يتم استخدام إضافات البوليمر المسعورة ، البوليمرات المشتركة النشطة بالسطح ، والكوليسترول ، ومضادات الأكسدة ، والربط المتبادل للأحماض الدهنية ، وما إلى ذلك ، ويمكن أن تتداخل هذه التعديلات مع تكوين قنوات الأيونات. لذلك ، من الصعب جدًا تحقيق استقرار BLM.
يسمح حل هذه المشكلة جذريًا بتكوين أغشية في خلايا العامل في المنظم وإدخال nanopores فيها مباشرة قبل الاستخدام. سيوفر الإعداد الذاتي للخلايا للعمل الفرصة لتجديدها وإعادة استخدامها. بالنسبة إلى العمر الافتراضي للخلايا الجافة ، فهي غير محدودة تقريبًا ، ويمكن تخزين الكواشف اللازمة لتنشيطها وتجديدها لعدة أشهر.
عنق الزجاجة في تقنية تسلسل الأسلاك النانوية هو في نفس الوقت عنق الزجاجة في nanopore ، التي تعتمد عليها جودة معلومات القراءة. لذلك ، كانت إحدى المهام الرئيسية لـ ONT هي البحث عن بروتين غشائي ، والذي يسمح بالحصول على نتائج ذات جودة مقبولة.
أول بروتين من هذا القبيل هو CsgG ، وهو بروتين غشاء خارجي موجود في العديد من البكتيريا سالبة الجرام. تشكل تسعة من وحداتها الفرعية قناة أيون في الغشاء مع دهليز مدخل وخروج واسع وزجاجة واحدة. ولكن كان من الممكن الحصول على نانوبورات عالية الجودة بدرجة كافية (R9 ، R9.4.1 ، R9.5.1) فقط بعد تعداد وتحليل مئات المتغيرات CsgG المعدلة. هذا الصيف ، يجب أن تظهر الخلايا التي تحتوي على مسام الجيل التالي (R10 أو R10b) للبيع ، وتتميز بالدقة المتزايدة في قراءة التكرارات المتجانسة.
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenaryيعد ONT مكونًا إلزاميًا في تقنية تسلسل ONT nanopore ، وهي مروحية ، وهي محرك جزيئي يسترجع الحمض النووي المزدوج تقطعت به السبل ويمنع تقدم الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل من خلال nanopore. يصل الحد الأقصى لسرعة تفكيك الحمض النووي بواسطة مثل هذا المحرك الآن إلى 450 زوجًا من النيوكليوتيد في الثانية ، على الرغم من أن سرعة المكونات الإلكترونية من MinION تسمح بزيادة هذه القيمة إلى 1000 نيوكليوتيدات في الثانية. من الناحية النظرية ، يمكن أن يؤدي تسريع عمل helicase إلى مضاعفة أداء MinION ، ولكن في الممارسة العملية يمكن أن يؤدي ذلك إلى تتابع ضعيف. لذلك ، من غير المرجح أن تؤدي طائرات الهليكوبتر الأسرع والأكثر كفاءة إلى تحسين أداء أجهزة التسلسل النانوية مثل MinION و PromethION.
تعتمد جودة التسلسل على العديد من الشروط - حجم الجهد المطبق على الغشاء ، والتوصيل الكهربائي والتركيب الأيوني لمزيج التفاعل ، وكمية وطبيعة الشوائب التي تسد المسام ، والقدرة على تنظيف المسام المسدودة من خلال تغيير قطبية الإمكانية ، وهيكل المحولات المستخدمة ، وما إلى ذلك ... إلخ. يتطلب التسلسل تحسينًا دقيقًا لجميع المعلمات والتركيبات الخاصة بحلول العمل (ظروف التشغيل) ، والتي يمكن أن تؤثر سلبًا على جودة ترقيم تسلسل النيوكليوتيدات awns. على سبيل المثال ، لقد ظهر مؤخرًا أن انخفاض تركيز ATP المشقوق بواسطة الهيليز يقلل تدريجياً من دقة نتائج التسلسل ، والآن يحاول أوكسفورديون القضاء على هذه المشكلة عن طريق إدخال نظام تجديد ATP في خليط التفاعل.
العنصر الخامس من تقنية التسلسل النانوي هو الذكاء الاصطناعي المبني على الشبكات العصبية المتكررة (RNN) وعلى استخدام بعض الخوارزميات والبرامج الخاصة التي تعمل على تحسين التعرف على التكرارات المتجانسة (Flip-flop ، Medaka). في شهر يوليو ، يجب أن يظهر الإصدار التالي من برنامجي Guppi و MinKNOW ، حيث يعد الأكسفورديون بإضافة القدرة على تحديد القواعد الميثيلية (5mC و 6mA). هذا مهم ليس فقط للدراسات اللاجينية ، ولكن أيضًا لتحسين التعرف على القواعد التقليدية.
الكم الهائل من المعلومات التي تقرأها متسلسلات nanopore وتعقيد معالجتها يفرض متطلبات متزايدة على أجهزة مثل هذه البرامج وأنظمة الأجهزة. لذلك ، ليس كل جهاز كمبيوتر مناسبًا لتوصيل MinION ، تم تثبيت أحدث جيل من مسرعات الرسومات في GridION و PromethION ، وأصبحت Oxford Nanopore Technologies واحدة من أوائل المشترين لمجموعة كبيرة من وحدات Jetson AGX Xavier (NVIDIA) المصممة للأجهزة ذات الذكاء الاصطناعي.
في الآونة الأخيرة ، تم اعتبار أن تكنولوجيا nanopore ليست أكثر من تكملة مفيدة لتكنولوجيا مضان وتسلسل أشباه الموصلات الأكثر دقة. لكن الزيادة التدريجية في دقة قراءة الحمض النووي ، مقترنة بطول كبير من التسلسلات المقروءة ، سمحت لها ، إن لم يكن بالتقدم على جميع المنافسين ، ثم على الأقل تحديد المتجه الرئيسي لتطوير تقنيات التسلسل الجيني.
قد يستغرق الأمر بعض الوقت لإتقان جميع عناصر تقنية التسلسل النانوي ، لكن هذه ليست المشكلة الأكبر. المشكلة الرئيسية هي نقص التمويل الموجه لمثل هذه التطورات المتكاملة في روسيا. صحيح أن البرنامج العلمي والتقني الفيدرالي المعتمد حديثًا لتطوير التقنيات الوراثية للفترة 2019-2027 (القسم "اتجاهات تنفيذ البرنامج") يقول إنه على المدى القصير (3 ... 6 سنوات) سيتم تطوير جهاز نموذج أولي للتسلسل الجيني عالي الأداء. لكن العثور على هذا السطر المفرد في 30 صفحة من النصوص ليس بالأمر السهل. أسهل للتفاوض مع الصينيين على شراء أجهزة التسلسل AXBIO.
أبسط من ذلك هو العثور على الحرفيين الذين يمكنهم تجميع أبسط nanorider "على الركبة". ثم قم بالسير بيد ممدودة بحثًا عن المستثمرين الذين يوافقون على تمويل تطوير التكنولوجيا المحلية لتسلسل nanopore.