توفي الحائز على جائزة نوبل كاري موليس - مخترع تفاعل سلسلة بوليميريز الحمض النووي

في كاليفورنيا ، عن عمر يناهز 74 عامًا ، توفي الحائز على جائزة نوبل الأمريكية في الكيمياء كاري موليس. وفقا لزوجته ، وقعت وفاة في 7 أغسطس. السبب هو فشل القلب والجهاز التنفسي بسبب الالتهاب الرئوي.

سيخبرنا جيمس واتسون ، مكتشف جزيء الحمض النووي ، بمساهمته في الكيمياء الحيوية وما حصل عليه من جائزة نوبل.

مقتطف من كتاب جيمس واتسون ، أندرو بيري ، كيفن ديفيس

DNA. تاريخ الثورة الجينية

الفصل 7. الجينوم البشري. سيناريو الحياة

...
اخترع تفاعل البوليميريز المتسلسل (PCR) في عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية كاري موليس ، الذي كان يعمل في Cetus. كان اكتشاف رد الفعل هذا ملحوظًا جدًا. يتذكر موليس فيما بعد: "ذات يوم من ليلة الجمعة في أبريل (نيسان) 1983 ، بدا لي أنه يضيء علي. كنت أقود السيارة على طريق جبلي متعرج مقمر إلى شمال كاليفورنيا ، على حافة غابات الخشب الأحمر. " من المثير للإعجاب أنه في مثل هذه الحالة ، تمت زيارته بالإلهام. وليس هناك على الإطلاق في شمال كاليفورنيا طرق خاصة تعزز الرؤية. لقد رأى صديقه موليس يهرع بتهور على طريق جليدي في اتجاهين ، وهذا لم يزعجه على الإطلاق. قال أحد الأصدقاء لصحيفة نيويورك تايمز: "كان موليس يحلم بأنه سيموت عن طريق الاصطدام بسكويا. لذلك ، فهو لا يخاف من قيادة أي شيء إذا لم تنمو الخشب الأحمر على طول الطريق ". جعل وجود sequoia على طول الطريق جعل موليس التركيز و ... ومن هنا ، نظرة ثاقبة. لاختراعه في عام 1993 ، حصل على جائزة نوبل في الكيمياء وأصبح منذ ذلك الحين أكثر غرابة في تصرفاته. على سبيل المثال ، هو أحد مؤيدي النظرية التحريرية القائلة بأن الإيدز ليس له علاقة بفيروس نقص المناعة البشرية ، مما قوض سمعته بشكل كبير ومنع الأطباء.

PCR هو رد فعل بسيط إلى حد ما. لتنفيذ ذلك ، نحتاج إلى دهانين أساسيين مُركَّبين كيميائيًا مكمِّلين للطرفين المعاكسين لسلاسل مختلفة من جزء الحمض النووي المطلوب. الاشعال هي أقسام قصيرة من الحمض النووي المفرد تقطعت بهم السبل ، كل منها حوالي 20 زوجا قاعدة طويلة. خصوصية الاشعال هي أنها تتوافق مع مناطق الحمض النووي التي تريد تضخيمها ، أي قالب الحمض النووي.


(صورة قابلة للنقر) Cary Mullis ، مخترع PCR

وتستند خصوصية PCR على تشكيل مجمعات تكميلية بين المصفوفة والاشعال ، قليل النوكليوتيدات الاصطناعية قصيرة. كل من الاشعال يكمل أحد سلاسل المصفوفة المزدوجة وتحد من بداية ونهاية المنطقة المضخمة. في الواقع ، تمثل "المصفوفة" الناتجة جينومًا كاملاً ، وهدفنا هو عزل الشظايا التي تهمنا عنها. لهذا ، يتم تسخين قالب الحمض النووي المزدوج تقطعت به السبل إلى 95 درجة مئوية لعدة دقائق حتى يتم تشتيت سلاسل الحمض النووي. وتسمى هذه المرحلة تمسخ ، حيث يتم تدمير الروابط الهيدروجينية بين سلاسل الحمض النووي. عندما تكون السلاسل مفتوحة ، يتم خفض درجة الحرارة بحيث يمكن للإشعالات الاتصال بقالب السلسلة المفردة. يبدأ بوليميريز الحمض النووي في تكاثر الحمض النووي عن طريق الارتباط بطول سلسلة من النيوكليوتيدات. يقوم إنزيم بوليميريز الحمض النووي بتكرار سلسلة القالب باستخدام مادة أولية كمثال أولي أو نسخة. نتيجة للدورة الأولى ، نحصل على مضاعفة مضاعفة متتالية لمنطقة DNA محددة. التالي نكرر هذا الإجراء. بعد كل دورة ، نحصل على المنطقة المستهدفة بكمية مضاعفة. بعد 25 دورة من دورات PCR (أي في أقل من ساعتين) ، لدينا منطقة ذات أهمية من الحمض النووي DNA أكبر بمقدار 225 مرة من النسخة الأصلية (أي ، قمنا بتضخيمها حوالي 34 مليون مرة). في الواقع ، عند المدخل ، حصلنا على مزيج من الاشعال ، DNA القالب ، انزيم polymerase DNA والقواعد الحرة A و C و G و T ، وكمية منتج التفاعل المحدد (محدود بواسطة الاشعال) تزداد باطراد ، وعدد نسخ الحمض النووي "الطويل" خطي ، وبالتالي منتجات التفاعل تهيمن.


تضخيم موقع DNA المطلوب: تفاعل سلسلة البلمرة

في فجر PCR ، كانت المشكلة الرئيسية على النحو التالي: بعد كل دورة تبريد تسخين ، كان لا بد من إضافة بوليميريز الحمض النووي إلى خليط التفاعل ، حيث تم إيقافه عند 95 درجة مئوية. لذلك ، كان من الضروري إعادة إضافته قبل كل دورة من دورات 25. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيا ، فقد تطلب الكثير من الوقت وأنزيم البوليميريز ، والمواد غالية جدا. لحسن الحظ ، جاءت الطبيعة الأم لإنقاذ. تشعر العديد من الحيوانات بالراحة عند درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية. ولماذا الرقم 37 درجة مئوية أصبحت مهمة بالنسبة لنا؟ حدث هذا لأن درجة الحرارة هذه مثالية لـ E. coli ، والتي تم الحصول منها على إنزيم polymerase for PCR. في الطبيعة ، هناك كائنات دقيقة أصبحت بروتيناتها أكثر مقاومة لدرجات الحرارة المرتفعة على مدى ملايين السنين من الانتقاء الطبيعي. تم اقتراح استخدام بوليميرات الدنا من البكتيريا المحبة للحرارة. كانت هذه الإنزيمات قابلة للحرارة وكانت قادرة على تحمل العديد من دورات التفاعل. جعل استخدامها من الممكن لتبسيط وأتمتة PCR. تم عزل أحد أول بوليميرات الدنا القابلة للحرارة من بكتيريا تيرموس أكواتيكوس التي تعيش في الينابيع الحارة في متنزه يلوستون الوطني وتسمى بوليميريز طق.

سرعان ما أصبح PCR العمود الفقري الرئيسي لمشروع الجينوم البشري. بشكل عام ، لا تختلف العملية عن تلك التي طورتها موليس ، لقد كانت مؤتمتة فقط. لم نعد نعتمد على حشد طلاب الدراسات العليا المكفوفين بصب قطرات السائل بشق الأنفس في أنابيب بلاستيكية. في المختبرات الحديثة التي تجري البحوث الوراثية الجزيئية ، يتم تنفيذ هذا العمل على الناقلات الآلية. تعمل روبوتات PCR المشاركة في مشروع تسلسل واسع النطاق مثل الجينوم البشري بلا هوادة مع كميات هائلة من البلمرة المقاومة للحرارة. غضب بعض العلماء الذين يعملون في مشروع الجينوم البشري من المساهمات الكبيرة التي لا مبرر لها والتي أضافها حامل براءات الاختراع PCR ، العملاق الصناعي والصناعي الأوروبي هوفمان-لاروش ، إلى تكلفة المواد الاستهلاكية.

كانت "القوة الدافعة" الأخرى هي طريقة تسلسل الحمض النووي نفسه. الأساس الكيميائي لهذه الطريقة في ذلك الوقت لم يعد حداثة: اعتمد مشروع الجينوم البشري بين الولايات (HGP) على نفس الأسلوب المبتكر الذي طوره فريد سينجر في منتصف السبعينيات. كان الابتكار في نطاق ودرجة الأتمتة التي تم تحقيقها أثناء التسلسل.

تم تطوير التسلسل التلقائي في الأصل في مختبر Lee Hood في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. تخرج من المدرسة الثانوية في مونتانا ولعب كرة القدم الأمريكية كمهاجم. بفضل هود ، فاز الفريق ببطولة الدولة أكثر من مرة. جاءت مهارات العمل الجماعي في متناول اليد له في مسيرته العلمية. استخدم مختبر هود شركة متنقلة من الكيميائيين وعلماء الأحياء والمهندسين ، وسرعان ما أصبح مختبره رائدًا في مجال الابتكار التكنولوجي.

في الواقع ، اخترع لويد سميث ومايك هانكابيلر طريقة التسلسل التلقائي. تحول مايك هانكابيلر ، الذي كان يعمل بعد ذلك في مختبر هود ، إلى لويد سميث ، حيث قدم له طريقة تسلسل محسّنة تُرسم فيها قواعد كل نوع بلونه الخاص. مثل هذه الفكرة يمكن أن تضاعف أربع مرات فعالية عملية سنجر. عندما تشكل التسلسل في كل من الأنابيب الأربعة (وفقًا لعدد القواعد) بمشاركة DNA polymerase ، تشكل مجموعة فريدة من أليغنوكليوتيدات ذات أطوال مختلفة ، بما في ذلك تسلسل تمهيدي. بعد ذلك ، تمت إضافة فورماميد إلى الأنابيب لفصل السلاسل ، وتم إجراء رحلان بولي أكريلاميد الكهربائي على أربعة مسارات. في متغير Smith و Hunkapiller ، يتم تمييز الديوكسين النيوكليوتيدات بأربعة أصباغ مختلفة ويتم إجراء PCR في أنبوب واحد. بعد ذلك ، خلال رحلان بولي أكريلاميد الكهربائي ، تثير شعاع الليزر في مكان معين في الجل نشاط الأصباغ ، ويحدد الكاشف أي النوكليوتيدات يهاجر حاليًا عبر الجل. في البداية ، كان سميث متشائمًا - فقد كان خائفًا من أن يؤدي استخدام جرعات منخفضة جدًا من الصبغة إلى أن مناطق النيوكليوتيدات لا يمكن تمييزها. ومع ذلك ، كونه على دراية جيدة بتقنيات الليزر ، سرعان ما وجد مخرجًا باستخدام أصباغ الفلوروكروم الخاصة التي تتألق تحت تأثير إشعاع الليزر.


(النسخة الكاملة بواسطة النقر - 4.08 ميغابايت) طباعة صغيرة: فك شفرة تسلسل الحمض النووي باستخدام جهاز تسلسل تلقائي تم الحصول عليه من جهاز تسلسل تلقائي. كل لون له واحد من أربع قواعد.

في الإصدار الكلاسيكي لطريقة سانجر ، يعمل أحد خيوط الحمض النووي الذي تم تحليله بمثابة مصفوفة لتوليف حبلا مكملاً بواسطة بوليميريز إنزيم الحمض النووي ، ثم يتم ترتيب تسلسل شظايا الحمض النووي حسب الحجم في هلام. يتم تمييز كل جزء تم تضمينه في الحمض النووي أثناء التخليق ويسمح بعد ذلك لتصور منتجات التفاعل بصبغة فلورسنت تقابل القاعدة الطرفية (تمت مناقشة ذلك في الصفحة 124) ؛ لذلك ، سيكون مضان هذه القطعة معرفًا لقاعدة معينة. ثم يبقى فقط تنفيذ الكشف وتصور منتجات التفاعل. يتم تحليل النتائج باستخدام جهاز كمبيوتر وعرضها كسلسلة من قمم متعددة الألوان المقابلة لأربعة نيوكليوتيدات. علاوة على ذلك ، يتم نقل المعلومات مباشرة إلى نظام معلومات الكمبيوتر ، مما يلغي عملية إدخال البيانات المستهلكة للوقت والتي تكون مؤلمة في بعض الأحيان ، مما يعقد عملية التسلسل إلى حد كبير.

»يمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول الكتاب على موقع الناشر
» المحتويات
» مقتطفات

ل Khabrozhiteley خصم 25 ٪ على القسيمة - PCR