Genotypisierungsfreaks: Erfahrung in der Feldgenetik

Wir hatten vier Zentrifugen, tausend Pasteurpipetten, Reagenzienkits, einen Gefrierschrank mit minus zwanzig, einen Thermocycler, eine Abnahmekammer und einen Transilluminator, der sich nur einschaltete, wenn Sie abdrücken. Das einzige, was Zweifel aufkommen ließ, war, wie wir die PCR vor Ort durchführen werden, aber wir wussten, dass wir dies früher oder später versuchen würden.

Wir haben dies zum ersten Mal im Moskauer GikPiknik vom 13. bis 14. Juni im Park Krasnaya Presnya gemacht. Wir stellten Tische auf, pflanzten Freiwillige, schweißten Agarosegel in einer Mikrowelle aus unserem Büro (wir bekamen wunderschöne Briketts der Elektrophorese, transparent wie eine Babyträne) und begannen mit der Genotypisierung. Ich wollte allen zeigen, dass Genetik Spaß macht!



Atlas- Teamhat die Genotypisierung von DRD4, dem Dopaminrezeptor-Gen, das als Lusthormon bekannt ist, durchgeführt. Das DRD4-Gen ist dafür verantwortlich, dass unsere Gehirnzellen das Vorhandensein von Dopamin „fühlen“. Das Ende dieses Gens wird durch Wiederholungsstellen gebildet. Die Anzahl der Wiederholungen kann unterschiedlich sein - von 2 bis 11. Allele: 2R, 4R, 7R usw. werden entsprechend nummeriert. Abhängig von der Anzahl der Wiederholungen im Gen reagiert das Protein mehr oder weniger auf Dopamin. Dies beeinflusst die Intensität des Gefühls der Freude an Ereignissen oder Essen und infolgedessen die Erregung einer Person. Menschen mit siebenfacher Wiederholung (7R-Polymorphismus) benötigen mehr Dopamin, um zufrieden zu sein. Es ist unwahrscheinlich, dass sie genug Süßigkeiten oder ähnliche einfache Freuden haben. Oft müssen sie dafür reisen,riskante Sportarten ausüben - sie sitzen nicht still. Dies wird durch bestätigtStudien , die einen Zusammenhang zwischen dem 7R-Allel und der Migrationsentfernung alter Menschen von Afrika nach Eurasien festgestellt haben.

Um den Polymorphismus zu bestimmen, war es notwendig, DNA zu isolieren, eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchzuführen und ihre Ergebnisse auf Elektrophorese durchzuführen: Ordnen Sie die DRD4-Gensegmente in Agarosegelee an. Aber das Wichtigste zuerst.
Im Stadium der DNA-Extraktion aus Speichel konnte jeder teilnehmen. Zuerst musste man mit einem Wattestäbchen an der Innenseite der Wange kratzen und diese in einem Reagenzglas mit Wasser abspülen.
Dann rollten wir das Röhrchen in einer Zentrifuge und unter der Wirkung der Zentrifugalkraft setzten sich die Epithelzellen ab und bildeten einen Niederschlag. Wir gießen Wasser ein und geben einen Lysepuffer (Waschmittel) in das Reagenzglas, um die Zellwände zu zerstören und es in einem Wasserbad zu erhitzen.

Infolgedessen befindet sich im Reagenzglas anstelle ganzer Zellen ein Smoothie wie aus einem Mixer: die Überreste von Membranen, das Zytoplasma mit den darin gelösten Proteinen, Zellorganellen und DNA. Wir entfernen es in drei Schritten.
Die erste Stufe basiert auf der Polarität. Alle Moleküle sind in zwei Gruppen unterteilt - polar (dh mit einer Ladung) und unpolar (ohne Ladungen auf der Oberfläche). Polare Moleküle wie polare Lösungsmittel (da sich Salz in Wasser löst) und unpolare Moleküle lösen sich nur in unpolaren Flüssigkeiten (ätherische Öle - in Alkohol).



Daher geben wir ein unpolares Lösungsmittel Chloroform in das Reagenzglas (DNA löst sich nicht darin und Zellmembranen - ja) und senden es zur Zentrifuge.
Als Ergebnis erhalten wir eine zweiphasige Lösung: Wasser mit einem DNA-Film oben und Chloroform, das unten gesunken ist. Es ist notwendig, den wässrigen Teil vorsichtig mit einer Pasteurpipette mit DNA zu zeichnen und in ein anderes Röhrchen zu überführen und Chloroform zu gießen. Zu Ehren der Geeks sagen wir, dass selbst die jüngsten Jungs es gewagt haben, diese Schmuckoperation durchzuführen.
Dann fügten wir eine Sedimentlösung hinzu, um die DNA erneut von den Detergenzien zu waschen.
DNA ist ein geladenes Teilchen, daher haben wir eine Salzlösung mit hoher Ionenstärke hinzugefügt, um es auszufällen. (Irgendwann endete es mit uns, ich musste zum Food Court laufen, gewöhnliches Speisesalz nehmen und es züchten). Gegen Ende - Schocktherapie: 96% iges Ethanol hinzufügen. Zehn Minuten im Gefrierschrank, zehntausend Kreise in einer Zentrifuge - und wir können die DNA am Boden des Röhrchens sehen.
Wir lassen die Flüssigkeit ab und der Niederschlag selbst wird in entionisiertem Wasser gelöst. Solches Wasser stört nicht die Funktion von Enzymen, die in der Molekularbiologie verwendet werden, und kann daher für die PCR verwendet werden.

Alles andere fand in unserem Laborzelt statt (lesen - auf freiem Feld).



Mittels PCR erhielten wir viele Kopien der Stelle ganz am Ende unseres Gens.
Zwei Primer bestimmten den Beginn und das Ende der DRD4-Genwiederholungen. Sie schnitten es aus und kopierten es viele Male unter Verwendung des Enzyms Polymerase, das die Nukleotidsequenz im Bild und in der Ähnlichkeit des ursprünglich existierenden Gensegments reproduziert. Dieser Vorgang wird als Verstärkung bezeichnet. Dies alles geschah automatisch in einem speziellen Verstärker.

Um den Polymorphismus zu bestimmen, führten wir eine Elektrophorese durch - genau die Rassen, über die wir bereits gesprochen haben. Unsere erfahrene Molekularbiologin Vera Bashmakova tropfte nach der PCR erhaltene Proben in die Vertiefungen des Agarosegels.



Dann wurde ein elektrischer Strom durch das Gel geleitet. Geladene DNA-Moleküle bewegten sich in einem elektrischen Feld, und die Geschwindigkeit ihrer Bewegung hing von der Anzahl der Wiederholungen im Gen ab: Je mehr es gibt, desto langsamer ist die Länge der DNA. Wir fügten dem Gel eine spezielle Lösung hinzu, die die DNA hervorhob, wenn das Gel auf einem Transilluminator ultraviolettem Licht ausgesetzt wurde. Die Entfernung wurde mit einem Molekulargewichtsmarker gemessen - und voila, Sie haben das abenteuerliche "langsame" 7R-Allel bestimmt.



Die gesamte Analyse dauerte ungefähr zwei Stunden (ohne den Prozess der DNA-Extraktion).

In nur zwei Tagen nach dem Picknick haben etwa 150 Menschen die Genotypisierung bestanden, von denen 13% genetische Abenteurer waren. Gleichzeitig ist Variante 7R im Durchschnitt der russischen Bevölkerung nur bei 5% der Menschen anzutreffen . Es stellt sich heraus, dass die Konzentration genetischer Abenteurer bei HikPiknik gestiegen ist.

Übrigens war einer der Abenteurer am Samstag von der Feldgenetik so begeistert, dass er am Sonntag als Freiwilliger zu uns kam.

UPD : und in St. Petersburg ist die Konzentration genetischer Abenteurer geringer: nur 2,5%.
Insgesamt haben wir für das zweite Wochenende von Gikpiknik in St. Petersburg 160 Personen progenotypisiert.

Source: https://habr.com/ru/post/de380615/