Wie DNA sequenziert wird

Die DNA-Sequenzierung hat sich in den letzten Jahrzehnten von einem engen Feld, das von einer kleinen Anzahl von Wissenschaftlern bearbeitet wurde, zu einer der am schnellsten wachsenden Technologien entwickelt. Produktivitätswachstum und sinkende Kosten liegen sogar vor Moores Gesetz, und aufgrund des starken Wettbewerbs auf dem Markt und der großen Nachfrage wird die Entwicklung weiterhin in hohem Tempo fortgesetzt. Darüber hinaus führte die Entwicklung der Sequenzierung zu demselben Boom in der Bioinformatik und einer radikal veränderten Biologie und veränderte allmählich auch die Medizin grundlegend.



Von kat, ich erzähle dir mehr darüber, wie sie es machen.

Was ist DNA?
Um den Prozess selbst zu verstehen, ist zunächst eine wenig notwendige Theorie erforderlich.
DNA ist eine Polymerkette, die aus vier Arten von Monomeren besteht, die als Nukleotide bezeichnet werden und deren Sequenz Informationen über den Körper codiert. Mit anderen Worten, DNA kann als Text dargestellt werden, der in einem Alphabet aus vier Buchstaben geschrieben ist. DNA ist ein Molekül, das aus zwei Ketten besteht, und obwohl ihre Nukleotidsequenz unterschiedlich ist, kann die Sequenz einer Kette eindeutig wiederhergestellt werden, wenn die Sequenz der anderen bekannt ist. Daher werden Ketten als komplementär bezeichnet. (Eng. Complement - Supplement) Diese Eigenschaft wird verwendet, wenn eine Zelle kopiert wird, wenn DNA-Stränge abgewickelt werden, und auf jeder wie auf einer Matrix wird die zweite synthetisiert, und jede von zwei Tochterzellen erhält ihre doppelsträngige DNA. Die gesamte DNA-Sequenz eines Organismus wird als Genom bezeichnet. Zum Beispiel besteht das menschliche Genom aus 46 Chromosomen.

Trotz der großen Anzahl verschiedener, sowohl experimenteller als auch veralteter Methoden sind die gängigen kommerziellen Methoden ziemlich ähnlich, und um nicht jedes Mal Vorbehalte zu machen, werde ich sofort sagen, dass es um diese gängigen Methoden geht.

Wie es im Allgemeinen aussieht
Bevor ich die Sequenziertechnologie beschreibe, werde ich für ein intuitives Verständnis die folgende Analogie ziehen: Sie sprengen einen Stapel identischer Zeitungen in die Luft, so dass sie in kleine Stücke mit Textfragmenten zerfallen, und dann wird jedes dieser Stücke gelesen und aus diesen Lesungen wird der Text wiederhergestellt Originalzeitung.

Um DNA zu sequenzieren, wird sie zuerst aus der Testprobe isoliert und dann zufällig in kleine Fragmente geschnitten. Die Fragmente werden als Reads bezeichnet. Von jedem Lesevorgang bleibt eine Kette übrig, und die zweite wird an dieser Kette wie auf einer Matrix synthetisiert, und der Typ jedes nachfolgenden Nukleotids, das gebunden ist, wird irgendwie nachgewiesen. Wenn Sie also die Sequenz der verbundenen Nukleotide aufzeichnen, stellen Sie deren Sequenz bei jedem Lesevorgang wieder her. Dann wird das Genom aus Computerablesungen unter Verwendung von Computerprogrammen rekonstruiert.

Ein wichtiger Punkt. Die Gesamtlänge der Lesevorgänge sollte um ein Vielfaches größer sein als die Länge der untersuchten DNA. Dies geschieht, weil beim Extrahieren der DNA aus der Probe und beim Schneiden ein Teil davon verloren geht, sodass niemand garantiert, dass jeder seiner Abschnitte in mindestens einen Lesevorgang fällt. Daher wird DNA mit einem großen Rand entnommen, damit garantiert wird, dass jeder Abschnitt gelesen wird. Darüber hinaus können während der Sequenzierung Fehler auftreten. Um die DNA zuverlässiger lesen zu können, sollte jeder Abschnitt mehrmals gelesen werden.


DNA wird in Lesevorgänge geschnitten, die lesen, und von diesen wird die ursprüngliche Sequenz wiederhergestellt

Diese Technik wird nicht für ein gutes Leben verwendet. Dies bringt viele Schwierigkeiten mit sich, und wenn die Forscher die gesamte Sequenz des Genoms gleichzeitig erfassen und lesen könnten, wären sie froh, dass dies derzeit jedoch nicht möglich ist.
Dafür gibt es zwei Gründe. Das erste sind Fehler, die beim Lesen jedes Nukleotids auftreten. Sie akkumulieren allmählich und jedes nachfolgende Nukleotid wird schlechter gelesen als das vorherige, und irgendwann ist die Lesequalität so verringert, dass es sinnlos ist, den Prozess fortzusetzen. Für verschiedene Sequenzierungsmethoden liegt die Länge des Lesevorgangs, die sie gut lesen können, in der Größenordnung von zehn oder Hunderten von Nukleotiden. Das zweite ist, dass DNA ein sehr langes Molekül ist und bei einer gewissenhaften Lektüre jedes Buchstabens nach einem Freund die Sequenzierung eine unanständige Zeit in Anspruch nehmen würde. In diesem Fall lässt sich dieser Prozess leicht parallelisieren, und Millionen und Milliarden von Lesevorgängen können gleichzeitig gelesen werden.



Illumina
Ein solches Schema beschreibt alle gängigen Sequenzierungstechniken. Sie unterscheiden sich nur in den Methoden zum Nachweis verbundener Nukleotide während der Synthese und in der Methode zur Herstellung des Materials.

Bisher wird die häufigste Methode bei Illumina-Sequenzern verwendet. Bei diesem Verfahren werden zunächst viele verschiedene Messwerte an der Glasplatte angebracht. Dann werden von jedem Lesevorgang viele Kopien auf der Oberfläche der Platte gemacht, so dass sich nur identische Kopien auf jedem kleinen Abschnitt davon befinden. Dies geschieht so, dass während der nachfolgenden Sequenzierung ein Signal nicht von einem einzelnen Molekül, sondern von einer Gruppe identischer Moleküle in der Nähe empfangen wird. So ist das Signal leichter zu lesen und die Zuverlässigkeit des Lesens steigt. Diese Moleküle sind einzelsträngige DNA, und während der Sequenzierung werden komplementäre Ketten darauf synthetisiert. Die Synthesereaktion wird wie folgt durchgeführt: Ein Nukleotid ist an den Anfang jedes Moleküls gebunden. Dieses Nukleotid ist also chemisch blockiertdass nach seiner Zugabe die Synthese nicht weiter geht. Zusätzlich ist daran ein Tag angebracht, das unter Einwirkung eines Lasers luminesziert. Darüber hinaus ist für jede Art von Nukleotiden die Farbe der Lumineszenz unterschiedlich. Nachdem das Nukleotid angebracht ist, wird die Platte mit einem Laser beleuchtet und die Kamera erfasst die Farben, mit denen die Platte luminesziert. Danach wird die Sperre entfernt, die Markierung wird ebenfalls entfernt und das nächste Nukleotid wird auf die gleiche Weise angebracht. Die Folge von Lichtsignalen an jedem Abschnitt der Platte im Computer wird in eine Folge von Nukleotiden übersetzt, und am Ausgang wird eine Datei erhalten, die die Folge von Lesevorgängen enthält.Nachdem das Nukleotid angebracht ist, wird die Platte mit einem Laser beleuchtet und die Kamera erfasst die Farben, mit denen die Platte luminesziert. Danach wird die Sperre entfernt, die Markierung wird ebenfalls entfernt und das nächste Nukleotid wird auf die gleiche Weise angebracht. Die Folge von Lichtsignalen an jedem Abschnitt der Platte im Computer wird in eine Folge von Nukleotiden übersetzt, und am Ausgang wird eine Datei erhalten, die die Folge von Lesevorgängen enthält.Nachdem das Nukleotid angebracht ist, wird die Platte mit einem Laser beleuchtet und die Kamera erfasst die Farben, mit denen die Platte luminesziert. Danach wird die Sperre entfernt, die Markierung wird ebenfalls entfernt und das nächste Nukleotid wird auf die gleiche Weise angebracht. Die Folge von Lichtsignalen an jedem Abschnitt der Platte im Computer wird in eine Folge von Nukleotiden übersetzt, und am Ausgang wird eine Datei erhalten, die die Folge von Lesevorgängen enthält.


Illumina
1 — 2 — 3 — , 4 — 5 — 6 — 7 —


Wenn die Genome enger Organismen zuvor nicht sequenziert wurden, versuchen sie aus den Lesevorgängen unter Verwendung von Programmen, eine einzelne Nukleotidsequenz zusammenzusetzen. Blätter überlappen sich teilweise und versuchen mit diesen Überlappungen, eine einzelne Sequenz zu erstellen. Es gibt viele Punkte, die die Angelegenheit erheblich erschweren. Sie können beispielsweise eine Probe kontaminieren, und das Programm versucht, eine Sequenz aus der DNA verschiedener Organismen zu erstellen. Der Sequenzer kann beim Lesen des Lesevorgangs einen Fehler machen oder die beiden Stellen im Genom falsch verknüpfen, da sie sehr ähnlich sind. Tatsächlich gibt es so viele Schwierigkeiten, dass Sie hier nicht alle auflisten werden. Und einige von ihnen sind so schwer zu eliminieren, dass selbst das menschliche Genom, das wichtigste und am weitesten untersuchte Genom, noch nicht bis zum Ende sequenziert ist.


liest und unter der Genomsequenz, die basierend auf ihnen rekonstruiert wird.

Wenn die Genomsequenz zusammengesetzt ist, müssen Sie verstehen, was es bedeutet. Darauf befinden sich Bereiche, die wie Gene aussehen. Dies geschieht wie folgt: Am Anfang und Ende der Gene befinden sich bestimmte „Markierungen“ von Nukleotiden. Wenn die DNA solche Sequenzen in einem solchen Abstand enthält, dass ein Gen zwischen sie passen kann, wird dieser Ort in die Liste der potenziellen Gene eingetragen. Dann wird dieser Antragsteller mit einer Datenbank bereits bekannter Gene anderer Organismen verglichen, und wenn darin ein Gen gefunden wird, das dieser Stelle ziemlich ähnlich ist, wird ihm die Funktion dieses Gens zugewiesen.

Wenn das Genom eines anderen Organismus dieser Art bereits sequenziert wurde, wird es zur Assemblierung verwendet. Da sich die Genome verschiedener Organismen derselben Art nur geringfügig unterscheiden, finden sie bei jedem Lesevorgang einen Platz auf dem sequenzierten Genom, dem es am nächsten liegt, und auf der Grundlage dieses Genoms wird ein neuer zusammengesetzt.

Source: https://habr.com/ru/post/de385865/