Gentechnik von Bakterien: Wie man das Protein, das wir brauchen, aus Bakterien gewinnt

In zwei früheren Artikeln über die Gentechnik von Bakterien ( ein- und zweimal ) haben wir herausgefunden, wie wir die benötigten Gene sammeln können, in welcher Form sie in das Bakterium eingeführt werden können und wie genau sie dort eingeführt werden können. Nehmen wir an, wir haben all diese Manipulationen durchgeführt, um eine Biofabrik für die Proteinproduktion herzustellen. Dann ist es jetzt das kleine Unternehmen - unser Protein in seiner reinsten Form aus dem Bakterium zu gewinnen.
Es gibt viele Methoden zur Lösung dieses Problems, die meisten beziehen sich auf die Chromatographie. Lesen Sie, wie diese Methoden unter der Katze funktionieren.

Die stationäre Phase „fängt“ die Moleküle auf, die an ihren (-OH) -Gruppen vorbeigehen.

Also haben wir die Belastung bekommen, die wir brauchten, und die Biomasse erhöht. Jetzt müssen wir irgendwie unser Protein daraus entfernen.

Zunächst nehmen wir unsere Kultur und gießen sie in Zentrifugenflaschen. Bakterien sind ziemlich große und schwere Objekte. Um sie auszufällen, sind während der Zentrifugation keine monströsen Überlastungswerte erforderlich: 10000 g reichen für 20 Minuten mehr als aus. Als Ergebnis erhalten wir ein Sediment am Boden der Flaschen und eine Flüssigkeit (es wird Überstand genannt). Wir gießen die Flüssigkeit aus, da sich unser Protein in den Bakterien befindet, die sich im Sediment befinden. Sie können je nach den Umständen weiter vorgehen: entweder sofort mit dem erhaltenen Niederschlag arbeiten oder einfrieren und lagern, bis er benötigt wird. Es kann sehr lange gelagert werden. Das weitere Verfahren für die Arbeit mit Schlamm hängt nicht davon ab, ob wir ihn im Gefrierschrank gelagert haben oder nicht.

Nehmen wir an, es ist Zeit, mit Sedimenten zu arbeiten. Was weiter?

Zunächst müssen wir die Zellen zerstören, damit das Protein austreten kann. Verwenden Sie dazu die folgenden Methoden:

• Sequentielles Einfrieren und Auftauen. Es ist nicht das effektivste Werkzeug zur Zerstörung der Zellmembran, aber es ist sicher für Protein. Beginnen Sie daher häufig mit mehreren solchen Zyklen und gehen Sie dann zu effektiveren Methoden über.
  
• Ultraschallbehandlung (Ultraschallbehandlung). Die Methode ist weit verbreitet, einfach und effektiv. Ultraschall wird normalerweise mit einem länglichen „Lautsprecher“, der mit den Zellen in die Flüssigkeit eingeführt wird, direkt an das Wasservolumen abgegeben, so dass das Ende des „Lautsprechers“ fast den Boden erreicht. Dies ist eine ziemlich schwierige Methode. Es gibt auch eine weichere Alternative: Ultraschall wird in das Wasserbad eingespeist, in dem die Röhren schwimmen.
  
  
  
  
  Ein Absolvent des MIT warnt - beobachten Sie Ihre Sonatoren genau.
  
  Bei der Ultraschallzerstörung von Zellen ist es wichtig, die Temperatur zu überwachen: Das Wasser erwärmt sich unter dem Einfluss von Ultraschall schnell, und wir müssen unser Protein überhaupt nicht denaturieren, und noch mehr möchten wir es nicht kochen. Daher wird im ersten Fall (mit einer „länglichen Säule“) das Reagenzglas mit den Zellen in eine Tasse mit Eis und Wasser eingeführt, und es sollte viel Eis vorhanden sein. Wasser wirkt in diesem Fall als thermische Grenzfläche zwischen dem Eis und dem von ihm gekühlten Reagenzglas. Bei der „weichen Alternative“ wird Eis direkt in das Wasserbad gegeben.
  
  
  Demonstration der "harten" Ultraschallverarbeitung. Achten Sie auf das schreckliche Geräusch in der Nähe der Installation, das besonders gut um 2:06 Uhr in diesem Video zu hören ist. Jemand wird so gut er kann gerettet: Jemand versucht, für die Dauer der Beschallung den Raum zu verlassen, jemand trägt spezielle geräuschabsorbierende Kopfhörer.
  
  
  Demonstration einer "weichen" Ultraschallbehandlung.
  
• Zugabe von Lysemitteln zum Medium. Dies sind hauptsächlich Waschmittel, dh "Seife" (im Allgemeinen bedeutet das Wort "Waschmittel" im Englischen "Waschmittel"). Waschmittel sind im Wesentlichen mit Lipiden in Zellmembranen verwandt. In der Umgebung mit den Zellen beginnen sich die Detergenzien in die Membranen zu integrieren, was zu ihrer Zerstörung führt. Und das brauchen wir einfach. Manchmal wird auch Lysozym hinzugefügt - ein Enzym, das die bakterielle Zellwand zerstört.
  
• Französische Presse. Die Zellsuspension wird durch das Einlassventil in den Arbeitszylinder gesaugt, von wo aus sie durch eine Presse durch einen engen Schlitz herausgedrückt wird. Die Querkräfte, die sich aus einem Druckabfall auf Atmosphärendruck ergeben, wenn die Zellen den Spalt passieren, führen zur Zerstörung der Zellwand und der Membran.

Aus eigener Erfahrung kann ich sagen, dass Ultraschall in Kombination mit Waschmitteln normalerweise mehr als genug ist.

Also haben wir ein Zelllysat bekommen - "Suppe", bestehend aus dem Protein, das wir brauchen, und einer großen Menge "Müll" (chromosomale und Plasmid-DNA, Teile der Zellwand, verschiedene Proteine ​​usw.). Wie kann man das alles loswerden?

Die erste Frage, die beantwortet werden muss, lautet: "In welcher Form war unser Protein in der Zelle vorhanden?" Es gibt zwei Hauptoptionen:

• Das Protein war vor der Lyse löslich und blieb es mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit danach, was bedeutet, dass wir es nicht durch Zentrifugation sedimentieren können. Aber wir können den großen „Müll“, der nach der Lyse übrig bleibt, ausfällen: Auf diese Weise werden wir Teile der Zellwand, chromosomale DNA und andere große Fragmente entfernen. Der Niederschlag wird verworfen und der Überstand zur Chromatographie geschickt;
  
• Das Protein war unter den Bedingungen des bakteriellen Zytoplasmas unlöslich und bildete das sogenannte Nach der Lyse erhaltene „Einschlusskörper“. Einschlusskörper sind Proteinkügelchen, die gebildet werden, wenn das Protein während der Synthese keine Zeit zum Falten hat (d. H. Seine normale lösliche Form annimmt), bevor es mit einem anderen ähnlichen nicht gefalteten Protein kollidiert. Ungefaltete Proteine ​​weisen fast immer herausstehende hydrophobe Flecken auf, mit deren Hilfe sie aneinander haften. Nachdem die beiden Eichhörnchen „zusammengeklebt“ sind, haben sie nicht mehr genügend Freiheitsgrade, um ihre Faltung abzuschließen. Dann schwimmt ein dritter, vierter, fünfter auf sie zu ... Als Ergebnis wird ein Proteinkörnchen gebildet. Normalerweise passiert dies, wenn wir eukaryotische Proteine ​​in Bakterien synthetisieren (wie ich bereits schrieb, kann das Bakterium sie nicht falten). Als Ergebnis haben wir eine Proteinmasse mit einer „schlechten“ räumlichen Struktur. Aber jede Wolke hat einen Silberstreifen, weil am Ende Granulate gebildet werden, die fast ausschließlich aus dem Protein bestehen, das wir brauchen!
  
  Da in diesem Fall unser Protein unlöslich ist, befindet es sich beim Zentrifugieren zusammen mit dem "Müll" im Sediment. Wir verwerfen den Überstand und dann werden die Körper im Sediment wie folgt von allem Unnötigen gewaschen:
  
  1. Der Waschpuffer Nr. 1 wurde gegossen, in dem die "Müllkomponente des Sediments Nr. 1" gelöst war;
  2. Rühre den Niederschlag glatt und lege ihn auf einen Schüttler (ein Gerät, das schüttelt).
  3. Der Überstand wurde zentrifugiert und gegossen. Als Ergebnis wurde das, was in Waschpuffer Nr. 1 gelöst war, vom Niederschlag abgetrennt;
  4. Der Waschpuffer Nr. 2 wurde gegossen, in dem die "Müllkomponente des Sediments Nr. 2" gelöst war;
  5. Gut und so weiter. In der Regel sind insgesamt ca. 5 Wäschen erforderlich.
  
  Ich möchte Sie noch einmal daran erinnern, dass es sich bei Einschlusskörpern um ein ungefaltetes Protein handelt, was bedeutet, dass es die darin festgelegten Funktionen nicht erfüllen kann. Daher wird es vor der anschließenden Reinigung wieder gefaltet, dh in aktive Form gebracht. Die gebräuchlichste Rückfaltungsmethode besteht aus den folgenden Schritten:
  
  1. Lösen Sie die Körper unter "unphysiologischen" Bedingungen auf. Typischerweise lösen sich die Körper bei hohem pH-Wert (etwa 12) in Gegenwart von bipolarem Harnstoff gut auf. Die Idee dieser Methode ist, dass es bei hohem pH-Wert im Medium nur sehr wenige Protonen gibt und jeder, der sie loswerden könnte, dies leicht tun kann. Das Proton ist positiv geladen, was bedeutet, dass alle Protonendonoren eine negative Ladung erhalten, und dann tut das Coulombsche Gesetz alles - die Proteine ​​mit einer großen negativen Ladung beginnen sich gegenseitig abzustoßen;
     
  2. Tropfen für Tropfen das gesamte Volumen der „Proteinlösung“ aus dem ersten Absatz zu einem viel größeren aktiv gemischten Volumen des Puffers unter Bedingungen hinzufügen, die für das Protein angenehm sind. Die Idee dieses Stadiums ist, dass er bei einer niedrigen Proteinkonzentration viel wahrscheinlicher faltet, bevor er sein entfaltetes Gegenstück trifft. Typischerweise wird der Tröpfchentransfer einer Proteinlösung in Puffervolumina durchgeführt, die das Volumen der Lösung selbst um mindestens das Zehnfache überschreiten.

Wir sind also bereit für einige Volumina von Proteinlösungen in gefaltetem Zustand. Das weitere Verfahren ist für alle "Anfangsbedingungen" gleich - wir filtern unsere Lösungen durch Filter mit einer Porengröße von 100-450 nm (um die Chromatographiesäulen und den Chromatographen selbst nicht zu verstopfen) und führen dann die Chromatographie durch.

Chromatographietypen

Das Prinzip jeder Chromatographie besteht darin, dass sich die verschiedenen Komponenten der Lösung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule bewegen. Infolgedessen kommen die Komponenten, die „am Eingang der Säule“ waren, zu unterschiedlichen Zeiten zum Ausgang.

Aber zuerst erinnern wir uns an eine andere Methode - die Proteinelektrophorese in einem Gel.

Diese Methode ermöglicht die Trennung von Proteinen nach ihrer Masse. Dazu wird der Probe ein Puffer zugesetzt, der SDS und einen Farbstoff (üblicherweise Bromphenolblau) enthält. Gleichzeitig ist die Dichte des Puffers höher als die Dichte des Wassers. Dies geschieht, damit die Mischung aus Probe und Puffer leichter in die Vertiefungen auf dem Gel gegeben werden kann. Der Farbstoff wird hinzugefügt, um das Verfahren zum Einbringen der Probe in die Vertiefung zu steuern, und er dient auch als Indikator dafür, dass es Zeit ist, die Phorese zu beenden: Die Farbe bewegt sich schneller als das Protein. Wenn sie das Ende des Gels erreicht, wird die Phorese gestoppt. Dies ist sehr praktisch, da wir die Bewegung des Proteins entlang des Gels nicht sehen.


SDS-PAGE-Elektrophorese. Es ist besser, einmal zu lesen und zu sehen, als hundertmal zu lesen. Ein Molekulargewichtsmarker wird auf die erste Vertiefung auf Foresic im Video angewendet, und die untersuchten Proben werden auf die verbleibenden Vertiefungen aufgebracht.

SDS ist eine Schlüsselkomponente: Dieses negativ geladene Detergens (Tensid) denaturiert die Proteine, wonach es sie „umgibt“, und es stellt sich heraus, dass die Anzahl der am Protein anhaftenden SDS-Moleküle direkt proportional zu seiner Masse ist. Aus dem Coulomb-Gesetz folgt dann, dass ohne jeglichen Bewegungswiderstand alle von SDS-Molekülen umgebenen Proteine ​​im elektrischen Feld die gleichen Beschleunigungen aufweisen würden (die Kraft wächst linear mit zunehmender Ladung, aber die Masse wächst auch linear mit der Ladung).


Wirkungsschema des negativ geladenen Detergens SDS auf Protein. Zuerst prangert er es an und „umhüllt“ es dann. Infolgedessen besteht das Protein in einer negativ geladenen Hülle aus SDS, deren Ladung direkt proportional zur Masse des Proteins ist.

Und hier hilft uns PAAG (PAAG - Polyacrylamidgel). Während der Polymerisation bildet es ein Netzwerk von Kanälen mit ungefähr gleichem Durchmesser, durch die sich kleine Objekte ceteris paribus schneller bewegen als große. Offensichtlich ist schweres Protein größer als leicht, daher bewegen sich leichte Proteine ​​schneller.

Nach Abschluss des Elektrophoreseverfahrens wird das Gel gefärbt. Genauer gesagt sind die Stellen, an denen sich das Protein im Gel befindet, gefärbt - blaue Streifen (oder schwarze, je nachdem, was gemalt werden soll) werden erhalten. Um zu verstehen, welcher Masse die eine oder andere Bande entspricht, müssen Sie sie mit etwas vergleichen, damit das sogenannte Gel auf jedes Gel aufgetragen wird. "Molekulargewichtsmarker" ist eine Mischung von Komponenten mit bekannten Massen.


Ein Beispiel für Molekulargewichtsmarkerstreifen. Dieser Marker ist auch insofern praktisch, als seine beiden Streifen in einer einzelnen Farbe lackiert sind: Rot (70 Kilodalton) und Grün (10 Kilodalton). Dies hilft dem Experimentator, im Marker selbst zu navigieren. 1 Dalton, eine atomare Masseneinheit, ist definiert als 1⁄12 der Masse eines frei ruhenden Kohlenstoffatoms-12, das sich im Grundzustand befindet.

Es scheint ein Wunder zu sein, keine Methode - die Streifen überlappen sich nicht, was bedeutet, dass die Proteine ​​perfekt aufgeteilt sind! Tatsächlich haben Wissenschaftler jedoch nicht gelernt, wie man Proteinelektrophorese im industriellen Maßstab durchführt, und deshalb verwenden wir immer noch Säulenchromatographie.


Ein ungefähres Schema jeder Chromatographie. Die Säule ist ein Zylinder, der mit etwas gefüllt ist. Dieses „Etwas“ wird als „stationäre Phase“ bezeichnet, und die „mobile Phase“ ist die Lösung, deren Komponenten wir trennen müssen. Die Komponenten bewegen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und verlassen daher die Säule separat.

Die meisten chromatographischen Techniken basieren auf der Tatsache, dass Eichhörnchen, die vorbeikommen, sich „mit unterschiedlicher Begeisterung“ an einen stationären Säulenfüller klammern: diejenigen, die häufig „klammern“ und sich viel langsamer bewegen als alle anderen, und diejenigen, die sich an nichts „klammern“, verlassen die Säule schnell. Infolgedessen verlässt ein wesentlicher Teil der Mischung häufig die Säule, ohne sich daran zu "verfangen" - sie treten zu Beginn der Chromatographie zusammen aus (diese Fraktion wird als "Schlupf" bezeichnet, da sie durch die Säule rutschten, ohne sich daran zu "verfangen"). Aber was tun mit denen, die "süchtig" sind?

Lassen Sie uns zunächst herausfinden, was in der Spalte mit denen passiert, die sich „festhalten“. Der "Haken" selbst tritt auf, weil sich auf der Oberfläche der stationären Phase etwas befindet, das in der Lage ist, ein vorbeiziehendes Protein vorübergehend "einzufangen" (darüber, wie dies geschieht, etwas niedriger). Das heißt, das "anhaftende" Protein verbringt einige Zeit in dem mit der festen Phase verbundenen Zustand, bricht dann von ihm ab (aufgrund seiner eigenen thermischen Bewegung, Kollisionen usw.), schwimmt weiter, bindet wieder an die feste Phase, bricht wieder ab und so weiter bis er die Säule verlässt. Es ist klar, dass je öfter und stärker es an die stationäre Phase bindet, desto langsamer bewegt es sich entlang der Säule.


Das Prinzip der Chromatographie. Was nicht an die Säule bindet (Schlupf), bewegt sich mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase (angepasst an die Größe). Die Bindungskomponenten haben unterschiedliche Geschwindigkeiten, was zu ihrer Trennung am Ausgang führt.

Im Allgemeinen gibt es nur bei viel Pech in der Mischung verschiedene Komponenten, die sich mit der gleichen Geschwindigkeit bewegen, sodass wir einfach warten können, bis sie die Säule verlassen. Aber oft wird nur sehr lange gewartet, da sich die Komponenten langsam bewegen. In diesem Fall müssen sie "angepasst" werden, und die Art und Weise, wie sie "angepasst" werden, hängt vom Spaltentyp ab.

Lassen Sie uns abschließend die chromatographischen Methoden selbst untersuchen, die für die industrielle Herstellung von Weiß geeignet sind.

1. Ionenaustauschchromatographie. Die Idee des Verfahrens ist, dass die stationäre Phase unter den Bedingungen der Chromatographie eine Ladung aufweist. Wenn die Ladung positiv ist, sprechen sie von "Anionenaustauschchromatographie", wenn negativ, dann von "Kationenaustausch".
   
   Die Logik des Namens ist einfach. Nehmen wir als Beispiel einen Anionenaustauscher: Negativ geladene Komponenten des Gemisches „haften“ an der positiv geladenen festen Phase der Säule. Wenn wir einer bestimmten positiv geladenen Gruppe auf der Oberfläche der festen Phase folgen, bleiben die eine oder andere negativ geladene Komponente daran haften und lösen sich. Somit findet eine Art Anionenaustausch zwischen der stationären und der mobilen Phase statt, daher der Name "Anionenaustauschchromatographie".
   
   Wenn wir Anionenaustauschchromatographie verwenden wollen, müssen wir natürlich die Trennung des Gemisches unter solchen Bedingungen durchführen, unter denen die feste Phase positiv geladen ist. Darüber hinaus haben wir die Wahl zwischen zwei Optionen für die weitere Entwicklung von Ereignissen, je nachdem, welche Ladung das Protein unter diesen Bedingungen hat: Wenn "-", dann "setzt" es sich auf die Säule und wenn "+", wird es im Schlupf sein.
   
   Wie kann die Ausgabe verwandter Komponenten beschleunigt werden, dh wie wird eine "Elution" durchgeführt? Sie können auf zwei Arten handeln:
   
   • Sie können die Ladung der stationären Phase und der gebundenen Komponenten ändern, indem Sie den pH-Wert der mobilen Phase ändern. Es ist wichtig, den pH-Wert schrittweise zu ändern, damit die Komponenten ihre Bewegung beschleunigen, aber nicht gleichzeitig auf einmal „herausfallen“.
     
   • Fügen Sie der Spalte weitere Anionen hinzu. In der Tat hat die Säule eine endliche Anzahl von Stellen, an denen Anionen haften können, und wenn wir alle diese Stellen mit etwas besetzen, bewegen sich die Komponenten der Mischung schneller. Für die Anionenaustauschchromatographie ist die Zugabe von Chloranionen typisch. Die Einführung konkurrierender Anionen sollte ebenfalls schrittweise erfolgen.
   
   Das Verfahren zur Kationenaustauschchromatographie ist im Allgemeinen das gleiche, nur das Gegenteil.
   
   
   
   
   Kationenaustauschchromatographie mit Elution aufgrund einer Änderung des pH-Wertes der mobilen Phase.
   1 - bei pH = 2 befinden sich viele Protonen in der mobilen Phase, daher wurden alle Komponenten des Gemisches aus der Flüssigkeit aufgenommen, während eine positive Ladung erhalten wurde;
   2 - bei pH = 5 nahm die Anzahl der Protonen in der mobilen Phase ab und die "violette" Komponente wirkt nicht mehr als Akzeptor, sondern als Protonendonor. Daher ist die Ladung bei diesem pH-Wert negativ und verlässt die Säule. Die "grüne" Komponente wirkt immer noch als Protonenakzeptor und behält bei einem bestimmten pH-Wert eine positive Ladung bei, was bedeutet, dass sie immer noch an der Säule festhält.
   3 - bei pH = 9 befinden sich nur sehr wenige Protonen in der mobilen Phase, die „grüne“ Komponente wird ebenfalls zum Protonendonor, erhält eine negative Ladung und verlässt zuletzt die Säule.
   
   Im Allgemeinen hängt die Wahl des Ionenaustauschertyps und der Bedingungen für die Trennung davon ab, was wir isolieren möchten und was sich sonst noch in unserer Mischung befindet.
   
2. Ein anderes Trennverfahren basiert auf der Hydrophobizität (~ Nichtpolarität) und Hydrophilie (~ Polarität) bestimmter Substanzen. Die Idee ist hier genau die gleiche wie im Fall des Ionenaustauschers: Entsprechend ihren physikalischen Eigenschaften „rasen“ die Komponenten zwischen den hydrophoben und hydrophilen Medien, einige verweilen mehr, andere weniger.
   
   Zunächst möchte ich Sie daran erinnern, dass sich unpolar in unpolar und polar in polar auflöst. Oft sind "hydrophob" und "unpolar" ein und dasselbe wie "hydrophil" und "polar", obwohl dies im allgemeinen Fall nicht der Fall ist. Ethanol ist ein Beispiel für ein unpolares Lösungsmittel und Wasser ist ein Beispiel für ein polares.
   
   
   
   
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