In jüngerer Zeit, im Jahr 2016, gehörte die unbestrittene Führungsposition auf dem Markt für Genomsequenzierung den Vereinigten Staaten. Genauer gesagt die amerikanische Firma Illumina , die eine Reihe von fluoreszierenden Sequenzern entwickelte.
Abb. 1. Illumina Fluorescent Sequencer
( Illumina Investor Presentation, 18. August 2017 )
Die Verbesserung dieser Geräte und die von ihnen verwendete Fluoreszenztechnologie ermöglichten es bis Mitte 2016, die Kosten für die Sequenzierung des menschlichen Genoms auf 1000 USD zu senken.
Den zweiten Platz im Jahr 2016 belegte das amerikanische Unternehmen Thermo Fisher Scientific , das die Halbleiter-DNA-Sequenzierungstechnologie entwickelt. Trotz ihrer relativ bescheidenen Leistung (bis zu 12 GB) konkurrierte ihr Ion S5-Sequenzer in der Nische der gezielten (klinischen) Sequenzierung durchaus mit den Desktop-Sequenzern von Illumina .
Abb. 2. Ion S5 Semiconductor Sequencer
Im September 2017 gab BGI den Beginn der Annahme von Anträgen auf Genomsequenzierung für 600 US-Dollar bekannt, was China sofort zu den führenden Anbietern von Genom-Rennen führte. Dieser Durchbruch wurde durch die Schaffung von CNGB (China National GeneBank) ermöglicht, einem wichtigen Zentrum mit 150 fluoreszierenden chinesischen BGISEQ-500-Sequenzierern.
Abb. 3. Im CNGB-Computerraum
http://www.presstv.com/Detail/2016/09/22/485893/China-national-gene-bank
Die Leistung eines amerikanischen NovaSeq 6000 entspricht der Leistung von 50 ... 60 chinesischen BGISEQ-500. Das bislang größte Sequenzierungszentrum ist daher das chinesische Unternehmen Novogene , das Anfang dieses Jahres 25 NovaSeq 6000 auf einmal erworben hat. Ihre Gesamtproduktivität beträgt etwa eine Viertelmillion Genome pro Jahr. Die Zahl ist beeindruckend, aber wenn jährlich 0,3 Millionen Genome sequenziert werden (~ 0,05 Millionen in CNGB plus ~ 0,25 Millionen in Novogen ), werden 100 Millionen Genome im Rahmen des im letzten Jahr gestarteten China Precision Medicine-Programms sequenziert Initiative “(2016 ... 2030, 9,2 Milliarden US-Dollar) wird mehr als 300 Jahre dauern. Und um die Fristen einzuhalten (bis Ende 2030), müssen die Chinesen mehrere Dutzend solcher Zentren bauen und mit Sequenzern ausstatten.
Anfang 2017 wurden die MiniION Nanion Porensequenzierer MinION zum Verkauf angeboten und im Mai GridION X5, entwickelt von Oxford Nanopore Technologies (ONT, UK). Das produktivste Modell (PrometION) wird an mehreren Genomzentren Beta-Tests unterzogen und sollte in den kommenden Monaten verfügbar sein.
Abb. 4. ONT-Nanoporen-Sequenzer
Die relativ geringe Genauigkeit der Nanoporensequenzierung (~ 90% für einen einzelnen Messwert) ermöglicht es diesen Geräten nicht, mit fluoreszierenden Sequenzierern (Genauigkeit ~ 99,9% für einen einzelnen Messwert) bei der Bestimmung von Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) zu konkurrieren, sondern mit der langen Leselänge (> 10.000 bp) machen sie unverzichtbar für die Abbildung von Polymorphismen wie Copy Number Variations (CNVs). Darüber hinaus können Nanoporen-Sequenzer Viren und Bakterien gut identifizieren, ihre Arzneimittelresistenz, Transkriptomanalyse, HLA-Typisierung, Vaterschaftsfeststellung und viele andere gezielte Sequenzierungsaufgaben bewerten, um erfolgreich um diese NGS-Marktnischen (Next Generation Sequencing) zu konkurrieren .
Eingriffe in die genomische Rasse Chinas und Großbritanniens haben den Wettbewerb verschärft. Dies hat die Preise für die gezielte Sequenzierung noch nicht beeinflusst, aber die Kosten für die Sequenzierung des menschlichen Genoms sind im vergangenen Jahr um 40% gesunken (von 1000 USD auf 600 USD).
Sollte Russland am Genom-Rennsport teilnehmen oder ist es einfacher, auf billige chinesische, englische oder amerikanische Sequenzer zu warten? Aber eine solche Erwartung kann herausgezogen werden. Und es ist eine Schande für den Staat. Dies bestimmt die Relevanz der Prüfung der Möglichkeit der Entwicklung eines Haushaltssequenzers und seiner Bereitstellung von Verbrauchsmaterialien und Reagenzien.
Das Hauptziel einer solchen Entwicklung ist es, „Amerika einzuholen und zu überholen“ (sowie China, Großbritannien, Südkorea, Australien, Saudi-Arabien usw.). Oder zumindest einfach aufholen. Oder holen Sie nicht einmal auf, sondern versuchen Sie einfach, die Sequenzierung in Russland zugänglicher zu machen. Zuallererst, um eine Importsubstitution von mindestens einem Teil der Verbrauchsmaterialien und Reagenzien zu erreichen. Es wird schwieriger sein, Sequenzer zu kopieren. Man kann aber nicht nur ausländische Entwicklungen kopieren, sondern versuchen, sie zu verbessern. Und wenn Sie sich nicht verbessern, reduzieren Sie zumindest die Kosten. Die Aufgabe ist nicht zu ehrgeizig, aber machbar.
Eines der Projekte dieser Art wurde von vier Instituten der Sibirischen Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften (2012 ... 2014) entwickelt, die erfolglos versuchten, die SMRT-Sequenzierungstechnologie ( Pacific Bioscience , USA) zu beherrschen. Wir können auch zwei Versuche erwähnen, eine monomolekulare Sequenzierungstechnologie basierend auf Raman-Spektroskopie zu entwickeln - in Chernogolovka ( InSpektr LLC , 2010 ... 2012) und Zelenograd ( Nano Vizhin LLC , 2013 ... 2014). - Und über das ZeSenograd-Projekt RuSeq zur Verbesserung der tSMS-Technologie ( Helicos , USA).
Es ist klar, dass bei der Auswahl der zu beherrschenden NGS-Technologien (kopiert / verbessert / "geschreddert") die Aussichten für ihre Entwicklung berücksichtigt werden müssen. Und angesichts der äußerst begrenzten Möglichkeiten, diese Aussichten nur für die drei fortschrittlichsten Technologien zu bewerten - Fluoreszenz, Halbleiter und Nanoporen.
Fluoreszenztechnologie
In diesem Fall sind Sequenzer Präzisions-Scanning-Epifluoreszenzmikroskope, die mit einem Reagenzienversorgungssystem für Durchflusszellen ausgestattet sind. Ein charakteristisches Merkmal der neuesten Modelle ist die geordnete Anordnung von Submikron-DNA-Clustern ( Illumina , NovaSeq 6000) oder DNA-Nanobällen ( BGI , BGISEQ-500) in Einweg-Durchflusszellen.
Solche Mikroskope in Russland müssen hauptsächlich aus importierten Komponenten zusammengebaut werden, daher kosten sie nicht billiger als ihre chinesischen Kollegen. Diese Analoga sind zwar noch nicht verkauft, aber in 2 ... 3 Jahren werden sie höchstwahrscheinlich bei uns erhältlich sein. Daher ist es besser, sich nicht auf die Entwicklung fluoreszierender Sequenzierer zu konzentrieren, sondern auf die Entwicklung der Produktion ihrer verbrauchbaren Komponenten und Reagenzien - Durchflusszellen und markierte Nukleotide. Es sei denn natürlich, fluoreszierende Technologien werden in einigen Jahren durch Lumineszenztechnologien ersetzt. Darüber hinaus kann ein solcher Ersatz im Jahr 2018 beginnen.
Lumineszenz wurde bereits in NGS verwendet, einer Pyrosequenzierungstechnologie, mit der 454 Life Sciences das erste einzelne menschliche Genom lesen konnte (Project Jim, 2005 ... 2007). Diese Technologie, die auf der Biolumineszenzregistrierung (Luciferase) der Pyrophosphatbildung basiert, ist mittlerweile veraltet. Die Lumineszenz ist jedoch leichter zu bestimmen als die Fluoreszenz. Daher entwickelt Illumina seit langem eine Lumineszenz-Sequenzierungstechnologie (das „Firefly“ -Projekt).
Ein Lumineszenz-Sequenzer ist möglicherweise nicht schlechter, aber viel billiger als fluoreszierende Desktop-Sequenzer MiniSeq und MiSeq, weshalb seine Entwicklung sehr langsam voranschreitet. Kürzlich wurden jedoch auf der ASHG 2017 (17 ... 21.10.2017) der fertige Firefly-Sequenzer sowie die für seinen Betrieb erforderlichen Durchflusszellen (Chips) und Reagenzienpatronen demonstriert.
Abb. 5. Illumina Firefly Fluorescent Sequencer
https://twitter.com/illumina
Das Hauptproblem bei der Orientierung an der Lumineszenztechnologie wird weniger die Entwicklung des Geräts als vielmehr die Beherrschung der Synthese der für seinen Betrieb erforderlichen verbrauchbaren Reagenzien sein - Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP) mit Markierungen, die Photonen erzeugen können. Darüber hinaus sollten diese Markierungen mit leicht spaltbaren Linkern, die Azidomethylgruppen enthalten, an Nukleoside gebunden sein.
Ein wichtiges Merkmal von Azidomethylderivaten von DNTFs, deren Synthese von russischen Wissenschaftlern (IBCh RAS) in den frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts entwickelt wurde, ist ihre relativ hohe Stabilität, kombiniert mit der Einfachheit und Geschwindigkeit der Freisetzung bei der Verarbeitung von DNA-Clustern (oder DNA-Nanobällen) mit einer Tris-Lösung (2-Carboxyethyl) phosphin (TCEP). Es war die Komplexität der Synthese solcher Reagenzien, die Illumina bis vor kurzem vor Wettbewerbern schützte, und die Entwicklung ihrer Produktion ermöglichte es China, Amerika einzuholen und zu überholen.
Können russische Chemiker die Synthese solcher Reagenzien beherrschen? Nach den Zusammenhängen in Illuminas Patenten zu urteilen, war dies in den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts kein Zweifel. Und jetzt gibt es in Russland 3 ... 4 Gruppen von Chemikern, die in der Lage sind, eine solche Aufgabe zu bewältigen (IHBFM SB RAS, Synthol LLC, IBCh RAS, IMB RAS).
Halbleitertechnologie
Thermo Fisher Scientific hat Milliarden von Dollar in die Anschaffung der Halbleiter-Sequenziertechnologie investiert. Jetzt erfordert die Verschärfung des Wettbewerbs einen starken Preisverfall, und es ist unwahrscheinlich, dass die ausgegebenen Milliarden, insbesondere mit Gewinn, zurückgegeben werden können. Entwickler von Drittanbietern kümmern sich nicht um solche Probleme, daher bleibt die Halbleitertechnologie für sie attraktiv. Vor allem, wenn Sie vorgefertigte pH-Sensor-Chips verwenden können, deren Entwicklung für Millionen von Dollar ausgegeben wurde.
Abb. 6. S5 Semiconductor Sequencer pH-Sensor-Chips
Die Kosten dieser Chips sind zumindest um eine Größenordnung überbewertet. Und Sie können sie (laut den Entwicklern) nur einmal verwenden. Trotzdem haben es einige Handwerker geschafft, sie mehr als zehn Mal einzusetzen, und dies ist eindeutig nicht die Grenze. Daher besteht die Hauptaufgabe zur Verbesserung (Reduzierung der Kosten) der Halbleitersequenzierungstechnologie darin, die Regeneration der verwendeten pH-Sensorchips zu beherrschen.
Der für eine solche Regeneration notwendige Prototyp der Vorrichtung wurde bereits entwickelt. Genauer gesagt wurde ein elektronisches System entwickelt, das Informationen von pH-Sensorchips liest und deren Qualität kontrolliert.
Abb. 7. Selbst gemachter Halbleiter-Sequenzer
https://www.youtube.com/watch?v=eojg02AUAxw
Wenn Sie die Geschwindigkeit und Auflösung des ADC erhöhen, kann ein solches Lesegerät als elektronisches Subsystem des inländischen Halbleitersequenzers verwendet werden. Es ist wahr, dass es immer noch mit einem Reagenzienversorgungssystem ausgestattet sein muss. Und beherrschen Sie die Herstellung der gleichen Reagenzien. Bei einem starken Wunsch (und einer guten Finanzierung) sind keine besonderen Probleme damit zu erwarten.
Das Problem ist, dass all diese Entwicklungen und ihre Modifikationen 2 ... 3 Jahre dauern werden und sich in dieser Zeit viel ändern kann. Beispielsweise kann die Genauigkeit und Produktivität der Nanoporensequenzierung verbessert werden. Infolgedessen werden alle Bemühungen der "Halbleiter" -Konkurrenten vergebens sein.
Nanoporentechnologie
Der erste MinION-Nanoporen-Sequenzer ähnelt dem ersten Pfannkuchen - er ist bereits „essbar“, aber die nächsten sollten viel besser sein. Seine Lesegenauigkeit ist nur zufriedenstellend und selbst dann nicht für alle Anwendungen. Die Produktivität reicht für die Genomsequenzierung eindeutig nicht aus, da für jedes Genom mindestens fünf einmalige Zellen im Wert von 500 bis 900 US-Dollar (abhängig von ihrer Menge in der Reihenfolge) ausgegeben werden müssen.
In die MinION-Zellen sind Chips eingebaut, die Signale (Picoampere-Ströme) von 512 Nanoporen verstärken und digitalisieren. GridION X5 arbeitet gleichzeitig mit fünf derselben Zellen, aber in den Zellen für PromethION wird die Anzahl der analysierten Nanoporen um das Sechsfache erhöht (bis zu dreitausend). Dadurch kann das menschliche Genom in einer Zelle sequenziert werden. Richtig, mit geringer Qualität, aber mit langen Lesevorgängen, was ihre genaue Montage erleichtert. Und es ergänzt gut die kurzen (2x150 oder 2x100), aber genauen (> Q30) Messwerte, die von fluoreszierenden Sequenzern erhalten werden. Daher kann die Nanoporensequenzierung bei PomethION die Fluoreszenz ergänzen, aber nicht mit ihr konkurrieren. Wenn Zellen der nächsten Generation nicht Tausende, sondern Zehntausende oder Hunderttausende von Nanoporen enthalten, erhöht ihre Verwendung zwar die Häufigkeit des Lesens von DNA, verbessert die Qualität der Daten und ermöglicht es genomischen Nanoporen-Sequenzierern, auf dem NGS-Markt erfolgreich mit fluoreszierenden Sequenzierern zu konkurrieren.
Für die meisten Aufgaben der gezielten Sequenzierung ist die Leistung von MinION (5 ... 10 Gb) deutlich zu hoch. Daher plant ONT die Einführung von MinION Dx (oder FLONGLE), einer MinION-Modifikation mit einem Adaptereinsatz für 128- oder 256-Poren-Zellen.
Abb. 8. Sequenzer FLONGLE
Einwegzellen für FLONGLE können viel billiger sein, da ihre Elektronik in einem wiederverwendbaren Adaptereinsatz untergebracht ist, mit dem sie durch ein Kontaktpad vom Typ LGA (Land Greed Array) verbunden sind.
Ein weiterer kompakter Nanoporen-Sequenzer (SmidgION), der an ein Smartphone (iPhone 7 ... X) angeschlossen ist, soll in den kommenden Monaten in den Handel kommen.
Abb. 9. Der erste "Gadget" -Sequenzer SmidgION
Eine kostengünstige und kostengünstige Nanoporen-Sequenzierung kann den gesamten NGS-Markt (und gleichzeitig die Welt) verändern. Diese Fähigkeit wird sich jedoch erst nach dem Erscheinen würdiger Konkurrenten voll entfalten. Ein solcher Konkurrent könnte Roche Sequencing sein , das seit 2014 eine eigene Nanoporen-Sequenzierungstechnologie entwickelt. Nach einigen Veröffentlichungen und Nachrichten im Internet zu urteilen, könnten bald andere Konkurrenten erscheinen.
Es wäre schön, ähnliche Konkurrenten auch in Russland zu haben, aber die Entwicklung von Sequenzern, insbesondere von Nanoporen, wurde nicht in die Liste der „Priority Directions for the Development of Science, Technology and Technology in der Russischen Föderation“ aufgenommen, die durch Dekret des Präsidenten der Russischen Föderation Nr. 899 vom 7. Juli 2011 genehmigt wurde. Daher können wir nur auf Geeks hoffen, die Halbleitersequenzer in ihrer eigenen Küche oder Elektronenmikroskope in persönlichen Garagen entwickeln . Ohne Hacker, die MinION-Software hacken können, ist dies nicht möglich. Tatsache ist, dass dieser Sequenzer nur funktionieren kann, wenn Sie eine Internetverbindung haben. Und jeder autonome Start muss mit den Entwicklern koordiniert werden. Aber es gibt seltsamere "Probleme". Zum Beispiel:
• Jedes Gerät und jede Durchflusszelle ist an einen bestimmten Benutzer gebunden, hinter dem sich die tatsächliche Adresse des Labors befindet, in dem er arbeitet und Forschung betreibt. Gleichzeitig kann Oxford Nanopore Technologies Informationen über den Standort jedes Geräts erhalten.
• Sanktionsrichtlinien: Oxford Nanopore Technologies überprüft jede Organisation und jeden neuen Endbenutzer, bevor Produkte geliefert werden.
• Um nicht auf der Versandliste zu stehen, ist es Labors untersagt, Produkte von Oxford Nanopore Technologies an Dritte zu übertragen.
Interessanterweise weigerte sich ONT gemäß der oben genannten „Liste der verbotenen Schifffahrtslabors“ kürzlich, MinION an „militarisierte“ Organisationen wie die Moscow State University und die St. Petersburg State University zu verkaufen.
In dieser Hinsicht besteht die erste Priorität für Russland im Bereich der Nanoporen-Sequenzierung darin, die vom MinION-Sequenzer verwendete Software zu hacken.
Die nächste Aufgabe ist das Reverse Engineering der Zellen dieses Geräts. Und schließlich - die Entwicklung der Bildung von Doppelschicht-Lipidmembranen in ihnen mit eingebauten Ionenkanälen, die für die Nanoporen-DNA-Sequenzierung geeignet sind. Es ist besser, nach Biohackern (Biophysikern, Molekularbiologen, Gentechnikern usw.) für solche Arbeiten an anderer Stelle zu suchen, aber hier bei Geektimes möchte ich die Probleme des Software-Hacking und des Reverse Engineering mit Hackern und Geeks diskutieren, die sich mit Elektronik auskennen.
Für Fragen, Kommentare und Vorschläge wäre ich dankbar.
Mit freundlichen Grüßen, genseq