Im Allgemeinen haben wir die Philippinen bestiegen und nach gerissenen Bakterien gesucht. Dann gingen wir mit Chemikern nach Island und sie sprachen über die Expeditionen von Biologen in die Berge für thermophile Bakterien (die in der Nähe von heißen Quellen leben) - und es stellte sich heraus, dass diese ganze Geschichte für die Polymerasekettenreaktion benötigt wurde. Es wurde für mich sehr interessant, welche Beziehung das Labor zu Blutuntersuchungen zur geothermischen Quelle hat, und jetzt werde ich Ihnen diese aufregende Geschichte erzählen.
Dies bedeutet, dass Rospotrebnadzor und die Fernöstliche Bundesuniversität gestern in Wladiwostok ein PCR-Schulungszentrum eröffnet haben. Ich fuhr zusammen mit Reportern dorthin und fand normale verrückte Wissenschaftler, die alles an den Fingern erklärten. Denn genau das werden sie dort tun - um Vietnamesisch und Chinesisch zu unterrichten. Grundsätzlich - lernen Sie mit Bio-Bedrohungen umzugehen.
Was ist PCR?
Dies ist eine Geschichte darüber, wie man aus einem einzigen DNA-Molekül mehrere Millionen genau gleich macht.
Grundsätzlich handelt es sich um eine dreistufige Reaktion: DNA in separate Helices aufdrehen, dann den Anfang und das Ende der gewünschten Stellen suchen und markieren und dann die markierten Moleküle mit Hilfe der Polymerase vervollständigen. Das heißt, es ist ein solcher Simulator der DNA-Replikation in unserem Körper, der nur in vitro durchgeführt wird. Und extrem schnell.
Das heißt, wir schneiden die gesamte DNA in Hälften, wir finden nur die Hälften des Pathogens, markieren sie, dann baut sich die Polymerase zu den markierten Paaren auf. Wir wiederholen. Wir wiederholen.
Die moderne Reaktion verdoppelt alle 40 Sekunden die DNA-Menge im Kolben. Genauer gesagt ist die Zykluseffizienz etwas geringer - von 78% auf 99%, weil nicht alles und in der realen Welt nicht immer miteinander verbunden ist.
Warum wird das benötigt?
Wenn ein Krankheitserreger in Ihrem Blut schwimmt, können Sie eine spezielle Reaktion darauf aufbauen, die die DNA verstärkt (die Menge erhöht). Irgendwann werden so viele davon im Gebräu sein, dass Sie es bemerken können. Und hier wird der Roboter schreien: "Ja, ich habe es!" Und das Ergebnis wird "positiv" sein.
Als Starter benötigen wir im Allgemeinen nur 50 Moleküle pro Milliliter. Zum Vergleich: Das Grippevirus befindet sich nicht einmal im Blut, sondern im Speichel des Patienten mit den ersten Symptomen - etwa 10.000 Stück pro Milliliter.
Warum wird das noch benötigt?
Sie können buchstäblich ein paar DNA von der Mumie der Pharao-, Mammut- oder Tigerhaut kaufen und sie mit dem Genom sequenzieren. Das heißt, es ist wirklich möglich, dies vollständig zu berücksichtigen, da Sie aus einer vernachlässigbaren Menge an Material für die Forschung viele DNA-Moleküle erhalten. Daher die Anwendung in der Forensik - Sie können feststellen, welcher der verstorbenen Könige für wen ein Sohn war. Oder durch ein Paar Speichelmoleküle am Tatort, um den Täter zu finden (direkt Gattaka). Oder noch cooler - Sie können Moleküle mit Veränderungen replizieren und erhalten eine kontrollierte Mutagenese. Letzteres ist jedoch schwierig.
Und PCR ist dieselbe Reaktion, die das soziale Verhalten der Gesellschaft verändert. Denn mit Hilfe davon wird die Vaterschaft bestimmt - Sie können nur verschiedene DNA-Abschnitte auswählen und bewerten, wo und was unterschiedlich ist (und wie viel), dh nach nahen Verwandten suchen. Nun, oder einfach die Unterschiede sequenzieren und bewerten.
Aber dann sprechen wir über die Diagnose von viralen und bakteriellen Infektionen - dies ist die am weitesten verbreitete Anwendung. Und hier unterrichten sie ihn in Wladiwostok.
Wie ist PCR im Allgemeinen?
Wir nehmen Material wie Blut oder etwas anderes. Wir bereiten das Medikament sorgfältig vor (normalerweise wird 1/3 des Materials eingenommen, so dass bei Fehlern in der Analyse bis zum Ende der Studie zwei weitere Dosen im Archiv verbleiben). Das Medikament wird mit einem Testsystem gemischt. In einen geschlossenen Kolben geben wir diese "Suppe" in die Vorrichtung zur Durchführung der Reaktion.
Als nächstes beginnen Zyklen des Abwickelns der DNA, der Anlagerung von Primern daran und der Ausrichtung vollständiger Moleküle unter Verwendung von Polymerase. Moderne Echtzeit-PCR-Methoden legen nahe, dass sich die gewünschten Markierungen ansammeln und leuchten. Dies ist fantastisch, da Sie das Röhrchen nicht öffnen müssen, um auf die Isolierung der gewünschten DNA-Sequenzen zu reagieren. Wenn das Leuchten aufgezeichnet werden kann, wird entschieden, dass die gewünschten Dehnungen in den Materialien waren.
Mit einigen weiteren Zyklen können Sie den Grad der Signaländerung beurteilen und die Hypothese aufstellen, wie viele DNA-Moleküle sich ursprünglich im Material befanden, dh mit ausreichender Genauigkeit, um die Konzentration des Erregers zu bestimmen.
Woher weiß der Primer, woran er sich festhalten soll?
Ein Primer ist eine Scheiße, die sich an das hält, was mit seinem Nukleotidcode übereinstimmt. Wenn Sie Tollwutvirus benötigen, müssen Sie es mit einem Genom sequenzieren (genauer gesagt, wir interessieren uns für den Anfang und das Ende der DNA) und die Stellen auf beiden Seiten des Moleküls aufzeichnen, an denen die Nukleotidketten einzigartig sind. Und Grundierungen für sie machen. Die Primer heften sich an die Hälften der DNA an und die Polymerase beginnt von oben zu arbeiten.
Dann haftet nichts an der DNA der Blutzellen, nur an der Tollwut.
Tollwutprimer haften nur an Tollwut. Um Ihre Kuh auf Tollwut und Grippe zu diagnostizieren, benötigen Sie zwei Blutdosen und zwei verschiedene Reaktionen.
Nun der lustige Teil. Wir brauchen nicht den genauen Anfang und das genaue Ende des DNA-Moleküls für die Diagnose. Wir brauchen nur viele erkennbare Seiten. Das heißt, auf dem gesamten Genom, beispielsweise der Vogelgrippe, müssen zwei einzigartige Fragmente unterschieden werden - der Beginn des Kopierens und das Ende des Kopierens. Damit zwischen ihnen etwas liegt, das eindeutig als Vogelgrippe ohne falsch positive und falsch negative Auslöser identifiziert werden kann.
Außerdem kommt die Mathematik ins Spiel - es ist notwendig, Orte zu unterscheiden, die für das Genom einzigartig sind, und so, dass sie sehr kurz sind, idealerweise von 15 bis 30 Nukleotiden. Und so ist zwischen ihnen das Richtige. Zwei Primer ergeben so etwas wie einen Hash aus einem DNA-Molekül, das heißt, sie ermöglichen die Beschreibung in 30-60 Nukleotiden.
In diesem Minimum sind ausreichend Stellen zur Erkennung und Primer gebunden. Wenn sie sich an etwas anderem festhalten, war es ein schlechtes Ziel, und die Genauigkeit sinkt.
Was haben die heißen Quellen damit zu tun?
Tatsache ist, dass die Reaktion bei hoher Temperatur stattfindet, andernfalls denaturiert die DNA nicht. Polymerase bei dieser Temperatur zerfällt normalerweise. Normalerweise - weil sie sich gerade bei thermophilen Bakterien ruhig Sorgen macht. Daher gab es im letzten Jahrhundert Expeditionen nach Kamtschatka, bei denen Geologen nach Mitteln für die molekulare Medizin suchten und Bären abfeuerten. Und in Europa fuhren sie nach Island.
Das Lustige ist, dass es 1976 und 1980 Veröffentlichungen über Polymerase gab (unsere und amerikanische), aber es schien jedem eine lustige Tatsache zu sein, und sie fanden keine praktische Anwendung.
Nun weiter. Es stellt sich heraus, dass die Taq-Polymerase aus Thremus aquaticus nach einem Protokoll wie UDP arbeitet, dh ohne Fehlerkorrektur. Im Allgemeinen. Sammelt, was passiert - und kommt dort alleine zurecht. Aber schnell.
Pfu- und Pwo-Polymerasen wurden aus Archaeen isoliert - sie arbeiten mit Fehlerkorrektur, dh sie ergeben keine Mutationen im Replikationsprozess (okay, fast nicht), aber sie wirken viel langsamer.
Früher wurden die Bestände dieses Durstes direkt aus Quellen entnommen, jetzt wird Polymerase in Laboratorien gezüchtet. Und sie machen eine knifflige Mischung aus Pfu, Pwo und Taq - es stellt sich blitzschnell und relativ korrekt heraus.
Wie sieht es in der realen Welt aus?
In der realen Welt haben Sie beispielsweise eine Schachtel mit Testsystemen mit der faszinierenden Aufschrift „Syphilis“. Oder die Grippe. Innerhalb eines Testsystems - alle Komponenten für die PCR, mit Ausnahme der DNA-Matrix, dh des Blutes des Patienten. Oder ein anderes Stück davon, wo der Erreger gesucht wird.
Als nächstes müssen Sie das Blut und das Testsystem mischen, viele Male unter Druck erhitzen und abkühlen, und der Katalysator, die Primer, die Polymerase und die Hilfskomponenten erledigen alles selbst. Die Ausgabe ist ein Reagenzglas mit 10 im zwölften DNA-Molekül pro Milliliter.
Kann man das in der Küche machen?
In der Theorie. Das Gerät selbst ist sehr einfach, die gesamte Hochtechnologie im Testsystem - und eine kleine Software, die die Änderung des Lichtsignals des Etiketts aufzeichnet. Benötigen Sie noch Temperaturgenauigkeit von 0,1 Grad und Programme für seine Änderung. Plus ein Fotosensor. Das heißt, Eisen ist nicht sehr komplex. Daher gibt es so viele dieser Labors - ihre Bereitstellung ist wirklich billig.
Aber in der Küche wird es nicht klappen, denn die schlimmste Geschichte ist die Kontamination der Probe (Verschmutzung). Reinheitsprotokolle werden mehr gelehrt als die Reaktionen selbst. Wenn eines der resultierenden Röhrchen mit Pathogen-DNA im Labor bricht, wird alles mit einer gleichmäßigen Schicht falsch positiver Ergebnisse bedeckt. Das heißt, alle aktuellen Analysen - sofort durch den Wald, dann eine lange Reinigung, Überprüfung, dann das Abrufen von archiviertem Blut und erneut der Start der Linie.
Nun, ich erinnere Sie daran, dass die DNA des Erregers und der Erreger selbst zwei verschiedene Dinge sind, wie der Quellcode und der kompilierte Code. Und die Gefahr, dass Sie ein Reagenzglas mit 10 in der zwölften DNA des Tuberkulose-Erregers zerbrochen haben, entspricht in etwa der Streuung einer Packung Blätter des Quellcodes, um einen Atomsprengkopf auf den Boden zu werfen.
4-7% der Ergebnisse können aufgrund schlampiger Arbeit und der Merkmale der realen Welt falsch positiv sein. Daher wird eine gründliche Überprüfung der Zuverlässigkeit des Ergebnisses insbesondere unter Verwendung mathematischer Methoden durchgeführt.
Zusammen mit herkömmlichen PCR-Materialien wird ein Reagenzglas mit Wasser unterworfen. Wenn sich dort etwas verstärkt, wird der Techniker an den Mandeln von den Händen gerissen.
Dies ist kein Safe, sondern ein Gateway für den Materialtransfer ins Labor. Das Personal wird nach dem Duschen, dem Umziehen und einigen weiteren Verfahren zur Herabsetzung der Menschenwürde in einem sauberen Bereich in das Labor gebracht.Wie können Sie verstehen, dass etwas mit der Reaktion nicht stimmt?
Durch die Art seiner Entwicklung. Die übliche Reaktion beginnt träge, dann die Phase des exponentiellen Wachstums, dann im Bereich der letzten Zyklen - Austritt zum Plateau. Die Menge an DNA nimmt mit neuen Zyklen aus Dutzenden von Gründen nicht zu, von der Primerverarmung bis zur Vervollständigung einer der Ressourcen, die Pyrophosphate akkumulieren. Außerdem schwimmen DNA-Hälften, die vor dem Schwimmen nicht reagiert haben, in der Suppe und umarmen sich gegenseitig. Als Ergebnis können Sie Artefakte und einen atypischen Reaktionsverlauf identifizieren - dies macht bereits Software für das Small Data Mining. Inland, kostenlos, regelmäßig aktualisiert, aber nicht Open Source.
Und warum müssen Sie die DNA-Menge im Medikament erhöhen, wenn Sie nur die Nachweismethoden verbessern müssen?
Es gibt einen solchen Entwicklungspfad. Physikochemische Methoden werden verbessert, aber bisher nicht genug. Die neueste Erfahrung - sie nahmen Blutplasma, zentrifugierte, "schwere" Viren fielen auf den Boden des Röhrchens. Dann wurden sie mit einem Lasermassenspektrographen gebraten. Nifiga. Es funktioniert mit Bakterienkolonien (sie machen das schon lange in Moskauer Labors), aber es funktioniert nicht mit Viren. Und die Kolonie muss noch angebaut werden. Daher wird die PCR bisher (und anscheinend in den nächsten zehn Jahren) die schnellste Analyse sein.
Eine vollständige Analyse erfolgt übrigens in ca. 45 Minuten (mit der Vorbereitung des Materials),
dh einem halben Tag
Cito oder 4 Tagen, wenn sich das Labor in der Stadt befindet und Sie im Dorf sind.
Bei einigen Infektionskrankheiten ist die Konzentration des Virus extrem niedrig. Zum Beispiel gab es einen Fall von Enzephalitis - der Arzt sah fokale Symptome (Schädigung des Zentralnervensystems), nahm Blut ab - selbst die PCR zeigt immer noch nichts und die Antikörper sind bereits eingesetzt. Das heißt, die PCR würde später als die Analyse von Antikörpern und die Massenspektrographie ein Ergebnis liefern - selbst später ist sie immer noch um Größenordnungen weniger genau als die PCR.
Das heißt, nur ein bestimmtes Genom wird amplifiziert?
Im Normalfall ja. Es wird der am weitesten fortgeschrittene Stamm der Krankheit gefunden, der für die Region relevant ist, und Primer zielen auf seine DNA ab. Dies ist jedoch eine etwas utopische Situation, da Sie gleichzeitig nach sechs Stücken verschiedener Sorten gleichzeitig suchen müssen. Zu diesem Zweck werden dem Set verschiedene Primer hinzugefügt und eine Reihe von Änderungen vorgenommen. Das Testsystem ist natürlich teurer. Oder Sie müssen mehrere Reaktionen für verschiedene Krankheitserreger durchführen.
Kann ich RNA multiplizieren?
Ja, Sie müssen nur DNA daraus machen. Die Reaktion ist komplexer, aber insofern interessant, als Sie tote Zellen von lebenden Zellen trennen können. DNA ist unglaublich stark, so dass sie sogar von einem Mammut abgezogen werden kann. Wenn das Virus bereits abgetötet wurde, "leuchtet" die DNA seiner toten Proben für weitere 3 Wochen. Und RNA wird viel schneller zerfallen. Daher sind NASBA-Methoden (z. B. Suche nach RNA-Viren) in einigen Fällen viel genauer. Aber viel teurer.
Noch ein paar schöne Dinge
Die gesamte Geschichte der PCR-Implementierung nach der Erfindung der Theorie ist direkt knifflige physikalische und chemische Probleme. Beispielsweise können unbekannte DNA-Abschnitte amplifiziert werden. Dazu wird das Molekül in einem bekannten Bereich geschnitten und anschließend die Reste zusammengeklebt. Einige drehen sich um und bilden am Anfang und am Ende Moleküle mit einem bekannten Code. Primer haften - und an solchen, bei denen es einen Anfang und ein Ende gibt und nicht nur einen Marker, wird eine Amplifikation durchgeführt.
Eine sehr lustige Geschichte, wie man unnötige Reaktionsschritte beim Erhitzen der Röhre vermeidet. Tatsache ist, dass der erste Teil der Reaktion bei hoher Temperatur abläuft, aber während sich das Reagenzglas erwärmt, können Sie versehentlich vom falschen Schlag ausgehen - dies erhöht das Rauschen und die Fehlerwahrscheinlichkeit stark. Daher kamen die Optionen mit der Tatsache, dass eines der Reagenzien des Systems in eine Wachskapsel gegeben wird (es schmilzt erst nach Durchlaufen des gewünschten Punktes und setzt die Komponente rechtzeitig frei), zu der Option, wenn der Lösung eine Substanz zugesetzt wird, die die Reaktion blockiert, aber bei hoher Temperatur zerfällt.
Es besteht ein Schutz vor Verschmutzung - Moleküle, die bei der Amplifikation markiert werden, können auf eine bestimmte Weise markiert werden und dann zu Beginn der Reaktion alle auf diese Weise markierten Moleküle zerstören. Das heißt, wenn etwas aus einem Rohr in ein anderes gekrochen ist, füllt es sich automatisch mit den Hauptreaktionen.
Die Fluoreszenz ist auch kühl: In die Reagenzien wird eine Substanz eingebracht, die durch Reaktionen mit DNA zerstört wird. Das heißt, je mehr DNA gebildet wird, desto mehr Moleküle dieser Substanz werden gebrochen. Das Ganze scheint nicht, aber in Stücken beginnt es. Und je mehr DNA-Moleküle während der Replikation reagieren, desto mehr leuchtet die Röhre.
Angesichts der zunehmenden Komplexität von Testsystemen sind Life Hacks und elegante Lösungen das Meer.
Warum machen PCR-Trainingszentren an Universitäten?
Denn dies ist immer noch die Hauptgeschichte über die Diagnose von Krankheiten und nicht unbedingt bei Menschen. Hier im Fernen Osten kann der Schwerpunkt beispielsweise auf Phytoviren liegen. In den Behältern des Mutterlandes befindet sich ein binäres Virus mit Reisgewürzen (genauer gesagt zwei gut aufeinander abgestimmten Viren), das die gesamte Ernte in ganz Asien zur Verbreitung bringen und einsetzen kann. Natürlich gehört so etwas nicht nur uns - und es wird nicht unbedingt böswillig freigesetzt, es kann sich nach Idiotie oder einfach in einem natürlichen Herd entwickeln. Wie bei der japanischen Enzephalitis in Primorje treten hier ständig saisonale Mückenherde auf. Und die Sterblichkeit beträgt 60 Prozent.
Der mutmaßliche Gegner hat auch Viren bei Tieren und Menschen.
PCR-Spezialisten repräsentieren also die biologische Sicherheit des Landes. Sie überwachen Infektionen, fangen alle Passagiere im Flugzeug, wo einige Leute husteten, und so weiter. Michael zum Beispiel flog mit einer Ebola, sowohl mit der Vogelgrippe als auch mit vielem mehr. Er sequenzierte das gesamte Genom der einzigen lebenden Kopie des Tollwutvirus der Welt.
Mikhail Shchelkanov, Professor, FEFU, Leiter des Bundesforschungszentrums für Biodiversität Virologie, Zweig FernostMit einem Bären im Allgemeinen eine tolle Geschichte. Der Bär hob 5 Hunde hoch und griff dann die Großmutter an. Er drehte ihre Lunge und zog die Kopfhaut ab. Außerdem sabberte er überall und war mit Blut bedeckt. Die Jäger entschieden über das Tier, dass es eine Art falscher Bär war. Und sie gaben seine Überreste Wissenschaftlern für Experimente.
Hier finden Sie weitere Details.
Mikhail ist auch ein Fan von Robben, weil er Inseln mit Rookeries liebt. Sie übertragen Viren und Parasiten extrem schnell auf die gesamte Bevölkerung. Sie fanden bei Katzen in den Nasenlöchern eine kühle Laus mit nicht weniger kühlen Bakterien. Wenn ein Seehund taucht, schließt er seine Nasenlöcher. Die Laus im Inneren fühlt sich warm und charmant an.
Neben der biologischen Sicherheit ist die zweite Geschichte die Ausbildung ausländischer Fachkräfte. Es gibt zwei wichtige Dinge: Erstens untersuchen sie unsere Testsysteme (und dann werden sie sie mit größerer Wahrscheinlichkeit kaufen), und dies ist wichtig für den Export - wir sind führend in der GUS (ungefähr 25 Millionen Reaktionen pro Jahr), aber nicht weltweit . Zweitens ermöglicht die Einheitlichkeit der Erfahrung die gleiche Überwachung durch gemeinsame Protokolle, dh das Ändern der Datenbanken und der Erfahrung. Grundlagen sind natürlich wichtiger. Dies bedeutet eine viel konsequentere Reaktion auf mögliche Epidemien.
In Wladiwostok fiel die offizielle Eröffnung nicht mit der technischen zusammen - eine Gruppe vietnamesischer Ärzte beendet ihren letzten Unterricht. Zwei sprechen Russisch, der Rest lernt durch sie. Es gibt einen Englischkurs. Das gleiche Zentrum arbeitet in Nowosibirsk für russische Ärzte und Ärzte aus den GUS-Ländern, und Spezialisten haben dort seit einem Jahr ihren Abschluss gemacht.Wir tun auch alles für unsere Testsysteme in Russland und in der praktischen Molekularbiologie gehören sie zu den leistungsstärksten der Welt (theoretisch nein, aber wir implementieren schnell und technisch alles). Daher wird Bildung dazu beitragen, diesen Markt für uns zu erweitern. Insgesamt wurden in solchen Zentren 3881 Fachkräfte ausgebildet (kleine Gruppen, weil es viel Übung gibt), und jetzt besteht die Aufgabe darin, die Ausbildung ausländischer Fachkräfte umfassend zu gestalten.
Dies wird vollständig als Internationales Ausbildungszentrum von Rospotrebnadzor an der School of Biomedicine der Far Eastern Federal University bezeichnet. Es wurde tatsächlich von Michail Schtschelkanow mit dem Foto oben und deutschem Shipulin (FBUN CRI von Rospotrebnadzor in Moskau) eröffnet. Beweise in den Medien werden anscheinend morgen sein. Nun, ich bin kein Mikrobiologe. Wenn ich also irgendwo oben einen Fehler gemacht habe, bitte, bitte.
UPD: Hier sind die Nachrichten zu
RG , die immer noch einen Standpunkt zu dieser Geschichte haben.