Molekulare mikromotorische Geschwindigkeitsanalyse für die HIV-Diagnose

Das humane Immundefizienzvirus oder einfach HIV ist die Seuche des 20. Jahrhunderts. Ziemlich lauter Titel, aber nicht übertrieben. Diese Krankheit forderte Millionen von Menschenleben. Und jedes Jahr wächst die Zahl der Opfer dieser heimtückischen Krankheit sowie die Zahl der Studien zur Behandlung und Diagnose von HIV. Jede Krankheit, und HIV ist keine Ausnahme, ist in den frühen Entwicklungsstadien am einfachsten zu behandeln. Dies erfordert jedoch eine Möglichkeit, dies so früh wie möglich zu erkennen, noch bevor sich die ersten Symptome zu manifestieren beginnen. Wenn Sie beispielsweise einen Finger schneiden, sehen Sie einen Schnitt, dh Sie wissen genau, was zu behandeln ist. HIV kann im menschlichen Körper leben, ohne sich für einige Zeit asymptomatisch zu manifestieren. Heute werden wir eine neue Erfindung betrachten, die das Vorhandensein des Immundefizienzvirus über ein kleines Gerät, das an ein Smartphone angeschlossen ist, schnell und genau bestimmen kann. Wie funktioniert diese Innovation, wie genau sind ihre Ergebnisse und was planen die Forscher für die Zukunft? Wir werden im Bericht der Forschungsgruppe nach Antworten auf diese und andere Fragen suchen.

Theoretische Grundlage

Über Krankheiten zu sprechen ist unangenehm, aber notwendig. Je mehr wir über sie wissen, desto besser können wir uns und unsere Lieben vor ihrem Einfluss schützen.



Das HIV - Human Immunodeficiency Virus zeigte seine schreckliche Grimasse bereits in den frühen 80ern des letzten Jahrhunderts. Dann wusste niemand, was es war, und der Virus selbst hatte nicht einmal einen Namen. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass HIV ein Retrovirus ist, das Zellen im körpereigenen Immunsystem, einem der wichtigsten Systeme, infiziert. Die Wirkung des Virus ist die Unterdrückung der Immunabwehr und die Entwicklung des AIDS-erworbenen Immunschwächesyndroms. In diesem Zustand bleibt der Körper schutzlos und jede, selbst die mildeste Infektion (sowie Krebszellen) kann ihn dramatisch beeinflussen. Im Wesentlichen zerstört HIV unsere Verteidigung und die Feinde übernehmen angesichts von Infektionen ruhig den Körper.

HIV hat einen Kontaktübertragungsmechanismus. Eine Infektion kann durch Kontakt mit Blut, Sperma, Muttermilch, vorgesäten Flüssigkeit oder Vaginalsekreten auftreten. Mit anderen Worten, ungeschützter Verkehr, infizierte medizinische Instrumente und sogar nicht infizierte Nadeln in Tattoo-Salons sind eine großartige Möglichkeit, das Virus zu verbreiten. In der Zeit des Auftretens von HIV, als sich die Panik in der Bevölkerung schneller ausbreitete als verlässliche Informationen darüber, was HIV ist und wie es sich ausbreitet, glaubte man, dass die Infektion durch einen einfachen Händedruck erfolgen könnte. Dies ist ein Mythos, da sich das Virus nicht durch eine einfache Berührung mit einer infizierten Person verbreitet. Diese Infektionsmöglichkeit ist jedoch auch möglich, jedoch nur bei offenen Wunden an den Händen der Infizierten und möglichen Infektionsopfer. Ich spreche nicht von der Tatsache, dass einige Mücken, die HIV übertragen sollen (eine Mücke trinkt das Blut eines Patienten und kann, nachdem sie einen gesunden Menschen gebissen hat, ihn infizieren kann), auch ein Mythos ist.


Weltweite HIV-Prävalenz nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (2017).

Ich werde das Virus und die Folgen seiner Entwicklung im Körper nicht im Detail beschreiben, da wir nicht so sehr das Virus selbst als eine neue Methode für seine Diagnose diskutieren werden. Es ist jedoch erwähnenswert, dass HIV ein Patientenvirus ist, das im Laufe der Zeit im Körper einer infizierten Person mutieren kann, wodurch es noch resistenter gegen verschiedene Methoden der Eindämmung oder Behandlung wird. Dies ist ein weiterer Grund, warum es so früh wie möglich erkannt werden muss. Je mehr Zeit das Virus hat, desto stärker ist es und desto schwächer ist die infizierte Person.

Woraus besteht das Gerät?

Wissenschaftler, die an dieser Studie beteiligt sind, sagen, dass eines der schwerwiegendsten Probleme und Hindernisse bei der Früherkennung von HIV wie bei anderen Krankheiten weltweit das Fehlen geeigneter Bedingungen ist: Laboratorien, Personal, medizinische Einrichtungen. Aus diesem Grund haben sie beschlossen, ein Gerät zu entwickeln, das genau anzeigt, ob sich ein Virus im Körper befindet oder nicht. Der Blutzuckerspiegel kann bereits lange Zeit mit tragbaren Kompaktgeräten (Glukometern) überprüft werden, ohne dass Sie das Labor aufsuchen und mehrere Tage auf die Testergebnisse warten müssen. Die Kosten solcher Geräte sind recht niedrig, was auch mit ihrer Verteilung einhergeht.

Das Gerät, mit dem wir uns heute vertraut machen werden, kann kurz wie folgt beschrieben werden: ein mobiler Analysator zur molekularen Bestimmung von HIV-1 auf der Basis von isothermer Schleifenamplifikation (LAMP) und Nanomotoren (CALM). Und jetzt in Ordnung.

Nanomotoren

Nanomotoren (auch Mikromotoren genannt) werden als mikroskopische molekulare Geräte bezeichnet, die in Bewegung befindliche Energie umwandeln können. Wenn sie in eine bestimmte chemische Lösung gegeben werden, bewegen sie sich unabhängig voneinander auf einem bestimmten Weg, der in der Diagnostik und sogar bei der Energieversorgung nanotechnologischer Geräte verwendet werden kann.


Das mikromotorische Bildungsschema für einen HIV-Tester.

Mikromotoren sind Kugeln aus Polystyrol, die mit Pt (Platin) -Nanopartikeln mit einer Dichte von 1,04 g / cm beschichtet sind. Weiterhin wurden Au (Gold) -Nanopartikel auch verwendet, um Mikromotoren mit DNA-Sonden zu modifizieren (im obigen Diagramm sind sie als rote „Tentakeln“ dargestellt).

Ein TEM (Transmissionselektronenmikroskop) zeigte, dass die bei der Beschichtung von Mikromotoren verwendeten Platin- und Goldnanopartikel eine sphärische Form hatten und einen Durchmesser von 57,721 ± 5,181 nm (Pt) und 3,43 ± 1,336 nm (Au) hatten.


Oben sind TEM-Bilder, Fotokolben mit präparierten Nanopartikeln und die Ergebnisse der optischen Spektroskopie.

Es musste überprüft werden, wie effizient eine DNA-Sonde eines vollständig ausgebildeten Mikromotors DNA-Moleküle einfangen kann. Hierzu wurde die Gelelektrophorese-Technik Agarose * (C ₁₂ H ₁₈ O ₉ ) verwendet.

Agarose * ist ein lineares Polysaccharid, das durch eine Sequenz von β-D-Galactopyranose-Resten und 3,6-Anhydrid-α-L-Galactopyranose gebildet wird, die durch eine 1 → 4-Bindung verbunden sind. Aus Agar gewonnen.

Mit dieser Technik konnten wir bestätigen, dass Mikromotoren DNA-Sonden auf ihrer Oberfläche haben, da sie ein künstliches DNA-Molekül von etwa 180 bp (gepaarte Basen) anbringen konnten, was ein hervorragendes Ergebnis für eine solche (künstliche) Probe ist (Bild links). Der Grad der Erfassungseffizienz während der ersten Tests betrug ungefähr 30%, was durch Fluorimetrie bestätigt wird (Bild links).


Hier sehen wir, wie sich Mikromotoren in Lösung mit unterschiedlichen Konzentrationen von H ₂ O ₂ (0, 5, 10 und 15%) bewegen.

Es war auch notwendig, das wichtigste Merkmal von Mikromotoren zu überprüfen - die Bewegung. Hierzu wurde eine Lösung mit und ohne H ₂ O _{2 verwendet} (Vergleich der Trajektorien in Bild d unten). Wenn Wasserstoffperoxid fehlte, vibrierten die Mikromotoren, was auf die Brownsche Bewegung zurückzuführen war. Als H ₂ O ₂ in die Lösung eingeführt wurde, erhöhte sich die Geschwindigkeit der Mikromotoren für jedes 1% ige Wasserstoffperoxid in der Lösung um etwa 0,7 & mgr; m / s.


Messung der Geschwindigkeit von Mikromotoren in einer Testlösung.

Abbildung a zeigt die Abhängigkeit der Drehzahl von Mikromotoren mit einem Durchmesser von 6 μm und der Konzentration von H ₂ O ₂ in Lösung. Außerdem (rechts) ist eine Momentaufnahme des Mikromotors und seiner Flugbahn. Diagramm b zeigt den Stabilitätsgrad von Mikromotoren bei verschiedenen Temperaturen in einer 5% igen Wasserstoffperoxidlösung. Unten (Grafik und Momentaufnahme) sehen wir, wie sich der Stabilitätsindikator im Laufe der Zeit (120 s) ändert, sowie die Bewegungsbahn bereits in einer 15% igen Lösung. Die zeitliche Verschiebung des quadratischen Mittelwerts über die Zeit ist in den Diagrammen e dargestellt : schwarze Punkte - eine Lösung ohne H ₂ O ₂ , rot - 5% H ₂ O ₂ .

Unten in Bild f sehen wir, dass nicht nur der Zustand der Lösung, in dem sich die Mikromotoren befinden, ihr Verhalten beeinflusst, sondern auch die Mikromotoren selbst und genauer ihre Struktur es signifikant verändern. Wir sehen, wie sich Mikromotoren mit einem Durchmesser von 3 μm ohne Ablagerung von Platin und Gold bewegen (blaue Linien) im Vergleich zu den vollständig getesteten Mikromotoren mit einem Durchmesser von 6 μm (rote Linien). Rechts vom Vergleich der Trajektorien befindet sich ein Vergleich der mittleren quadratischen Verschiebung der Mikromotoren (3 μm und 6 μm Durchmesser).

Mobiles Gerät

Motorola XT1575 (Android OS) wurde verwendet, um Mikromotoren zu visualisieren und zu verfolgen (dh um zu überwachen, wie die Diagnose erfolgt).


Aussehen und Details des Geräts.

Eine wichtige Komponente des Geräts ist der Chip, der zur Überprüfung der Bewegung von Mikromotoren benötigt wird. Es wurde aus Polymethylmethacrylat (Plexiglas) hergestellt. Ein Glasboden mit einem 2 mm breiten lasergeschnittenen „Kanal“ wurde mit einer 80 μm Klebstoffschicht daran befestigt.


Das Aussehen des Chips und seine Abmessungen.

Wie aus den obigen Bildern ersichtlich ist, ist der Chip nicht der einzige Teil des Geräts. Das blaue abnehmbare Gehäuse wurde auf einem 3D-Drucker aus kostengünstigen Materialien hergestellt. In diesem Gehäuse befinden sich eine weiße LED, eine 3,3-V-Batterie, ein Schalter und kostengünstige optische Linsen. Außerdem gibt es einen Musterhalter, mit dem Sie sie zwischen den Objektiven und der Kamera des Telefons platzieren können.

Und jetzt zur Softwarekomponente. Die Software wurde in Android Studio mit den OpenCV 3.1.0-Bibliotheken erstellt. Laut Wissenschaftlern wurde die Benutzeroberfläche für Benutzer so klar und praktisch wie möglich gestaltet.


HIV-Tester-Schnittstelle.

Wenn die Probe in das Gerät eingelegt wird, zeichnet das Programm ein Video (30 fps, 320 x 240 Pixel) auf, das die Bewegung der Mikromotoren zeigt, deren Geschwindigkeit berechnet und innerhalb von 1 Minute das Ergebnis der Analyse liefert.

Schleifenisotherme Verstärkung (LAMP)

Wie effektiv erkennt das Mikromotoriksystem HIV-1? Die Antwort auf diese Frage liegt in LAMP-Reaktionen. Zum Testen wurden mehrere Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an HIV-1-RNA (Ribonukleinsäure) hergestellt. Das Amplifikationsergebnis wurde durch Agarosegelelektrophorese bewertet.


LAMPENTEST.

Die Ergebnisse der Elektrophorese zeigten die schrittweise Bildung eines großen DNA-Amplikons (DNA-Sequenz, Amplifikationsergebnis). Die Anzahl der Amplikons war proportional zur Konzentration der HIV-1-RNA.

Die Mikromotoren wurden mit HIV-1-RNA-Amplifikaten gemischt, was einen Hybridisierungsprozess (bei einer Temperatur von 80 ° C) ermöglichte. Als nächstes wurde die resultierende "Mischung" in einer 5% igen Lösung von H ₂ O ₂ getestet. Wenn HIV-1-RNA-Amplifikate im System vorhanden waren, war die Geschwindigkeit der Mikromotoren um etwa 95,26% sehr stark verringert. Eine Abnahme der Rate wird bereits bei einer geringen Konzentration von Amplikons (etwa 3,394 ± 0,245 ng / μl) beobachtet.


Demonstration der mikromotorischen Bewegung in Abwesenheit von HIV-1-RNA.


Demonstration der mikromotorischen Bewegung in Gegenwart von HIV-1-RNA.

Den Wissenschaftlern gelang es auch, Mikromotoren und ihre Geschwindigkeit wiederherzustellen. Dazu wurde die mit Mikromotoren und Amplikons "infizierte" Probe 30 Sekunden bei einer Temperatur von 90 ° C inkubiert. Dies ermöglichte es, Amplikons von mikromotorischen DNA-Sonden zu befreien. Anschließend wurde 5 Minuten bei 6000 x g zentrifugiert. Die Überprüfung der erhaltenen Probe in einer 5% igen Lösung von H ₂ O ₂ zeigte, dass die mikromotorische Geschwindigkeit vor dem Testen unter Beteiligung von HIV-1-RNA-Amplikons auf das Niveau von 75,52% gegenüber dem Original wiederhergestellt wurde.

Die Reaktion des Systems auf andere Arten von sexuell übertragbaren Viren wurde ebenfalls getestet: Hepatitis C und B, Herpes, Papillomavirus 16 (HPV-16). Aufgrund der häufigen Fälle einer Parallelinfektion sowohl mit HIV als auch mit einigen der oben genannten Viren war dieser Test ebenfalls von großer Bedeutung. Das Ergebnis war zufriedenstellend - DNA-Amplikons wurden nur in Gegenwart von HIV gebildet. Das heißt, das Vorhandensein anderer Viren in der Testprobe hatte keinen Einfluss auf den Überprüfungsprozess.

Die Schlussfolgerung ist einfach: Die Methode kann das Vorhandensein von HIV bestimmen. Jetzt muss jedoch eine Kalibrierung durchgeführt werden, damit das System das Vorhandensein und Fehlen des Virus in der Probe unterscheiden kann, wobei die Standardkonzentration von 1000 Partikeln / ml im Mittelpunkt steht. Wenn die Konzentration unter diesem Indikator liegt, ist das Ergebnis negativ (es gibt kein Virus), wenn die Konzentration höher ist, ist es positiv. Um die Kalibrierung durchzuführen, musste bestimmt werden, welche Mikromotorgeschwindigkeit welcher Konzentration entspricht. Hierzu wurden PBS - Natriumphosphatpuffer (eine spezielle Forschungslösung) und das Plasma von Patienten mit und ohne HIV verwendet.

Die Kalibrierung wurde unter Verwendung von PBS durchgeführt, wobei die Konzentration an synthetisch stabilisierter HIV-1-RNA im Bereich von 0 bis 107 lag.

Nach der Kalibrierung wurde deutlich, dass die durchschnittliche mikromotorische Geschwindigkeit bei einer HIV-Konzentration von 1000 0,705 ± 0,082 μm / s beträgt.


Die Ergebnisse der Bestimmung der Konzentration von HIV-1-RNA.

Die Wissenschaftler analysierten das System auch anhand der ROC-Kurve, die sehr ermutigende Ergebnisse zeigte. Die Sensitivität * des getesteten Systems betrug etwa 94,6% bei einem CI * von 81,8–99,3% und die Spezifität * von 99,1% bei einem CI von 80,5–100%.

Empfindlichkeit * - ein Indikator, der den Anteil positiver Ergebnisse widerspiegelt (in diesem Fall ist es die Wahrscheinlichkeit, dass die HIV-Konzentration in der Probe über 1000 liegt).

Die Spezifität * ist ein Indikator, der den Anteil negativer Ergebnisse widerspiegelt (in diesem Fall ist es die Wahrscheinlichkeit, dass die HIV-Konzentration in der Probe unter 1000 liegt).

DI * - Konfidenzintervall, dh das Intervall, das einen unbekannten Parameter mit einer bestimmten Zuverlässigkeit abdeckt.

Das Streudiagramm der Systemergebnisse zeigte ebenfalls unglaubliche Ergebnisse. Somit beträgt die Genauigkeit der Bestimmung einer Probe mit einer hohen HIV-Konzentration als positiv 100% und die Genauigkeit der Bestimmung negativer Proben 90%.



Wer sich mit der Studie genauer vertraut machen möchte, kann sich den Bericht von Wissenschaftlern und zusätzliche Materialien dazu ansehen.

Nachwort

Die Wissenschaftler, die dieses erstaunliche Gerät entwickelt haben, bestreiten nicht, dass sie noch viele Tests, Kalibrierungen und Verbesserungen durchführen müssen. Aber sie sind eindeutig auf dem richtigen Weg. Solche Geräte können die Ausbreitung von HIV erheblich reduzieren, insbesondere bei Menschen an Orten, an denen Laboratorien mit Personal und eine Reihe medizinischer Geräte einfach nicht verfügbar sind.

Ja, das Gerät sieht noch nicht sehr kompakt aus und die Tatsache, dass ein Smartphone erforderlich ist, kann jemanden von sich stoßen. In Zukunft werden sich solche Technologien zur Früherkennung von HIV jedoch nicht nur in Bezug auf Effizienz und Genauigkeit, sondern auch in Bezug auf Bequemlichkeit und Erschwinglichkeit weiter verbessern.

HIV ist die Seuche des 20. Jahrhunderts, wie ich ganz am Anfang dieser Geschichte schrieb. Leider ist dieses Virus nicht weit vom Titel "Pest des 21. Jahrhunderts" entfernt. Heutzutage beanspruchen bereits mehrere Krankheiten einen so lauten Titel (zum Beispiel Depressionen, Diabetes usw.). Und jede dieser Krankheiten erfordert große Aufmerksamkeit. Und obwohl es keine magische Pille gibt, die Krankheiten heilen kann, können wir nur die verfügbaren Diagnosemethoden verbessern, die uns zusätzliche Zeit geben, nach einer Behandlung zu suchen oder die Krankheit einzudämmen. Je früher wir über ein Problem Bescheid wissen, desto mehr Chancen haben wir, es zu lösen.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist soziale Aktivität, Offenheit und Diskussion. Das Problem sollte diskutiert werden, denn selbst wenn es beängstigend ist, darüber zu sprechen, wie beabsichtigt die Gesellschaft, es zu bekämpfen?

Auf jeden Fall ist das alles für mich. Pass auf dich und deine Lieben auf.

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