Unsichtbare Fliegen: Eine neue Methode zur Untersuchung des Nervensystems durch Gewebedepigmentierung

Das Studium eines Organismus ist ein komplexer Prozess und erfordert Genauigkeit. Dies ist modernen Scanmethoden gelungen. Heute können wir den Körper oder ein einzelnes Organ in dreidimensionalen Bildern ausreichend detailliert untersuchen. Vor etwa 100 Jahren konnte eine dreidimensionale Ansicht der Organe nur erhalten werden, indem sie aus dem Körper entfernt und sozusagen live untersucht wurden. Es gibt jedoch immer ein "aber". Aber selbst die genauesten Scanner und Mikroskope können keine 100% ige Genauigkeit liefern. Wenn es nun möglich wäre, alles Unnötige unsichtbar zu machen und den Teil des Körpers, den wir untersuchen möchten, sichtbar zu lassen. Klingt nach Science Fiction, nicht wahr? Ich stimme zu. Aber jetzt ist es real. Heute lernen wir die Untersuchung einer neuen Methode zum Scannen von Organismen am Beispiel von Drosophila kennen. Wie haben Wissenschaftler es geschafft, eine gewöhnliche Obstmücke „unsichtbar“ zu machen, wie genau ist ihre Scanmethode und wie hilft dies bei der Diagnose menschlicher Krankheiten? Die Antworten auf diese und andere Fragen können wir nur im Bericht der Forscher erhalten. Also lasst es uns nicht ziehen. Lass uns gehen.

Studienbasis

Wie ich in einem der vorhergehenden Artikel sagte, dessen Hauptfigur wie heute Drosophila war, ist dieses kleine und in Wahrheit ärgerliche Insekt Gegenstand vieler Studien. Mit seiner Hilfe untersuchen Wissenschaftler eine ganze Reihe von Dingen: von der Aerodynamik bis zum Nervensystem. Und es geht um Letzteres, das heute diskutiert wird. Die Untersuchung derart komplexer Systeme in so kleinen Organismen ist mit gewissen Schwierigkeiten verbunden. Wir sind bereits mit den Methoden zur Untersuchung von Organismen vertraut, indem wir sie in viele ultradünne Schichten schneiden. Diese Methode ermöglicht es, viele Systeme genauer zu untersuchen. In Bezug auf das Nervensystem verletzt diese Methode nach Ansicht der Forscher jedoch die zelluläre Integrität, was den Prozess der Untersuchung einzelner Teile des Systems erschwert.



Wenn wir kleine Organismen ohne physikalische „Schichtung“ scannen, werden alle Systeme gleichzeitig angezeigt. Wissenschaftler wollen jedoch nur ein System untersuchen, während andere diesen Prozess nicht stören sollten. Deshalb hatten sie eine brillante und einfache Idee - alles unsichtbar (oder eher transparent) zu machen und das notwendige System unberührt zu lassen.

Im Moment gibt es genügend Werkzeuge, um eine solche Idee umzusetzen, es bleibt nur, sie miteinander zu kombinieren. Die Hauptbestandteile einer neuen Scanmethode namens FlyClear (zu Ehren der ersten Testperson - Drosophila-Fliegen) sind Gewebereinigung und Ultramikroskopie.



Drosophila wurde aus einem bestimmten Grund als Testperson ausgewählt. Die Grundlage der meisten Gewebereinigungsmethoden ist die genetische Veränderung des Testorganismus. In diesem Fall handelt es sich um Fluoreszenz. Dieser Prozess ist äußerst komplex und zeitaufwändig. Je größer der Körper ist, desto mehr Zeit wird für seine Modifikation aufgewendet. Darüber hinaus können nicht alle Kreaturen so modifiziert werden, wie es Wissenschaftler wollen. Drosophila eignet sich sehr leicht für ähnliche genetische Manipulationen, und dieser Prozess dauert nicht so lange.

Derzeit ist die konfokale Mikroskopie die beliebteste Methode zur Untersuchung von Organismen, sie wird jedoch erst nach Dissektion des Gewebes durchgeführt. Die Frage stellt sich - und wenn nicht zu sezieren? In diesem Fall erhalten wir ein blasses Bild von geringer Qualität, und der Vorgang selbst nimmt viel Zeit in Anspruch. Insbesondere bei erhöhter Gewebepigmentierung (wie bei Drosophila) wird auch eine starke Absorption und Streuung von Photonen in der Probe beobachtet. Dementsprechend muss die Probe gereinigt, dh transparent gemacht werden. Somit wird die Abnahme der Signalintensität ausgeglichen und eine gleichmäßige räumliche Auflösung erreicht. Der Hauptweg zu „undurchsichtigem“ Gewebe (entschuldigen Sie ein fiktives Wort) besteht darin, den Brechungsindex an den Grenzen zwischen zellulären Komponenten zu verringern.

Forscher bestreiten nicht, dass es jetzt mehrere Möglichkeiten gibt, die bereits klassisch geworden sind, um Stoffe transparent zu machen. Sie behaupten jedoch auch, dass diese Verfahren eine Reihe von Nachteilen aufweisen. Erhaltung der Morphologie, Stabilität der Fluoreszenz, Abtasttiefe usw. - mit all diesen Aspekten sind die vorhandenen Methoden, gelinde gesagt, nicht in Ordnung. Darüber hinaus führt keiner von ihnen zu einer vollständigen Depigmentierung des Gewebes.

Es stellt sich heraus, dass es für einen besseren Scan kleiner Körper immer noch notwendig ist, einen Querschnitt von Geweben durchzuführen. Nicht wirklich. Wissenschaftler führen das gleiche Drosophila als Beispiel an. Die sensorischen Neuronen von Drosophila befinden sich in ihren peripheren Regionen (Beine, Augen, Antennen) und haben sehr lange Verbindungen zu zahlreichen Nerven und zum Gehirn. Wenn diese Regionen geschichtet sind, erhalten wir kein vollständiges Bild davon, wie das Nervensystem in diesen Regionen strukturiert ist.

In dieser Studie konnten wir mit der FlyClear-Methode die Pigmentierung von Drosophila-Gewebe entfernen und sein Nervensystem freilegen. Es dauerte ungefähr einen Monat. Die Ultramikroskopie ermöglichte es uns, die kleinsten neuronalen Verbindungen zu visualisieren und eine vollständige Karte des Nervensystems der Mücke zu erstellen. Eine Substanz spielte auch eine große Rolle, mit deren Hilfe das Nervensystem hellgrün „gefärbt“ werden konnte - ein grün fluoreszierendes Protein (im Folgenden als ZFB bezeichnet). Das aus der Qualle Aequorea victoria gewonnene Gen für dieses Protein wird genau zur Genmodifikation von Testproben verwendet.


Qualle Aequorea victoria.

Die durch Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Daten wurden mit einem speziellen Algorithmus verarbeitet, mit dem Sie ein dreidimensionales Bild mit hoher Auflösung erstellen können.

Studienvorbereitung

Die optische Reinigung von Drosophila-Gewebe ist kein einfacher Vorgang. Chitinhaltige Exoskelett- und Facettenaugen-Photopigmente sind die schwierigsten Regionen des Mückenkörpers für das Verfahren. Derzeit verfügbare Methoden zur Gewebereinigung sind alles andere als ideal, da die Forscher ihre eigenen Methoden entwickelt haben - FlyClear, die ich bereits erwähnt habe.

FlyClear kombiniert mehrere der vorherigen Methoden. Das erste davon ist CUBIC (klare, ungehinderte Cocktails zur Bildgebung des Gehirns). Weitere Schritte hängen vom Zustand der Probe ab (Larve oder Erwachsener).


Optionen für das FlyClear-Verfahren.

Bei der Larve werden 0,03% Protease und Formaldehydfixierung verwendet. Tatsache ist, dass Protease Peptidbindungen zwischen Aminosäuren von Proteinen abbaut und dies hilft, Gewebe zu „verfärben“. Als nächstes wird Aceton auf der Probe zur Permeabilisierung verwendet (Änderungen in der Permeabilität der Zellmembran).

Den Wissenschaftlern gelang es, das CUBIC-Stadium durch Ersetzen von [CH ₃ CH (OH) CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH (OH) CH ₃ ] ₂ (N, N, N ', N'-Tetrakis (2-hydroxypropyl) zu verbessern ) Ethylendiamin) an C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ (2,2 ', 2 ", 2"' - (Ethylendinitril) tetraethanol)). Diese Änderung ermöglichte eine vollständige Depigmentierung des Gewebes, auch in komplexen Bereichen (Augen und Epidermis).

Die Methode der vollständigen Gewebedepigmentierung funktioniert also. Jetzt müssen Sie die zweite wichtige Phase der Studie überprüfen - die Fluoreszenz. Genauer gesagt muss geprüft werden, ob das neue Reagenz C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ Fluoreszenzsignale unterdrückt, da Drosophila nach genetischen Manipulationen bereits eine geringe Fluoreszenz aufweist. Für den Test wurden die Proben (Drosophila-Körper) in zwei Hälften geteilt: Eine Hälfte war unbehandelt, die zweite mit Behandlung. Die Analyse zeigte, dass der Schweregrad von ZFB bei Verwendung von C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ tatsächlich abnimmt, dies hat jedoch keinen Einfluss auf die Gesamtgenauigkeit. Und das alles dank der Tatsache, dass mit demselben Reagenz ein hohes Maß an Gewebedepigmentierung erreicht werden konnte. Das heißt, die Vorteile des Reagenz haben seine Mängel ausgeglichen.

Die fertige Probe muss sozusagen berücksichtigt werden, und dazu wurde mittels fortgeschrittener Ultramikroskopie ein Bild der Probe mit der gleichen Auflösung in allen Ebenen erhalten.


Optisches System: 1 und 3 - eine plankonvexe asphärische Zylinderlinse; 2 - Powell-Linse; 4 - elliptische apodisierende weiche Öffnung; 5 und 6 - Zylinderlinsen.

Typischerweise verwendet die Standard-Ultramikroskopie Zylinderlinsen und eine rechteckige Apertur. In dieser Studie wurden zusätzliche Komponenten verwendet, die die Form des Strahls mit verbesserten Eigenschaften ultradünn ändern.

Die Verwendung von sphärischen Linsen beruht auf der Fähigkeit, ein Bild ohne Verzerrung und mit minimaler Aberration zu erhalten.

Die Standardapertur wurde ebenfalls in eine elliptische apodisierende weiche Apertur geändert (im Bild oben unter Nummer 4). Die neue Apertur beseitigte die unerwünschte Intensitätsverteilung im optischen System.

Forschungsergebnisse

Nachfolgend sind die spezifischen Systeme des Drosophila-Organismus (respiratorisch, visuell, nervös usw.) aufgeführt, die vom ZFB hervorgehoben werden, während der Rest des Gewebes vollständig depigmentiert ist.

Um den Artikel nicht zu dehnen, habe ich alles unter einem Spoiler versteckt.









Wissenschaftler nennen ohne zu zögern die größte Errungenschaft ihrer Forschung die Fähigkeit, eine vollständige dreidimensionale Karte des Nervensystems zu erstellen. Und wenn Sie bedenken, dass dieses System zu einem so kleinen Organismus (Drosophila) gehört, wird diese Leistung noch bedeutender.

Mit der neuen Technik können Sie genau bestimmen, wo und wie diese oder andere Neuronen sowohl untereinander als auch mit dem Gehirn verbunden sind. Wenn ein Querschnitt verwendet worden wäre, wäre dies nicht möglich gewesen.



Als Demonstration der Fähigkeiten ihrer Methode zeigen uns Wissenschaftler zwei Arten von Neuronen des visuellen Systems von Drosophila: DCN - dorsale Clusterneuronen und MCN - säulenförmige Neuronen des Gehirns (Kortexsäulen im hinteren Teil des Gehirns). In der dorsal-lateralen Region des Gehirns bilden DCN-Cluster Kommissuralverbindungen, um die synaptischen Neuronen des Medulla und der Lobula im Optikuslappen anzuregen. (Bilder über a , c ).

In den Bildern b und d ist der Verlust der Kommissuralverbindung in homozygoten Mutanten von Neuroglian-Nervenzellen sichtbar. Diese Veränderungen im Nervensystem sind genau mit dem Reinigungsprozess der FlyClear-Zellen verbunden.



Um eine dreidimensionale Rekonstruktion zu erstellen, wurden Bilder aus zwei orthogonalen Richtungen aufgenommen, die dann kombiniert wurden. Der 3D-FFT-basierte Algorithmus bestimmt die Details einer Probe, die in einem der beiden Bildstapel klarer aussehen. Darüber hinaus wurde all dies zu einer dreidimensionalen Rekonstruktion kombiniert.

Wer sich mit der Studie genauer vertraut machen möchte, kann den Bericht von Wissenschaftlern und weitere Materialien dazu lesen.

Nachwort

Wissenschaftler rühmen sich nicht umsonst und sind stolz auf ihre Arbeit, denn das ist noch nie passiert. Die Methode der Querschnittsschichtung war im Bereich der Erforschung von Organismen vorherrschend. Diese Methode hat zwar viele Vorteile, aber große Nachteile. Insbesondere verletzen Einschnitte die Zell- und Gewebeintegrität, wodurch der Prozess der Rekonstruktion eines bestimmten Körpersystems erschwert wird.

Die Erforschung eines Organismus mit einem komplexen Nervensystem, wenn jedes Detail wichtig ist, wird jetzt viel einfacher. Wissenschaftler werden in der Lage sein, mehr Daten zu erhalten, die es ihnen ermöglichen, diese oder andere Prozesse im Körper detaillierter zu beschreiben.

Vergessen Sie auch nicht, dass Drosophila in dieser Studie nur experimentell ist und nicht ihre Grundlage. Die Verbesserung der neuen Scanmethode kann auch der Person dienen. Und nicht nur zur Untersuchung des Körpers und seiner Bestandteile, sondern auch zur Diagnose von Krankheiten, die in einem frühen Stadium verborgen werden können, in dem die derzeit verfügbaren Scanmethoden sie nicht bestimmen können.

Die Forschung eröffnet viele neue Dinge: neue Tierarten, neue Substanzen, Prozesse und Phänomene. Ohne Forschung zur Schaffung von Forschungsinstrumenten wäre dies alles unmöglich gewesen.


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