Harm for Good: Das Immunsystem von Lamprey im Kampf gegen menschlichen Hirntumor

Unser Gehirn ist unser Alles. Eine Verletzung der Arbeit dieses wichtigen Organs führt zu schrecklichen und manchmal tödlichen Folgen. Die Komplexität des Gehirns und seiner neuronalen Organisation ist kolossal, was den Prozess der Behandlung einer bestimmten Krankheit erheblich erschwert. Wenn wir etwas behandeln, versuchen wir in der Regel, die durch die Krankheit verursachten Defekte zu beseitigen. Aber was ist, wenn diese Mängel zur Bekämpfung ihrer Entstehung eingesetzt werden? Genau das haben sich die Autoren der Studie, über die wir heute nachdenken, entschieden. Wie haben Wissenschaftler die Störung der Blut-Hirn-Schranke angewendet, warum brauchen wir Zugang zur extrazellulären Matrix des Gehirns und welche Rolle spielte Neunauge-Parasit bei Fischen dabei? Der Bericht der Forschungsgruppe wird uns darüber berichten. Lass uns gehen.

Ein bisschen Theorie

Zunächst lohnt es sich, die Charaktere in diesem Laborspiel zu sortieren.


Blut-Hirn-Schranke

Eine der Hauptrollen spielt die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​- eine physiologische Barriere zwischen dem Zentralnervensystem (ZNS) und dem Kreislaufsystem. Diese Barriere verhindert den Kontakt von Nervengewebe mit verschiedenen Bestandteilen des zirkulierenden Blutes, darunter Toxine, Mikroorganismen, zelluläre / humorale Faktoren des Immunsystems, die auf Gehirnzellen als fremd reagieren können. Die BBB kann mit einem Türsteher in einem sehr teuren Club verglichen werden, der ausschließlich Nährstoffe in das Zentralnervensystem einlässt. Aber dieser Türsteher ist nicht sehr wählerisch, er vermisst oft nicht die Medikamente, die zur Behandlung des Zentralnervensystems benötigt werden. Es stellt sich heraus, dass ein System, das auf unsere Gesundheit abzielt, ein Hindernis für seine Behandlung sein kann. Hier ist die Ironie in der Physiologie.

Die Blut-Hirn-Schranke funktioniert jedoch nicht immer wie eine Schweizer Uhr. Bei Schlaganfällen, Tumoren, verschiedenen Kopfverletzungen und chronischen Krankheiten beginnt die BHS zu versagen, dh das Zentralnervensystem einzulassen, was es zuvor beseitigt hätte. Neben den natürlichen Ursachen des Versagens gibt es auch anthropogene: fokussierte hochintensive Ultraschall- und osmotische Mittel, die die BHS stören. Warum etwas kaputt machen, das die normale Funktion des Gehirns gewährleistet? Dann, um Medikamente zu liefern, die eine vollwertige BHS herausfiltern wird. Auf jeden Fall lässt der Türsteher den Arzt für einen ohnmächtigen Besucher nicht in den Club, da er keine Clubkarte besitzt.

Das wichtigste und in allen Fällen gemeinsame Ergebnis einer Störung der BHS ist eine pathologische Exposition der extrazellulären Matrix (ECM) des Gehirns, die unter normalen Bedingungen isoliert wird.

Die extrazelluläre Matrix ist die Basis des Bindegewebes, das die Zellen mechanisch unterstützt und Chemikalien transportiert.

Daher glauben Wissenschaftler, dass es durch gezielte Behandlung bestimmter Teile des Gehirns mit einer pathologisch gestörten BHS möglich ist, Medikamente an jene Teile des geschädigten Zentralnervensystems abzugeben, die zuvor gerade wegen der BHS nicht zugänglich waren.

Somit ist es möglich, einen Liganden zu erzeugen, der auf ECM abzielt und bei der Bekämpfung verschiedener Erkrankungen des Zentralnervensystems wirksam ist, und nicht mit einer bestimmten, wie zuvor entwickelten Methoden.

Um die Theorie in der Praxis zu testen, beschlossen die Wissenschaftler, ihre Methode der Arzneimittelabgabe auf unheilbares Glioblastom (Hirntumor) anzuwenden. Diese Art von Krankheit ist ziemlich selten, aber es ist äußerst schwierig, sie zu besiegen. Selbst nach Chemotherapie, Strahlentherapie und Operation beträgt das Überleben etwa 1-2 Jahre.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Anwendung der Immuntherapie durch Interleukin-13 * -basierte chimäre Antigenrezeptoren * eine vielversprechende Behandlung für Glioblastome darstellt.

Interleukine * sind Peptidinformationsmoleküle, die von Leukozyten in geringerem Maße von Phagozyten und anderen Geweben produziert werden. Interleukine sind Teil des Immunsystems.

Interleukin-13 * (IL13) ist der Hauptmediator für physiologische Veränderungen, die durch allergische Entzündungen in vielen Geweben verursacht werden.

Der chimäre Antigenrezeptor * ist ein rekombinantes Fusionsprotein, das ein Antikörperfragment verbindet, das selektiv an spezifische Antigene und Signaldomänen binden kann, die T-Zellen aktivieren.

Die Verwendung von chimären Antigenrezeptoren, die auf das CSPG4-Protein abzielen, kann auch eine ziemlich wirksame Methode zur Bekämpfung des Glioblastoms sein.

Darüber hinaus zeigte die MRT-Analyse eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke im Glioblastom. Daher müssen Behandlungen im Zusammenhang mit der extrazellulären Matrix wirksam sein.

Und hier kommt die immense Vorstellungskraft und Kreativität der Wissenschaftler ins Spiel. Tatsache ist, dass Sie Standardpeptide und -antikörper als ECM-zielgerichtete Reagenzien verwenden können, aber das macht nicht so viel Spaß. Daher entschieden sich die Wissenschaftler für die Verwendung variabler Lymphozytenrezeptoren (VLR), dh Neunaugen-Antigenrezeptoren.


Die Neunauge-Klasse hat ungefähr 40 Arten, von denen die meisten Parasiten sind, die sich vom Blut von Fischen ernähren, an denen sie saugen.

VLRs sind sichelreiche, Leucin-reiche Proteine, die antigene Ziele mit einer Spezifität und Affinität * erkennen, die mit Antikörpern auf Immunglobulinbasis vergleichbar ist.

Affinität * ist das thermodynamische Merkmal der Stärke der Wechselwirkung von Substanzen wie Antigen und Antikörper.

Warum genau Neunaugen und ihre VLR? Tatsache ist, dass zwischen Säugetieren und Neunaugen ein evolutionärer Abgrund von 500 Millionen Jahren besteht. Daher erkennen Neunauge-VLRs eher konservierte Proteine ​​und Glykane in der ECM als Säugetier-Antikörper.

Um die VLRs zu identifizieren, die die ECM des Gehirns binden, führten die Wissenschaftler Panning durch, eine Methode zur Auswahl spezifischer Bioelemente (Proteine, Petites usw.) aus VLR-Bibliotheken von Biomolekülen. Das Ergebnis war ein Pool von ECM-bindenden Klonen * .

Klon * - Eine Gruppe identischer Zellen, die einen gemeinsamen Vorfahren (primäre Quelle) haben, dh aus derselben Zelle stammen.

Der resultierende Klon zeigte eine bevorzugte Akkumulation sowohl in zerstörten Bereichen der Blut-Hirn-Schranke bei Tieren mit einer osmotischen Störung der BHS als auch mit Glioblastom. Darüber hinaus war der Klon gut auf Liposomen * ausgerichtet, die mit Doxorubicin (einem Antibiotikum) beladen waren.

Liposomen * - sphärische intrazelluläre Organellen, die zur Abgabe von Arzneimitteln an bestimmte Gewebe verwendet werden.

Studienvorbereitung

Wie wir bereits zuvor erfahren haben, wurden ECM-bindende VLRs durch Schwenken von VLR-Bibliotheken identifiziert. Die Bibliothek selbst wurde aus einer Sammlung von Neunauge-VLRs erhalten, die mit mechanisch isolierten Präparaten der Plasmamembran der Mikrovaskulatur des Maushirns immunisiert waren, die die assoziierte ECM des Gehirns enthielten.

Die Bibliothek wurde zuerst mit ECM-Bindemitteln unter Verwendung von zwei Panning-Zyklen auf einem dezellularisierten * ECM angereichert, das von kultivierten Mausendothelzellen (bEnd.3-Zelllinie) erzeugt wurde.

Die Dezellularisierung * ist eine Methode zur Reinigung von Allotransplantaten aus der zellulären Komponente, um ein nicht immunogenes, wirksames und sicheres Konstrukt auf der Basis einer natürlichen extrazellulären Matrix zu erhalten.

Ferner war es notwendig, genau jene ECM-bindenden Klone zu identifizieren, die vorwiegend bEnd.3 ECM biegen, und nicht mit der Kontrollgruppe von Maus-Fibroblasten-ECMs (Zelllinie 3T3).

Als nächstes wurden einzelne Klone in Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, wonach sie expandiert und zur Anzeige von VLR induziert wurden. Nach dem Entfernen zusätzlicher Klone (so dass keine Subklonierung erfolgte) konnten die Wissenschaftler eine vergleichende Bewertung der Bindung von VLR an bEnd.3- und 3T3-ECM mittels ELISA-Screening durchführen ( 1a ).


Bild Nr. 1

Insgesamt wurden 285 Klone analysiert. Infolgedessen ist ersichtlich, dass die Kommunikationssignale mit bEnd.3 ECM ungefähr fünfmal stärker sind als die Kommunikationssignale mit 3T3 ECM ( 1b ).

Als nächstes wurden die ELISA-Ergebnisse überprüft, indem Bilder der Hellfeldmikroskopie von Klonen verglichen wurden, die mit bEnd.3 und 3T3 ECM ( 1C ) assoziiert waren.

Wie in Bild 1c zu sehen ist, binden die Klone P1C10 und P2C7 ausschließlich an bEnd.3 ECM, und der nicht bindende Klon P1E9 zeigt praktisch keine Verbindung mit irgendeiner Art von ECM.

Als nächstes führten die Wissenschaftler eine vergleichende Analyse einer praktischeren Methode durch - an einem Abschnitt des Gehirns der Maus. Acht der 10 VLR-Klone, die in früheren Beobachtungen das beste Bindungsergebnis zeigten, zeigten auch in diesem Assay eine Bindung ( 1d ).

Alle Bindungsklone zeigten ein diffuses parenchymales EMV-Schema ohne zusätzliche Anreicherung (vaskulär oder zellulär).

Wissenschaftler identifizierten 2 Führer gemäß den Ergebnissen aller obigen Beobachtungen - P1C10 und P3A8. Es sind diese Klone, die in Zukunft berücksichtigt werden.

Forschungsergebnisse

P1C10 und P3A8 wurden mit Cy5-Fluoreszenzfarbstoff funktionalisiert. Die direkte Immunfärbung von Mausgeweben unter Verwendung von VLR-Cy5-Konjugaten zeigte, dass P1C10-Cy5 im Vergleich zu Geweben der Nieren, des Herzens und der Leber eine signifikante Selektivität gegenüber der ECM des Gehirns aufweist ( 2a ).


Bild Nr. 2a

Immunfärbung * - ein Prozess, mit dem Sie ein Antigen in einem bestimmten Bereich einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organs identifizieren und lokalisieren können.

P3A8-Cy5 bindet jedoch mit der gleichen Intensität an Gehirn- und Leber-ECMs, zeigt jedoch wie P1C10-Cy5 kein Interesse an Nieren- und Herz-ECMs.

Als nächstes testeten die Wissenschaftler die Kreuzreaktivität von P1C10 und der ECM des menschlichen Gehirns (Kryoschnitte wurden verwendet). Die Bindung von P1C10-Cy5 an die ECM des menschlichen Gehirns ähnelt einem Bild des gleichen Prozesses, das jedoch das Gehirn der Maus betrifft ( 2b ). P1C10-Cy5 wurde auch in Kryoschnitten einer Probe eines menschlichen Glioblastoms erfolgreich an ECM gebunden ( 2c ).


Bild Nr. 2b-e

Angesichts dieser Beobachtungen haben Wissenschaftler die Affinität von * P1C10 gemessen.

Affinität * - die Fähigkeit einer Zelle, bestimmte Chemikalien einzufangen und zu binden.

Als Ergebnis betrug die Dissoziationskonstante (Kd) für die Bindung an bEnd.3 ECM 48,38 ± 6,05 nM ( 2d ).

Anschließend beschlossen die Wissenschaftler zu prüfen, ob sich P1C10 an Orten der Zerstörung der BHS im Gehirn der Maus ansammelt.

Mit Farbstoff modifizierte IR800-Klone P1C10 oder RBC36 im nahen Infrarot wurden in einem Volumen von 1 mg / kg in gesunde Labormäuse eingeführt RBC36 ist eine VLR, die das Trisaccharid des menschlichen H-Antigens erkennt, weshalb es als Isotypkontrolle verwendet wurde.

Als nächstes wurde den Mäusen Mannit (hexahydrischer Alkohol) intravenös injiziert, um die BHS vorübergehend zu öffnen. Danach wurden Gehirnbilder von Mäusen aufgenommen, um IR800-Signale zu identifizieren (Bild unten).


Bild Nr. 3

Eine vergleichende Analyse zeigte, dass die Anreicherung von Fluoreszenz im Gehirn (Konzentration der mit IR800-Farbstoff markierten Testsubstanz) bei Verwendung von P1C10-IR800 3,3-mal höher als bei Verwendung von RBC36-IR800 und 7,6-mal höher als bei Verwendung von Kochsalzlösung ist. Folglich reichert sich P1C10 nach einer Fehlfunktion der Blut-Hirn-Schranke selektiv im Gehirn an.

Als nächstes beschlossen die Wissenschaftler zu prüfen, ob das VLR auf die nackte extrazelluläre Matrix abzielen würde. Hierzu wurden zwei Modelle mit murinen GL261- und humanen Glioblastom-U87-Zellen erstellt, die in das Gehirn experimenteller Mäuse eingeführt wurden. Infolgedessen bildeten sich Tumore mit einem chaotischen Gefäßsystem und Punktstörungen der Blut-Hirn-Schranke.

P1C10 oder RBC36 in einem Volumen von 1 mg / kg wurde Mäusen mit eingebettetem GB261-Glioblastom intravenös verabreicht. Nach 30 Minuten wurden Gehirnproben entnommen, um das IR800-Signal (Farbstoff für P1C10 oder RBC36) zu analysieren und zu visualisieren.


Bild Nr. 4

Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der Tumorregion von GL261 bei Mäusen, denen P1C10-IR800 injiziert worden war, war 112-mal höher als in der kontralateralen (gegenüberliegenden) Region des Gehirns ( 4a ). Bei Verwendung von RBC36-IR800 war die Fluoreszenzintensität der Tumorregion jedoch nur 9-mal höher als die Intensität in der gegenüberliegenden Region.

Zusätzlich wurde gefunden, dass die Akkumulation von P1C10-IR800 im Tumor selbst 13-mal höher ist als die Akkumulation von RBC36-IR800.

Diese Beobachtungen bestätigten die Fähigkeit von P1C10, selektiv auf ECM in Mäusetumoren abzuzielen. Jetzt war es notwendig, dieses Talent an menschlichen Hirntumoren zu testen.

VLR wurde Mäusen mit U87 (menschlicher Gehirntumor) verabreicht. Die Wissenschaftler testeten nicht nur P1C10, sondern auch 192, die neben den Gefäßen der Nieren und der Leber sowie der ECM eine selektive Bindung an die basolaterale Seite des Gefäßsystems des Gehirns zeigten.

P1C10, 192 oder RBC36 in einem Volumen von 3 mg / kg wurden intravenös verabreicht und 30 Minuten lang frei zirkulieren gelassen. Danach wurden Proben von interessierenden Organen entnommen, um die Ergebnisse zu visualisieren.

Beide Klon-VLRs (P1C10 und 192) zeigten eine Akkumulation an den Tumorgrenzen, wobei P1C10 im gesamten Tumor-ECM verteilt war ( 4b ). Aber 192 war größtenteils außerhalb der großen Tumorgefäße konzentriert.

Keiner der VLR-Klone akkumulierte in der gesunden kontralateralen Hemisphäre des Maushirns. Und RBC36 fehlte sowohl in den gesunden als auch in den tumorhaltigen Teilen des Gehirns vollständig.

Die quantitative Analyse zeigte, dass sich P1C10 im U87-Tumor 21,2-mal stärker anreichert als in der kontralateralen Region des Gehirns, 21,2-mal in den Nieren, 15,9-mal in der Leber und 29,6-mal im Herzen.

Die Akkumulation von P1C10 und 192 in den Tumorregionen war 25,4- und 11,9-mal höher als die Akkumulation von RBC36. Gleichzeitig akkumulierten beide VLR-Klone hauptsächlich in den Bereichen der Gefäßdefekte des Tumors.

Diese Beobachtungen bestätigen die Wirksamkeit von P1C10 und seinen selektiven Fokus auf Hirn-ECM. Es bleibt abzuwarten, ob P1C10 Medikamente effizient dorthin liefern kann, wo sie benötigt werden.

Wissenschaftler verwendeten VLR in Verbindung mit Doxorubicin-beladenen Liposomen, die dank ihrer eigenen Fluoreszenz stark sichtbar gemacht werden, was den Prozess der Analyse der Wirksamkeit von VLR erheblich vereinfacht. Liposomen wurden mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 94,2 nm und einem Doxorubicingehalt von 1 bis 2 mg / ml erhalten. Als nächstes wurden VLR-Klone an die Liposomen gebunden, die nach dem Kombinieren ihre Bindungsaktivität beibehielten (Bild Nr. 5).


Bild Nr. 5

Um die Durchführbarkeit einer Behandlung mit Doxorubicin-beladenen Liposomen gegen VLRs zu demonstrieren, wurden Tumor-U87-Zellen (kultiviert auf bEnd.3 ECM) mit Doxorubicin-beladenen Liposomen gegen P1C10 oder RBC36 inkubiert.

Beobachtungen zeigten ein signifikantes Wachstum der zerstörten Zellen durch Liposomen, die auf P1C10 abzielen. Die halbmaximale effektive Konzentration betrug 199,0 ± 1,7 nM für P1C10 und 3312,0 ± - 2,6 für RBC36.


Bild Nr. 6

Schließlich testeten die Wissenschaftler den potenziellen therapeutischen Nutzen einer pathologisch geschädigten extrazellulären Matrix des Gehirns. Hierzu wurden Doxorubicin-beladene Liposomen in Kombination mit P1C10, 192 oder RBC36 in experimentellen Mäusen mit U87-Krebszellen verwendet.

Wie in den Bildern 6a und 6b zu sehen ist , ist das Signal von Doxorubicin bei Verwendung von P1C10 viel stärker. Es ist ersichtlich, dass dieses Signal innerhalb des Tumors ausreichend lokalisiert ist und die kontralaterale (gesunde) Region des Gehirns nicht beeinflusst.

Die Bilder 6c und 6d zeigen, dass die Akkumulation von P1C10 in der Tumorregion 7,6-mal höher ist als in der gesunden Region. Wenn wir den Akkumulationsgrad von P1C10 mit RBC36 vergleichen, beträgt die Differenz das 7,9-fache zugunsten von P1C10.

Für 4 Wochen (an den Tagen 7, 14, 21 und 28) wurden 12 mg / kg Doxorubicin experimentellen Mäusen mit U87 unter Verwendung von P1C10, 192 oder RBC36 verabreicht.

Nach der Einführung des Tumors betrug das mediane Überleben: 43 Tage für P1C10, 30 Tage für 192 und 28 Tage für RBC36.

Eine Gruppe von Probanden mit P1C10 zeigte eine signifikante Steigerung des Überlebens im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen. Gleichzeitig unterscheiden sich die Indikatoren 192 und RBC36 nicht signifikant von den Indikatoren der Kontrollgruppen, die überhaupt nicht behandelt wurden.

Um die Nuancen der Studie genauer kennenzulernen, empfehle ich Ihnen, den Bericht von Wissenschaftlern zu lesen .

Nachwort

Es würde kein Glück geben, aber das Unglück half. Mit diesem Satz können Sie diese Studie ziemlich genau beschreiben. Wissenschaftler verwendeten pathologische Störungen der Blut-Hirn-Schranke als Instrument zur Abgabe von Arzneimitteln an bestimmte Bereiche des Gehirns, die von einem Tumor betroffen sind, während gesunde Bereiche vermieden wurden. Und die Wissenschaftler erhielten Hilfe bei diesem komplexen und edlen Unterfangen, von wo aus sie nicht warteten. Neunaugen mit variablen Rezeptorlymphozyten (VLR) wurden zur Grundlage dieser Arbeit. Jetzt kann man mit Sicherheit sagen, dass sogar Parasiten nützlich sein können.

Die Behandlung von Hirntumoren ist mit einer Vielzahl von Schwierigkeiten behaftet, und der Erfolg dieses Prozesses ist nicht so groß, wie wir es uns wünschen. Die Schaffung neuer Methoden und Mittel zur Bekämpfung derart schwerwiegender Krankheiten ist wirklich das, wofür die Wissenschaft existiert. Wenn wir die Welt um uns herum und in uns selbst kennen, widersprechen wir nicht dem Willen der Natur, wir beginnen sie nur besser zu verstehen, finden neues Wissen und wenden es für immer an.


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