Gestorbener Nobelpreisträger Carey Mullis - Erfinder der DNA-Polymerasekettenreaktion

In Kalifornien starb im Alter von 74 Jahren der amerikanische Nobelpreisträger für Chemie Carey Mullis. Nach Angaben seiner Frau ereignete sich der Tod am 7. August. Der Grund ist Herz- und Atemversagen aufgrund einer Lungenentzündung.

James Watson, der Entdecker des DNA-Moleküls, wird uns über seinen Beitrag zur Biochemie und über den Nobelpreis berichten.

Auszug aus dem Buch von James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis

DNA Die Geschichte der genetischen Revolution

Kapitel 7. Das menschliche Genom. Lebensskript

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Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde 1983 vom Biochemiker Cary Mullis erfunden, der bei Cetus arbeitete. Die Entdeckung dieser Reaktion war bemerkenswert. Mullis erinnerte sich später: „Einmal an einem Freitagabend im April 1983 schien es mich zu erleuchten. Ich fuhr auf einer mondhellen, kurvenreichen Bergstraße nach Nordkalifornien, dem Rand der Redwood-Wälder. “ Es ist beeindruckend, dass er in einer solchen Situation von Inspiration besucht wurde. Und es ist überhaupt nicht so, dass es in Nordkalifornien spezielle Straßen gibt, die Einsicht fördern. Es war nur so, dass sein Freund Mullis einmal rücksichtslos auf einer vereisten Zwei-Wege-Straße rasen sah, und das störte ihn überhaupt nicht. Ein Freund erzählte der New York Times Folgendes: „Mullis träumte davon, dass er sterben würde, wenn er gegen Mammutbäume krachte. Deshalb hat er keine Angst, etwas zu fahren, wenn Redwoods nicht entlang der Straße wachsen. “ Das Vorhandensein von Mammutbäumen entlang der Straße ließ Mullis sich konzentrieren und ... hier ist es, eine Einsicht. Für seine Erfindung im Jahr 1993 erhielt Mullis den Nobelpreis für Chemie und ist seitdem in seinen Handlungen noch seltsamer geworden. Zum Beispiel ist er ein Befürworter der revisionistischen Theorie, dass AIDS nicht mit HIV zusammenhängt, was seinen eigenen Ruf erheblich untergrub und Ärzte verhinderte.

PCR ist eine ziemlich einfache Reaktion. Um dies durchzuführen, benötigen wir zwei chemisch synthetisierte Primer, die zu den entgegengesetzten Enden der verschiedenen Ketten des gewünschten DNA-Fragments komplementär sind. Primer sind kurze Abschnitte einzelsträngiger DNA mit einer Länge von jeweils etwa 20 Basenpaaren. Die Besonderheit der Primer besteht darin, dass sie den Regionen der DNA entsprechen, die Sie amplifizieren möchten, dh der DNA-Matrize.


(Bild anklickbar) Cary Mullis, Erfinder der PCR

Die Spezifität der PCR basiert auf der Bildung komplementärer Komplexe zwischen der Matrix und den Primern, kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Jeder der Primer ist komplementär zu einer der Ketten der doppelsträngigen Matrix und begrenzt den Anfang und das Ende der amplifizierten Region. Tatsächlich stellt die resultierende „Matrix“ ein ganzes Genom dar, und unser Ziel ist es, Fragmente, die für uns von Interesse sind, daraus zu isolieren. Dazu wird die doppelsträngige DNA-Matrize einige Minuten auf 95 ° C erhitzt, so dass die DNA-Ketten dispergiert werden. Diese Stufe wird Denaturierung genannt, da die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden DNA-Ketten zerstört werden. Wenn die Ketten offen sind, wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer die Einzelkettenschablone kontaktieren können. Die DNA-Polymerase beginnt die DNA-Replikation durch Bindung an eine Länge einer Nukleotidkette. Das DNA-Polymeraseenzym repliziert die Matrizenkette unter Verwendung eines Primers als Keim- oder Kopienbeispiel. Als Ergebnis des ersten Zyklus erhalten wir eine mehrfache sequentielle Verdoppelung einer bestimmten DNA-Region. Als nächstes wiederholen wir diesen Vorgang. Nach jedem Zyklus erhalten wir die Zielfläche in doppelter Menge. Nach fünfundzwanzig PCR-Zyklen (dh in weniger als zwei Stunden) haben wir eine interessierende DNA-Region in einer Menge, die 225-mal größer ist als das Original (dh wir haben sie etwa 34 Millionen Mal amplifiziert). Tatsächlich erhielten wir am Eingang eine Mischung aus Primern, Matrizen-DNA, dem DNA-Polymeraseenzym und den freien Basen A, C, G und T, die Menge an spezifischem Reaktionsprodukt (begrenzt durch Primer) wächst exponentiell und die Anzahl der "langen" DNA-Kopien ist daher linear Reaktionsprodukte dominieren.


Amplifikation einer gewünschten DNA-Stelle: Polymerasekettenreaktion

Zu Beginn der PCR war das Hauptproblem wie folgt: Nach jedem Erhitzungs-Kühl-Zyklus musste dem Reaktionsgemisch DNA-Polymerase zugesetzt werden, da diese bei 95 ° C inaktiviert wurde. Daher musste es vor jedem der 25 Zyklen erneut hinzugefügt werden. Das Reaktionsverfahren war relativ unwirksam, es erforderte viel Zeit und das Polymeraseenzym, und das Material ist sehr teuer. Zum Glück kam Mutter Natur zur Rettung. Viele Tiere fühlen sich bei Temperaturen weit über 37 ° C wohl. Und warum wurde uns die 37 ° C wichtig? Dies geschah, weil diese Temperatur für E. coli optimal ist, aus dem das Polymeraseenzym für die PCR ursprünglich erhalten wurde. In der Natur gibt es Mikroorganismen, deren Proteine ​​über Millionen von Jahren natürlicher Selektion gegenüber hohen Temperaturen resistenter geworden sind. Es wurde vorgeschlagen, DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien zu verwenden. Diese Enzyme waren thermostabil und konnten vielen Reaktionszyklen standhalten. Ihre Verwendung ermöglichte es, die PCR zu vereinfachen und zu automatisieren. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert, das in den heißen Quellen des Yellowstone-Nationalparks lebt und als Taq-Polymerase bezeichnet wird.

Die PCR wurde schnell zum Hauptarbeitspferd des Humangenomprojekts. Im Allgemeinen unterscheidet sich der Prozess nicht von dem von Mullis entwickelten, er wurde lediglich automatisiert. Wir waren nicht länger auf die Menge von Studenten mit blinden Augen angewiesen, die akribisch Flüssigkeitströpfchen in Plastikschläuche gossen. In modernen Labors, die molekulargenetische Forschung betreiben, werden diese Arbeiten an Roboterförderern durchgeführt. PCR-Roboter, die an einem so großen Sequenzierungsprojekt wie dem Humangenom beteiligt sind, arbeiten unermüdlich mit riesigen Mengen hitzebeständiger Polymerase. Einige Wissenschaftler, die am Humangenomprojekt beteiligt waren, waren empört über die ungerechtfertigt hohen Beiträge, die der PCR-Patentinhaber, der europäische Industrie- und Pharmakonzern Hoffmann-LaRoche, zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien hinzufügt.

Eine weitere „treibende Kraft“ war die DNA-Sequenzierungsmethode selbst. Die chemische Grundlage dieser Methode war zu dieser Zeit nicht mehr neu: Das Interstate Project Human Genome (HGP) übernahm dieselbe geniale Methode, die Fred Senger Mitte der 1970er Jahre entwickelte. Die Innovation lag in der Größe und dem Automatisierungsgrad, die während der Sequenzierung erreicht wurden.

Die automatische Sequenzierung wurde ursprünglich im Labor von Lee Hood am California Institute of Technology entwickelt. Er absolvierte die High School in Montana und spielte als Stürmer American Football. Dank Hood hat das Team mehr als einmal die Staatsmeisterschaft gewonnen. Teamfähigkeit war für ihn in seiner wissenschaftlichen Karriere von Vorteil. Hoods Labor beschäftigte eine bunte Firma von Chemikern, Biologen und Ingenieuren, und bald wurde sein Labor führend in technologischen Innovationen.

Tatsächlich wurde die Methode der automatischen Sequenzierung von Lloyd Smith und Mike Hunkapiller erfunden. Mike Hunkapiller, der dann in Hoods Labor arbeitete, wandte sich an Lloyd Smith und bot ihm eine verbesserte Sequenzierungsmethode an, bei der die Basen jedes Typs jeweils in ihrer eigenen Farbe lackiert wurden. Eine solche Idee könnte die Wirksamkeit des Senger-Prozesses vervierfachen. Sanger bildet bei der Sequenzierung in jedem der vier Röhrchen (entsprechend der Anzahl der Basen) unter Beteiligung der DNA-Polymerase einen einzigartigen Satz von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge, einschließlich einer Primersequenz. Als nächstes wurde Formamid zu den Röhrchen gegeben, um die Ketten zu trennen, und eine Polyacrylamidgelelektrophorese wurde auf vier Spuren durchgeführt. In der Smith- und Hunkapiller-Variante werden die Didesoxynukleotide mit vier verschiedenen Farbstoffen markiert und die PCR in einem Röhrchen durchgeführt. Während der Polyacrylamid-Gelelektrophorese regt ein Laserstrahl an einer bestimmten Stelle im Gel die Aktivität der Farbstoffe an, und der Detektor bestimmt, welches Nukleotid gerade durch das Gel wandert. Anfangs war Smith pessimistisch - er befürchtete, dass die Verwendung extrem niedriger Dosen des Farbstoffs dazu führen würde, dass die Nukleotidregionen nicht zu unterscheiden wären. Da er sich mit Lasertechnologien auskannte, fand er bald einen Ausweg mit speziellen Fluorochrom-Farbstoffen, die unter dem Einfluss von Laserstrahlung fluoreszieren.


(Vollversion per Klick - 4,08 MB) Kleingedrucktes: DNA-Sequenz, die mit einem automatischen Sequenzer dekodiert wurde, der von einem automatischen Sequenziergerät erhalten wurde. Jede Farbe hat eine von vier Basen.

In der klassischen Version der Sanger-Methode fungiert einer der Stränge der analysierten DNA als Matrix für die Synthese eines komplementären Strangs durch das DNA-Polymeraseenzym. Anschließend wird die Sequenz der DNA-Fragmente nach Gelgröße sortiert. Jedes Fragment, das während der Synthese in der DNA enthalten ist und anschließend die Visualisierung von Reaktionsprodukten ermöglicht, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der der terminalen Base entspricht (dies wurde auf Seite 124 erörtert). Daher ist die Fluoreszenz dieses Fragments ein Identifikator für eine gegebene Base. Dann bleibt nur noch der Nachweis durchzuführen und die Reaktionsprodukte sichtbar zu machen. Die Ergebnisse werden unter Verwendung eines Computers analysiert und als eine Folge von mehrfarbigen Peaks dargestellt, die vier Nukleotiden entsprechen. Ferner werden die Informationen direkt an das Computerinformationssystem übertragen, wodurch der zeitaufwändige und manchmal schmerzhafte Dateneingabeprozess entfällt, der die Sequenzierung erheblich erschwert.

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