Verlangsamung des Alterns mit Arzneimittelsynergien bei C. elegans

Der Hauptzweck des Einsatzes von Medikamenten, die den Alterungsprozess verlangsamen, ist die Verlängerung eines gesunden und aktiven Lebens. Letzteres zielt wiederum darauf ab, das wirtschaftliche Wohlergehen der schnell alternden Bevölkerung des Planeten zu verbessern. Damit eine pharmakologische Intervention allgemein zugelassen werden kann, müssen Arzneimittel bei jedem Erwachsenen wirksam sein und ein gutes Sicherheitsprofil aufweisen. In diesem Artikel haben wir gezeigt, dass wir mit Hilfe von Arzneimitteln, die der Wissenschaft bereits bekannt sind, die Lebenserwartung von C. elegans signifikant erhöhen konnten. Die Verlängerung der Lebensdauer des Wurms wurde durch Veränderung der Aktivität mehrerer evolutionär konservativer Signalwege erreicht, die mit dem Altern verbunden sind. Aufgrund des Einflusses auf verschiedene Signalwege mit einem gemeinsamen synergistischen Effekt hoffen wir, dass wir den Alterungsprozess verlangsamen, die Lebensdauer verdoppeln und die Dauer einer gesunden Lebensperiode mehr als verdoppeln können, ohne kompensatorische Veränderungen in der körperlichen Entwicklung und Aktivität.

Soweit wir wissen, war die Lebenserwartung von C. elegans-Nematoden bei Erwachsenen mit Medikamenten in unserer Arbeit am höchsten. Wir verwendeten Medikamente, die ursprünglich zur Behandlung verschiedener Krankheiten bei Erwachsenen bestimmt waren. Die Entwicklung einer Methode, die auf der Verwendung bereits zugelassener Arzneimittel basiert, die gleichzeitig auf mehrere mit dem Altern verbundene Signalwege wirken, wird als sehr vielversprechend angesehen. Es kann dazu führen, dass die Entwicklung von altersbedingten Krankheiten und körperlicher Asthenie der älteren Bevölkerung der Welt, die schnell altert, verhindert wird.

Einleitung

Eine der wichtigsten Phasen in der Wissenschaft des Alterns war die Entdeckung evolutionär-konservativer Signalwege, die für die Regulierung der Lebensdauer des Körpers verantwortlich sind. Mutationen in Genen, die diese Signalwege beeinflussen, können bei Modellorganismen zu einer Verlängerung der Lebenserwartung von 30 auf 100% führen. Kombinierte Genmutationen können einen synergistischen Effekt verursachen, der die Lebensdauer verlängert. Die Wirkung pharmakologischer Interventionen ist normalerweise viel schwächer als die genetischer Mutationen, selbst wenn sie auf dieselben Signalwege wirken.

Das Vorhandensein eines synergistischen Effekts mit mehreren kombinierten Genstörungen legt nahe, dass die Verwendung solcher Medikamente, die gleichzeitig mehrere evolutionär konservative Signalwege beeinflussen, eine mögliche vielversprechende Richtung wird. Bisher wurden nur wenige Daten zum synergistischen Effekt des Drogenkonsums zur Erhöhung der Lebenserwartung aufgezeichnet. In diesem Artikel berichten wir über die Ergebnisse einer neuen In-vivo-Studie, in der solche Medikamente verwendet wurden. Wir haben gezeigt, wie eine Kombination von Arzneimitteln die Wirkung der Therapie maximieren kann, da sie auf mehrere Signalwege wirken und sich gegenseitig verstärken. Gleichzeitig war es möglich, die Häufigkeit von Nebenwirkungen und das Ausmaß kompensatorischer Störungen bei der Entwicklung des Körpers zu minimieren, da Punktänderungen in getrennten, aber wechselwirkenden Signalwegen vorgenommen wurden. Das letztendliche Ziel der Studie war die Entwicklung eines pharmakologischen Regimes für die erwachsene Bevölkerung mit einem nachgewiesenen Effekt auf den Alterungsprozess, der gleich oder größer als der Effekt von Mutationen war.

Da es derzeit nur wenige allgemein anerkannte biologische Marker für das Altern gibt, vergleichen sie zur Bewertung der Ergebnisse der Studie lediglich die Gesamtlebensdauer von Organismen. Ein Nematode der Art Caenorhabditis elegans wurde als kurzlebiger Modellorganismus verwendet. Als nächstes wählten wir mehrere Arzneimittelkombinationen aus, so dass zwei Gruppen von Arzneimitteln erstellt wurden, in denen sich jeweils drei Arzneimittel befanden. Wie bereits in Studien veröffentlicht, gab es bei der Verwendung dieser Arzneimittelkombinationen einen signifikanten Unterschied bei der Erhöhung der Lebenserwartung und der Verlängerung des gesunden Lebens von C. elegans-Nematoden.

Der mit der Wirkstoffkombination erzielte synergistische Effekt erwies sich als vergleichbar mit dem nach gerichteten Mutationen in den mit dem Altern verbundenen bekannten Genen beobachteten. Wir haben keine kompensatorischen Störungen in der Entwicklung von Organismen festgestellt, die häufig gefunden und mit pharmakologischen Eingriffen verbunden sind. Wir konnten indirekt feststellen, dass die medikamentöse Therapie die natürliche Alterungsrate verlangsamte, da das Niveau einiger Marker anstieg. Darüber hinaus kamen wir zu dem Schluss, dass TGFβ (Transforming Growth Factor β1) ein Schlüsselfaktor ist, der den synergistischen Effekt des Signalwegs liefert. Darüber hinaus zeigte die Studie, dass bei Nematoden, die mit den obigen Wirkstoffkombinationen behandelt wurden, das Verhältnis von einfach ungesättigten zu mehrfach ungesättigten Lipiden die Prävalenzseite der ersteren veränderte (Erhöhung des Verhältnisses von MUFA zu PUFA) und der Grad der Peroxidation von Membranlipiden abnahm. Schließlich bestätigten wir, dass ein ähnlicher synergistischer Effekt auch bei Fruchtfliegen der Art Drosophila melanogaster festgestellt wurde.

Ergebnisse

Wahl der Signalwege und Ziele bei C. Elegans.

Basierend auf moderner wissenschaftlicher Literatur haben wir verschiedene evolutionär konservative Signalwege und Mechanismen im Zusammenhang mit dem Altern gefunden (Hintergrundmaterial, Tabelle S1). Unter den von uns ausgewählten Zielen und Mechanismen waren: AMP-aktivierte Proteinkinase, c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), Rapamycin-Ziel von Säugetieren (mTOR) und Mechanismen, die an den Prozessen beteiligt sind: Kalorienrestriktion (CR), Mitogomese (die Wirkung niedriger Substanzdosen) die in großen Dosen toxisch sind) und mitochondrialen Stoffwechsel. Die oben genannten Ziele und Prozesse gelten als die wichtigsten bei der Regulierung von Signalwegen, die das Leben verlängern. Für jeden Signalweg wurden Arzneimittel bestimmt, deren Auswirkung auf die Langlebigkeit in mindestens einem der bekannten Modellorganismen (Nematoden, Fruchtfliegen oder Mäuse) beschrieben wurde.

Von Menschen getestete Medikamente waren für uns von besonderem Interesse. Daher bevorzugten wir Arzneimittel mit erklärter Wirksamkeit bei Säugetieren oder zugelassen beim Menschen. Zunächst fanden wir 11 potenzielle Medikamente, die die oben genannten Kriterien erfüllen (Hilfstabelle S1). Wir haben Allantoin zu unserer Liste hinzugefügt, basierend auf einem Bericht über seine Fähigkeit, das Leben in C. elegans zu verlängern, und den Ergebnissen der Transkriptionsanalyse. Wir haben den Verdacht, dass sich sein Wirkmechanismus von anderen Substanzen unterscheidet. Um Fehler bei der Messung der Lebenserwartung von Organismen nach dem Gebrauch von Arzneimitteln zu vermeiden, haben wir den Auftragnehmer zunächst mit der Blindmethode getestet. Der Hauptgrund dafür war die Tatsache, dass die Ergebnisse der Studie stark von der Richtigkeit der Versuchsbedingungen abhängen und zwischen verschiedenen Labors erheblich variieren können. Wir haben nur die Dosen von Medikamenten verwendet, die zuvor in wissenschaftlichen Arbeiten beschrieben wurden. Die Wirksamkeit von fünf Arzneimitteln, die die Lebenserwartung beeinflussen, wurde in unserem Labor wiederholt bestätigt (Abb. 1, Tabelle S2). In unserer Studie war die Wirksamkeit von Verbindungen, die mit einer Verlängerung der Lebensdauer von Organismen verbunden sind, in der Regel geringfügig geringer als in zuvor veröffentlichten Arbeiten (Ergänzungsschema 1, Tabelle S2).


Abb. 1

Transkript, Drogen und Langlebigkeit

Um die Wirksamkeit der Arzneimittel in der Studie zu bewerten, führten wir eine Transkriptomanalyse durch, bestimmten differentiell exprimierte Gene (DEG) und bereicherten die Signalwege in Bezug auf die Kontrolle. Wir stellten bestimmte Unterschiede in der Genexpression und der Signalwegaktivität in der Versuchsgruppe fest, die nicht in der Kontrollgruppe waren. Die signifikantesten Veränderungen der Genexpression und der Signalwege wurden durch die Wirkung einer Wirkstoffkombination aus Rifampicin, Rapamycin und Psora-4 (PSORA) verursacht, wobei das letzte Wirkstoff nach den ersten beiden verabreicht wurde. Im Gegensatz zu den genannten Arzneimitteln beeinflussten Metformin (MET) und Allantoin (ALLAN) die Expression weniger Gene (Schema 2a, Tabelle S3).

Die Analyse der Transkriptionsergebnisse zeigte, dass jede Arzneimittelsubstanz ein eigenes Profil der Gene hatte, die sie veränderte. Gleichzeitig wurden einige dieser Gene auch in den Transkriptionsprofilen der verbleibenden Wirkstoffe gefunden (Schema 2a). So wirkte MET auf die Arbeit vieler „populärer“ Gene ein, aber die Anzahl der beteiligten einzigartigen Gene war minimal. MET- und PSORA-Präparate veränderten die Aktivität fast des gesamten Spektrums „populärer“ Gene, von denen einige auch individuell von den in Schema 2a gezeigten Arzneimitteln betroffen waren.

Die ALLAN-Verbindung wirkte sich auf die geringste Anzahl von Genen aus, die meisten gehörten jedoch zu einer einzigartigen Gruppe. Weniger als die Hälfte seiner Gene war im Transkriptionsspektrum anderer Arzneimittel vertreten. Die Wirkung der Verwendung von RIF und RAP unterschied sich signifikant voneinander und von allen anderen Arzneimitteln. Basierend auf den drei Kriterien der Hauptkomponentenanalyse (PCA) kamen wir zu dem Schluss, dass RIF, RAP und PSORA sehr unterschiedlich von den übrigen Arzneimitteln sind. Im Gegensatz dazu waren die Wirkungen von ALLAN und MET variabler, aber sehr ähnlich. Darüber hinaus lagen ihre Ergebnisse etwas nahe an den Ergebnissen der Kontrollgruppe.










Abb.2

Im nächsten Schritt haben wir festgestellt, wie verschiedene Wirkstoffkombinationen die Lebensdauer von Nematoden beeinflussen. Da die Wirkungen von MET und RAP leichter auf den Menschen übertragen werden können, haben wir diese Medikamente zunächst untersucht. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Kombination von MET und RAP bei optimalen Dosen von 50 mg und 100 mg nicht zu einer noch längeren Verlängerung des Lebens führte (Ergänzungsschema 2 J, P). Wir haben mehrere weitere Studien durchgeführt, in denen alle möglichen Kombinationen dieser Arzneimittel in optimalen und halboptimalen Dosen verwendet wurden (zusätzliches Schema 2 JP).

Die Verwendung von MET und RAP in ihren halboptimalen Dosen führte zu einer Erhöhung der maximalen Lebensdauer der Nematoden (Schema 2e, zusätzliches Schema 2 m, s), jedoch nicht der durchschnittlichen Lebenserwartung (zusätzliches Schema, 2p). Dieser leichte Vorteil von MET und RAP steht im Einklang mit den Ergebnissen einer anderen Studie an Mäusen. Es zeigte sich, dass die Zugabe von MET zu RAP hauptsächlich das Leben von Männern verlängerte, und bei Frauen war das Ergebnis kaum wahrnehmbar (wenn es überhaupt aufgezeichnet wurde).

Als nächstes haben wir nacheinander die Wirkungen von 10 Wirkstoffkombinationen herausgefunden. In jeder Arzneimittelkombination gab es zwei der fünf möglichen Arzneimittel (Ergänzungsschema 2 ai). Die Analyse des synergistischen Effekts wurde unter Verwendung des HSA-Modells (Higher Single Activity Model) durchgeführt, das den Aktivitätsgrad eines der beiden Arzneimittel schätzt.

Das Ergebnis der kombinierten Verwendung verschiedener Arzneimittel wurde als synergistisch angesehen, vorausgesetzt, es übertraf das Ergebnis, das aus der Wirkung jedes Arzneimittels einzeln und bei gleichen Dosierungen der Arzneimittel erhalten wurde, erheblich. In Anbetracht der obigen Definition stellten wir fest, dass nur zwei von zehn Wirkstoffkombinationen einen synergistischen Effekt hatten (Schema 2c, d, Ergänzungsschema 2 und unterstützende Tabelle S2), der mit einer Wirkstoffkombination fixiert wurde: RIF mit RAP und RIF mit PSORA. Mit diesen Arzneimitteln konnten drei verschiedene Arzneimittelkombinationen hergestellt werden, von denen sich laut PCA-Analyse jedoch nur zwei am stärksten voneinander unterschieden. In den letzten beiden Fällen wurde ein synergistischer Effekt festgestellt (Schema 2b, zusätzliches Schema 4a, b).

Unter den verbleibenden 8 Arzneimittelpaaren war der Effekt auf die Lebenserwartung in 4 Fällen der gleiche wie für das wirksamste Arzneimittel in der entsprechenden Arzneimittelkombination. In 4 anderen Kombinationen schloss die Wirkung eines Arzneimittels die Wirkung eines anderen gegenseitig aus. Im letzteren Fall wurden auch das Fehlen toxischer Reaktionen und eine Verlängerung der Lebensdauer festgestellt (Ergänzungsschema 2, Tabelle S2).

In unserer Studie führte die Verwendung von zwei Arzneimittelkombinationen mit synergistischer Wirkung zu einer signifikanteren Verlängerung des Lebens im Vergleich zu Daten, die zuvor in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht wurden. Der Anstieg der Lebenserwartung nach dem Drogenkonsum war jedoch weniger als ein ähnlicher Effekt von Mutationsstörungen. In diesem Zusammenhang haben wir Fragen: Sind die tatsächlichen Überlebensraten das Maximum, das mit einer medikamentösen Behandlung erwachsener Tiere erreicht werden kann? Erhalten wir eine zusätzliche Verlängerung der Lebensdauer durch Zugabe anderer Verbindungen? Wenn die Wirkstoffkombination drei Wirkstoffverbindungen enthält, steigt die Anzahl der möglichen Kombinationen auf 30. Wir hatten keine Gelegenheit, eine solche Anzahl von Wirkstoffkombinationen zu überprüfen.

Daher haben wir die Wirkung einiger dreifacher Wirkstoffkombinationen selektiv untersucht. Zunächst betrachteten wir eine Kombination von Arzneimitteln, bei denen sich alle drei Arzneimittelverbindungen aufgrund der Kriterien der PCA-Methode am stärksten voneinander unterschieden. Eine weitere Bedingung war das Vorhandensein einer synergistischen Wirkung des Arzneimittels in Verbindung mit anderen Arzneimitteln (RAP, RIF und PSORA). Die Lebenserwartung der Nematoden bei Verwendung einer Kombination der drei Arzneimittel war jedoch schlechter als bei Verwendung einer doppelten Arzneimittelkombination (Ergänzungsschema 3a, Tabelle S2). Dann testeten wir die Wirksamkeit der dreifachen Kombination von Arzneimitteln, zu der das ALLAN-Arzneimittel mit einem einzigartigen Profil der beteiligten Gene gehörte (helloranger Bogen, Schema 2a).

Das Aktivitätsprofil der ALLAN-Gene stimmte nicht mit dem Profil der aktiven Gene anderer Arzneimittel überein. Es unterschied sich auch vom Spektrum des mutierten Transkriptoms eat-2. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die ALLAN-Verbindung einen einzigartigen Wirkmechanismus aufweist, und fügten ihn daher zu den beiden Kombinationspaaren hinzu, die einen synergistischen Effekt zeigten. In beiden Fällen wurde ein statistisch signifikanter Anstieg der durchschnittlichen Lebenserwartung und ihres Maximums beobachtet (Schema 2f, g, zusätzliches Schema 3d-f und Hilfstabelle s2). Das beste Ergebnis war die Kombination von drei Arzneimitteln: RAP, RIF und ALLAN, wodurch sich die durchschnittliche Lebensdauer der Würmer verdoppelte und der Median und das Maximum 44 bzw. 50 Tage erreichten (Hilfstabelle s2). Der resultierende Effekt war vergleichbar mit dem Effekt von Mutationsstörungen. Nach unseren Informationen erwies sich diese Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans als die größte, die jemals in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht wurde, wenn Arzneimittel bei Erwachsenen angewendet wurden.

Der Mechanismus der Arzneimittelsynergie

Daf-16 / FOXO ist ein Transkriptionsfaktor, der eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Lebensdauer von Modellorganismen und wahrscheinlich auch von Menschen spielt. Um den Mechanismus der synergistischen Wirkung der von uns identifizierten Wirkstoffkombinationen zu untersuchen, haben wir ihre Wirksamkeit bestimmt, wenn die Würmer eine Mutation aufwiesen, die im Daf-16-Signalweg negativ war. Die Wirkung von Arzneimitteln wie RAP oder ALLAN, die getrennt eingenommen wurden, war unabhängig vom Daf-16-Signalweg. Im Vergleich dazu war die Verlängerung der Lebenserwartung mithilfe von RIF vollständig auf die Arbeit des Daf-16-Signalwegs und teilweise auf PSORA zurückzuführen (Schema 3a, zusätzliches Schema 8).

Die synergistische Kombination von RAP + RIF-Arzneimitteln umfasste ein RIF-Arzneimittel, dessen Wirkung vollständig vom Daf-16-Weg abhing, und ein anderes RAP-Arzneimittel mit einer von diesem Signalweg unabhängigen Wirkung. Bei kombinierter Verwendung von RIF + PSORA-Präparaten wurde auch ein synergistischer Effekt festgestellt, obwohl die Aktivität der Arzneimittel mit der Funktion des Daf-16-Signalwegs verbunden war und der Nematode ein mutiertes Daf-16-Gen aufwies (Schema 3a, zusätzliches Schema 8).

Solche Ergebnisse waren unerwartet, da sich herausstellte, dass der synergistische Effekt nicht nur durch den Daf-16-Weg verursacht wurde: Dieser Effekt wurde bei Mutanten der Daf-16-Genwürmer unter Verwendung von Arzneimitteln erzielt, deren Wirkung ganz oder teilweise von der Funktion dieses Gens abhing.


Abb.3

Nach Angaben verschiedener Autoren waren einige der von uns getesteten Arzneimittel CR-Mimetika (Kalorienrestriktion), d.h. Arzneimittel, die den im Körper natürlich synthetisierten Verbindungen ähnlich sind und für eine Verringerung des Appetits verantwortlich sind. Wir haben die Modelle der eat-2-Mutante C. elegans verwendet, um herauszufinden, ob Wirkstoffkombinationen und ihre synergistischen Wirkstoffe die CR-Signalwege beeinflussen. Nur die RIF-Verbindung verlängerte die Lebensdauer von Eat-2-Mutanten-Nematoden. Daher gehörten alle anderen außer RIF-Präparaten zu CR-Mimetika.

Somit gehörte in zwei Arzneimittelkombinationen, RAP + RIF und RIF + PSORA, eine Verbindung zu CR-Mimetika, und die Wirkung der anderen hing nicht von der eat-2-Mutation ab. Die kombinierte Anwendung von RIF und PSORA führte zu einer Verlängerung der Lebensdauer von Nematoden, während die Zugabe von ALLAN zu dieser Wirkstoffkombination keinen Einfluss auf die Verlängerung der Lebensdauer der Würmer hatte. Wir glauben, dass dieses Muster auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass ALLAN in dieser Kombination von Arzneimitteln das zweite CR-Mimetikum war.

Um den Mechanismus der Arzneimittelsynergie weiter zu untersuchen, haben wir ein Transkriptomprofil von Arzneimittelkombinationen mit einem synergistischen Effekt und einer Arzneimittelkombination ohne einen solchen Effekt erstellt. Nematoden erhielten eine, zwei oder drei Arzneimittelverbindungen, um das Vorhandensein oder Fehlen dieses Effekts nachzuweisen. Das Transkript einzelner Arzneimittel, die CR-Mimetika zugeordnet waren, wurde in derselben Region wie das Transkriptomprofil von eat-2-Mutantenorganismen geclustert. Im Gegensatz dazu hatte die RIF-Verbindung keine CR-mimetische Aktivität und ihr Transkript unterschied sich von den Ergebnissen der Transkriptionsanalyse von eat-2-Mutanten und anderen Arzneimitteln (Schema 2h).

Es ist interessant festzustellen, dass sich die Transkriptome von Wirkstoffkombinationen mit synergistischer Wirkung und die Muster ihrer Genexpression sowohl von der Expression einzelner in der Kombination enthaltener Wirkstoffe als auch von den eat-2-Mutanten unterschieden (Schema 2h, zusätzliches Schema 4 c, d). Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde bei Verwendung von doppelten und dreifachen synergistischen Wirkstoffkombinationen häufig der TFGβ-Signalweg vorgestellt (Schema 4a, zusätzliches Schema 6c, 7a, Hilfstabelle s4). Zusätzlich verglichen wir mit einem Transkript die Kombination von Arzneimitteln mit einem Transkript der darin enthaltenen Arzneimittelverbindungen, wobei letztere in diesem Fall als Kontrollgruppe diente (siehe Methoden). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe erhöhten Arzneimittelkombinationen mit synergistischer Wirkung die Aktivität von TGFβ und mehreren anderen Signalwegen.In Wirkstoffkombinationen ohne synergistische Wirkung waren solche Wege im Transkriptionsprofil nicht dargestellt (Hilfstabelle s5).

Einige Arzneimittelkombinationen verlängerten die Lebensdauer von eat-2 auf mutierte Nematoden, aber es gibt keine einzelnen Arzneimittel in diesen Kombinationen. Wir beschlossen zu prüfen, ob die eat-2-Mutanten nach synergistischen Kombinationen im Gegensatz zu eat-2-Würmern ohne medikamentöse Therapie eine erhöhte Aktivität des TGFβ-Signalwegs aufweisen. Der einzige Signalweg, der nach Verwendung einer der synergistischen Wirkstoffkombinationen im Transkript merklich vorhanden war, war der TGFβ-Weg (Ergänzungsschema 7b, Tabelle S6). Es war eine völlige Überraschung für uns, dass dieser Weg ausschließlich durch die Wirkung synergistischer Kombinationen von Wirkstoffverbindungen bestimmt wurde (Schema 4b, zusätzliches Schema 7a, c, Hilfstabelle s7).












Abb. 4

Bedeutung des TGFβ-Signalwegs für die Arzneimittelsynergie

Die in unserer Studie offenbarte Aktivierung des TGFβ-Signalwegs könnte der Hauptmechanismus sein, durch den ein synergistischer Effekt erzielt wird, der die Lebensdauer von Modellorganismen verlängert. Zuvor wurde in Studien festgestellt, dass die TGF-Mutation (daf-7) über den Insulinsignalweg zu einer Verlängerung der Lebensdauer führte. Beide Mediatoren daf-2 und daf-7 regulierten auch die Transkription von daf-16-abhängigen Genen (Supplementary Scheme 7d). Wir fragten uns, ob es mit Hilfe der ausgewählten Wirkstoffkombinationen möglich war, die Lebensdauer von daf-2-Mutanten zu verlängern, obwohl die Lebenserwartung von Tieren aufgrund dieser Mutation bereits höher war. Zunächst haben wir die Lebensdauer von daf-2-mutierten Nematoden nach jeder Wirkstoffkombination bestimmt.

Die Verlängerung der Lebensdauer wurde in RAP-haltigen Kombinationen aufgezeichnet: RAP + RIF und RAP + RIF + ALLAN. Die Wachstumsrate war jedoch fast dieselbe wie bei Verwendung nur des RAP-Arzneimittels. Ein synergistischer Effekt, der die Lebensdauer von Nematoden verlängert, wurde bei keiner Wirkstoffkombination beobachtet (Schema 3c, zusätzliches Schema 8, Hilfstabelle s2). Die Wirkung von PSORA trug auch zu einer Verlängerung der Lebensdauer von daf-2-Mutantenwürmern bei, aber die Kombination von Arzneimitteln einschließlich dieses Arzneimittels (RIF + PSORA und RIF + PSORA + ALLAN) hatte einen neutralen Effekt auf die Langlebigkeit von Nematoden (Schema 3c und zusätzliches Schema 8).

In Zukunft haben wir die Wirksamkeit aller synergistischen Kombinationen von Arzneimitteln und Arzneimittelsubstanzen getestet, aus denen sie auf daf-7-Mutanten bestanden. In keinem Fall wurde ein synergistischer Effekt festgestellt. Wir kamen zu dem Schluss, dass die Arzneimittelsynergie auf den daf-7-Signalweg zurückzuführen ist, obwohl unter diesen Bedingungen einzelne Arzneimittel aus der Kombination hinsichtlich der Erhöhung der Lebenserwartung wirksam sind (Schema 3d, zusätzliches Schema 8).

Drug Synergy, MUFA und Life Span

Wie bereits in Studien berichtet, treten metabolische Umlagerungen in langlebigen mutierten Nematodenlinien im Alter von 1 und daf-2 auf, was zu einer erhöhten Produktion und Akkumulation von Fett führt. Darüber hinaus reguliert der TGFβ / daf-7-Weg den Metabolismus von Triacylglycerin (TAG) und es ist bekannt, dass mutierte daf-7-Nematoden mehr Fett speichern. Diese Informationen und die Daten unserer Arbeit führten uns zu der Untersuchung, ob durch Synergismus gekennzeichnete Wirkstoffkombinationen das Lipidprofil von Nematoden mit einem TGFβ-blockierten Signalweg beeinflussen (Hilfstabelle s3).

Im Anfangsstadium führten wir eine Transkriptomanalyse unserer Ergebnisse durch, um Signalwege zu finden, die die Lipidzusammensetzung verändern, und fanden heraus, dass Kombinationen von Arzneimitteln mit synergistischem Effekt den Spiegel des SREBP-1c: sbp-1-Homologen in C. elegans erhöhen. Es dient als Haupttranskriptionsfaktor, der die Gene steuert, die für die Synthese verschiedener Lipide und Desaturaseenzyme verantwortlich sind. Letztere sind an der Bildung einfach ungesättigter Fettsäuren (MUFA) beteiligt (Schema 4c, f). Anschließend führten wir eine massenspektrometrische Lipidomanalyse durch, um Änderungen des Lipidprofils nach Exposition gegenüber Arzneimitteln festzustellen. Bei Nematoden nahmen nach Verwendung synergistischer Wirkstoffkombinationen die TAG-Reserven, das Verhältnis von MUFA: PUFA (einfach ungesättigte Fettsäuren zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren) und die Menge von 16: 1 und 19 signifikant zu:1 einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFAs) (Schema 4f).

Als Ergebnis wurde eine Abnahme des Doppelbindungsindex (DBI) (der den Grad der Ungesättigtheit der Fettsäuren zeigt) und des Lipidperoxidationsindex (PI) beobachtet (Schema 4i). Ein niedriger PI zeigt an, dass Lipide weniger Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffen enthalten, wodurch die Fähigkeit der Lipide zur Peroxidation verringert wird. Nach den Ergebnissen verschiedener Autoren war eine Abnahme der Peroxidationsfähigkeit mit einer Erhöhung der Lebenserwartung verbunden, möglicherweise weil Lipide im Körper weniger anfällig für Oxidation waren.

Es wird angenommen, dass durch Unterdrückung des Peroxidationsprozesses die Beständigkeit gegen oxidativen Stress verbessert wird. In unserer Arbeit nahm diese Resistenz bei Würmern nach Anwendung synergistischer Wirkstoffkombinationen tatsächlich zu (Schema 5e, f). Darüber hinaus stellten wir einen Anstieg des allgemeinen Sphingomyelinspiegels bei Nematoden fest (Schema 4h). Wissenschaftler haben gezeigt, dass dieser Indikator die Lebensdauer von Würmern durch eine erhöhte Autophagie verlängert.


Abb.5

Die Unterdrückung des Energiestoffwechsels und die Blockierung der Arbeit der Membrankette des Elektronentransports (ETC) kann die Lebensdauer von C. elegans verlängern. Diese Tatsache erklärt die Ergebnisse unserer Studie nicht, da Nematoden keine merkliche Abnahme der Grundstoffwechselrate feststellen konnten (Schema 5i). Die wissenschaftliche Literatur beschreibt, dass die Langlebigkeit am häufigsten von Faktoren wie einer Verlangsamung des Wachstums und der Entwicklung sowie einer Abnahme der Fruchtbarkeit begleitet wurde. Wir fanden nicht heraus, dass sich bei Würmern, denen unterschiedliche synergistische Wirkstoffkombinationen verabreicht wurden, die Dauer des Erwachsenenlebens und die allgemeine Fruchtbarkeit signifikant änderten. Obwohl nach Zugabe dieser Kombinationen ein leichter Anstieg der Fortpflanzungsdauer bei Nematoden festgestellt wurde (Schema 5a-c, zusätzliches Schema 9a).

In der nächsten Phase haben wir Folgendes ermittelt: Anpassungsindikatoren, Toleranzniveau für Stresssituationen und Lebensfähigkeit von Nematoden. Wir bewerteten die Geschwindigkeit der spontanen Bewegung, die Beständigkeit gegen Hitzeschock und die Beständigkeit gegen oxidativen Stress und berechneten auch die Lebensfähigkeit der Würmer auf der Skala der spontanen Mobilität, berechnet nach der Methode von Herdon (Herndon). In der Kontrollgruppe betrug die aktive Lebensdauer ungefähr 50% der gesamten Lebensdauer der Nematoden. Ein ähnlicher Indikator bei Würmern, die mit RIF + PSORA + ALLAN- oder RAP + RIF + ALLAN-Präparaten behandelt wurden, erreichte 57% bzw. 63% ihrer verlängerten Lebensdauer (Schema 5d, zusätzliche Daten 9c). Somit nahmen sowohl die absolute Lebensdauer als auch die relative Dauer der aktiven Aktivität von Nematoden signifikant zu.

Wir beobachteten, dass mehr als die Hälfte der Individuen beim Tod des letzten Wurms in der Kontrollgruppe in der anderen Kontrollgruppe ein optimales Maß an vitaler Aktivität aufwies (Schema 5d, zusätzliche Daten 9c). Eine Analyse der spontanen Bewegungen zeigte, dass in der Versuchsgruppe unabhängig vom Alter der Würmer ihre Mobilität nach Einwirkung von Wirkstoffkombinationen wie RIF + PSORA + ALLAN oder RAP + RIF + ALLAN deutlich höher war als die der Nematoden in der Kontrollgruppe. In der Tat unterschied sich die spontane Mobilität alter Personen (18 Lebenstage), bei denen Medikamente angewendet wurden, nicht von der motorischen Aktivität junger Würmer (7 Lebenstage) in der Kontrollgruppe (Schema 5g). Darüber hinaus erhöhte die medikamentöse Therapie von Würmern ihre Beständigkeit gegen Hitze und oxidativen Stress (toxikologische Analyse, Schema 5e, f, zusätzliches Schema 9b).Unsere Beobachtungen zeigen, dass Nematoden nach der Wirkung synergistischer Wirkstoffkombinationen die Dauer des aktiven Lebens verlängerten, die Resistenz gegen Stressfaktoren und sogar die Mobilität von Individuen erhöhten, während kompensatorische Veränderungen in ihrer physiologischen Entwicklung fehlten oder minimal waren.

Angesichts dieser Ergebnisse bezweifeln wir, dass der Anstieg der Lebenserwartung auf eine Verlangsamung der biologischen Alterungsrate zurückzuführen ist. Die Alterungsrate kann als Indikator für die Zeit ausgedrückt werden, in der sich die Mortalität von Personen verdoppelt (MRDT oder die Zeit, in der sich die Intensität der Mortalität verdoppelt). Unter Verwendung der Survcurv-Analyseplattform haben wir diesen Parameter in Modellorganismen nach Anwendung synergistischer Wirkstoffkombinationen bestimmt. Mit der kombinierten Wirkung von RIF + PSORA + ALLAN-Präparaten war der Nematoden-MRDT-Spiegel signifikant höher als der gleiche Indikator in der Kontrollgruppe (MRDT = 3,7 bzw. 3 Tage, P <0,0001).

Die Mortalitätsrate junger Würmer (IMR) in der Versuchsgruppe war ebenfalls signifikant niedriger (IMR der Kontrollgruppe = 2,7e-3, IMR unter der Wirkung von RIF + PSORA + ALLAN = 8,5e-4, RAP + RIF + ALLAN = 9,3e-4, P. <0,001). Wir kamen zu dem Schluss, dass durch den Einsatz synergistischer Wirkstoffkombinationen der Alterungsprozess von Nematoden verlangsamt und die Resistenz gegen verschiedene negative Faktoren bei jungen Menschen zunahm, was letztendlich zu einer Verlängerung ihres Lebens führte.

Erhaltung der Wirkung von Arzneimittelsynergismus bei Drosophila-Fliegen

Eines der Hauptprobleme bei der Erforschung des Alterungsprozesses ist die Frage, ob das erzielte Ergebnis der Verlängerung des Lebens von einer Art auf eine andere übertragen werden kann. Aus diesem Grund haben wir in Experimenten mit Drosophila melanogaster untersucht, ob die Wirkung von Arzneimittelsynergien, die die Lebensdauer von C. elegans verlängern, erhalten bleibt. Zuvor haben Wissenschaftler in Studien gezeigt, dass RAP die Lebensdauer von Fruchtfliegen verlängert, während MET nicht wirksam ist. Wir haben die Wirkung einzelner Zubereitungen und ihrer Kombinationen auf die Lebensdauer männlicher Fruchtfliegen konsequent untersucht. Zu Beginn haben wir gezeigt, dass die Arzneimittel RAP und ALLAN die durchschnittliche Lebensdauer von Fruchtfliegen verlängern, während RIF und PSORA nur die maximale Lebenserwartung von Organismen erhöhen (Schema 6, Tabelle s2).

Ein synergistischer Effekt, der die Lebensdauer der Fliegen verlängert, wurde in Wirkstoffkombinationen auf Basis der RAP-Verbindung festgestellt: RAP + RIF und RAP + RIF + ALLAN (Schema 6a). Bei Verwendung von Kombinationen von PSORA-haltigen Arzneimitteln: RIF + PSORA und RIF + PSORA + ALLAN konnten wir keine Verlängerung der durchschnittlichen Lebensdauer der Fliegen feststellen (Schema 6b). Im Vergleich zu den Ergebnissen der Wirkung einzelner Arzneimittel führte die Kombination von RIF + PSORA-Arzneimitteln jedoch zu einem synergistischen Effekt, der die maximale Lebensdauer von Organismen verlängert (Schema 6c). Da die Fruchtfliege Drosophila melanogaster den Effekt der Arzneimittelsynergie beibehält, glauben wir, dass die Ergebnisse unserer Arbeit die Existenz eines evolutionär konservativen Mechanismus bestätigen, der die Funktion dieses synergistischen Effekts bestimmt.


Abb.6

Die Diskussion

In dieser Arbeit konnten wir mehrere Wirkstoffkombinationen mit synergistischer Wirkung finden. Sie beeinflussten selektiv bestimmte Signalwege, die mit Alterung und Langlebigkeit verbunden sind. Außerdem könnten sich Signalwege gegenseitig schneiden. Obwohl solche Arzneimittelkombinationen nur im Erwachsenenalter angewendet wurden, wurde die aktive Lebensdauer von C.elegans verdoppelt. Das Ausmaß der Wirkung von Arzneimittelinterventionen war vergleichbar mit der Wirkung nach klassischen Mutationen, die das Altern verlangsamen. Soweit wir wissen, ist diese Studie hinsichtlich Anzahl und Umfang der Arzneimittelinterventionen bei erwachsenen Tieren die größte geworden.

Bei Verwendung synergistischer Arzneimittelkombinationen, die die Lebensdauer von Würmern verlängern, konnten keine gleichzeitigen negativen Kompensationsstörungen oder Störungen in der Entwicklung des Tieres festgestellt werden. Ähnliche Störungen wurden bei Organismen mit Mutationen in Genen beobachtet, die mit dem Altern verbunden sind. Der festgestellte positive Arzneimitteleffekt war auch nicht auf eine Abnahme der Arbeit der Membrankette des Elektronentransports (ETC) oder eine Hemmung des Metabolismus bei Würmern zurückzuführen. Die Bewertung dieser Indikatoren erfolgte anhand des Sauerstoffverbrauchs.

In der Tat übertrafen Tiere, die Arzneimittelkombinationen von Arzneimitteln erhielten, die Kontrollgruppe der Organismen hinsichtlich der motorischen Aktivität. Körperliche Form und Aktivität waren bei älteren Personen in der Versuchsgruppe und bei jüngeren in der Kontrollgruppe gleich (Schema 5g). Die Mortalitätsanalyse zeigte, dass der synergistische Effekt von Wirkstoffkombinationen die biologische Alterungsrate um etwa 20% verlangsamt (zusätzliches Schema 10). Um die positive Wirkung des Arzneimittelsynergismus und seinen evolutionären Konservatismus zu testen, führten wir mehrere Experimente an der Fruchtfliege von Drosophila melanogaster durch. Zwei der vier Wirkstoffkombinationen bestätigten die Sicherheit eines synergistischen Effekts.

Evolutionär sind Nematoden Säugetieren näher als Fliegen. Daher sind solche konservativen Mechanismen und Signalwege bei Fruchtfliegen und Nematoden uralt. Wahrscheinlich bestand anfangs der Mechanismus der synergistischen Wirkung bei dem Vorfahren, der diesen drei Tierklassen gemeinsam ist.

Um den Wirkungsmechanismus der Arzneimittelsynergie zu untersuchen, der das Leben von Würmern verlängert, führten wir mehrere Epistaseexperimente (Epistase-Unterdrückung der Wirkung eines allelischen Genpaares durch das nicht-allelische Paargenom) und eine Transkriptomanalyse durch. Als Ergebnis konnten wir feststellen, dass die Signalwege daf-2 / daf-16 (IGF / FOXO) und TGF (daf-7) eine wichtige Rolle für die Funktion des synergistischen Effekts spielen (Schema 4j). Die Beziehung zwischen diesen beiden Pfaden wurde auch in anderen Studien bestätigt. Ihre Autoren berichten, dass daf-7 die Lebensdauer von Tieren über den Insulinsignalweg regulierte und der neurale TGF-Weg mit der Nährstoffaufnahme und der Langlebigkeit verbunden war. Darüber hinaus kontrollierte daf-7 den Metabolismus von C. elegans und den Fettspeicherungsprozess. Die Mutationen, die das Leben von C. elegans verlängerten, wirkten sich auf den Lipidstoffwechsel von Würmern aus, indem sie die Menge an einfach ungesättigten Lipiden erhöhten und die Menge an mehrfach ungesättigten Lipiden verringerten.

Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen unserer Studie überein. Die Arzneimittelsynergie erhöhte den Spiegel des Haupttranskriptionsfaktors sbp-1, der den Lipidstoffwechsel und die Synthese einfach ungesättigter Lipide beeinflusst (Schema 4c, f, zusätzliches Schema 5). Die Massenspektralanalyse des Nematodenlipidoms, bei dem verschiedene Wirkstoffkombinationen mit synergistischer Wirkung verwendet wurden, ergab Veränderungen des Fettstoffwechsels: Aktivierung des sbp-1-Faktors, Akkumulation von Triacylglycerin und Erhöhung des Verhältnisses von einfach und mehrfach ungesättigten Lipiden in Richtung einer Zunahme der ersteren (einschließlich in zwei Klassen von Lipiden - Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin). Schließlich wird in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben, dass das Vorherrschen von einfach ungesättigten Lipiden gegenüber mehrfach ungesättigten Lipiden im Lipidprofil der Erythrozytenmembranen von Kindern zu finden ist, deren Eltern 90 oder mehr Jahre überlebten.

Wissenschaftler auf der ganzen Welt haben großes Interesse an der potenziellen Fähigkeit von MET und möglicherweise der RAP-Verbindung, die Entwicklung altersbedingter Störungen zu verlangsamen und menschliche Krankheiten zu verhindern. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit für dieses Problem möchten wir Experimente erwähnen, bei denen die Wirksamkeit der Kombination von MET- und RAP-Präparaten bei C. elegans und Mäusen schwach war. Solche Ergebnisse haben viele Wissenschaftler enttäuscht.

In unserer Arbeit haben wir gezeigt, dass die Lebenserwartung durch einen Komplex von Signalwegen und interagierenden Genen und biochemischen Molekülen bestimmt wird. Der gleichzeitige Einfluss bestimmter Signalwege auf mehrere Ziele kann zu einem spürbaren positiven Effekt und manchmal zu einem unvorhersehbaren Ergebnis führen. In dieser Studie verwendeten wir basierend auf dem Prinzip der Evidenz Medikamente, die auf wichtige Signalwege wirken.

Plötzlich entdeckten wir einen synergistischen Effekt, der universeller und evolutionär konservativer Natur war. Die Ergebnisse unserer Arbeit bestätigen die Gültigkeit des Einsatzes von Arzneimitteln, die die Aktivität vieler konservativer Signalwege gleichzeitig verlangsamen, um die Geschwindigkeit des biologischen Alterns zu verlangsamen. Wenn es Wissenschaftlern gelingt, dieses Prinzip des Handelns auf die Menschen zu übertragen, wird dies die Wirksamkeit der medizinischen Versorgung und das wirtschaftliche Wohlergehen der Gesellschaft erheblich steigern.

Übersetzung: Tatyana Gneteeva.