John Lewis auf der Undoing Aging Conference 2018

Oisin Biotechnologies ist eines von vielen Unternehmen, die in unserer Gemeinschaft von Unterstützern und Forschern im Zusammenhang mit der Methuselah Foundation und der SENS Research Foundation aufgetreten sind.

Vertreter von Oisin arbeiten an einer Plattform, die Zellen basierend auf der Expression spezifischer Proteine ​​durch diese Zellen selektiv zerstören kann. Ihre anfänglichen Ziele sind alternde Zellen und Krebszellen. Erstens werden sie die Krebstherapie in klinische Studien einbeziehen, da erfolgreiche Krebstherapien einfacher zu regulieren sind als viele andere Therapien.

Auf diese Weise können sie die Technologie wiederverwenden und sich auf nachfolgende Versuche mit der senolytischen Therapie vorbereiten, mit der viele seneszierende Zellen aus verschiedenen Geweben entfernt werden können. Auf der von der SENS Research Foundation und der Forever Healthy Foundation Anfang 2018 organisierten Undoing Ageing- Konferenz spricht John Lewis, CSO von Oisin Biotechnologies, über ihre Technologie und neue Ergebnisse.

Leistung

Guten Abend allerseits! Es ist sehr schön, an diesem Treffen teilzunehmen. Ich danke Aubrey de Gray und Michael Greve von Herzen für die Einladung. Ich hätte mir keine bessere Sequenz wünschen können, da der Vorredner großartige Arbeit geleistet hat, um die Gründe herauszustellen, warum seneszierende Zellen wichtig sind und warum sie ein solches Problem darstellen. Ich bin ein akademischer Onkologe und ein Anfänger auf dem Gebiet des Alterns, obwohl ich viel Erfahrung im Abtöten von Zellen habe, und ich möchte jetzt darüber sprechen: Wie Oisin Biotechnologies eine sehr selektive Therapie zur Zerstörung von alternden Zellen und Krebs entwickelt.

Ich werde nicht viel darüber reden, was senenszierende Zellen sind oder was sie tun. In wenigen Worten, dies sind Zellen, die im Körper als Reaktion auf äußere Belastungen - oxidativen Stress , genotoxischen Stress - entstehen und hauptsächlich die Entstehung von Krebs hemmen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Zellen, wenn sie altern, auch Signale senden, die sich im Körper ausbreiten . Ich wiederhole, dass wir keine universellen Marker für seneszierende Zellen haben. Es gibt gemeinsame Merkmale, die wir für ihre Erkennung verwenden können.

Zum Beispiel die Anreicherung von aktiven Enzymen in Lysosomen . Wir können aktive β-Galactosidase färben . Tatsächlich handelt es sich jedoch um eine sehr heterogene Population, die auf unterschiedliche Weise entsteht. Ich möchte nicht auf die Zusammenhänge eingehen, sondern nur betonen, dass der Beginn der Vollendung des Zellzyklus von mehreren Faktoren abhängt: p16 , p21 , p53 . Wir haben darüber nachgedacht und gefragt: Welche gemeinsamen Wege könnten wir beschreiten, um eine gezielte Therapie zu entwickeln, die diese Zellen beseitigt? Ich muss nicht wiederholen, dass seneszierende Zellen zwar am Alterungsprozess beteiligt sind, es aber auch sehr spezifische Krankheiten gibt, die Symptome des Alterns sind und die klinisch mit denselben Techniken behandelt werden können.

Es war ein wichtiger Punkt im letzten Gespräch, dass p16 möglicherweise nicht die ganze Geschichte ist. Aber Sie müssen sich die Daten ansehen, die in den letzten Jahren untersucht wurden - und das hat mich wirklich überzeugt -, dass natürlich alle seneszenten Zellen p16 nicht exprimieren, aber im Mausmodell ist es sehr klar, dass, wenn Sie es so entwerfen, dass Wenn Sie selektiv alle p16 exprimierenden Zellen zerstören, erhalten Sie phänomenale Veränderungen des Phänotyps. Für mich war es sehr beeindruckend.

Zum Beispiel die Arbeit von John van Deyrsen , bei der es genetisch veränderte Mäuse gab, die ein Selbstmordgen exprimierten , das vom p16- Promotor gesteuert wurde, unter Verwendung des sogenannten INK-ATTAC- Caspase-9-Systems , das es ihnen ermöglicht, einen Dimerisator zu verwenden , der die Apoptose in Zellen aktiviert, die p16 exprimieren. Und diese Mäuse zeigten phänomenale Veränderungen in ihrem Phänotyp. Deutliche Verbesserung der Gesundheit, 25% höhere durchschnittliche Lebenserwartung, 50% weniger Krebs sowie funktionelle Veränderungen: Verminderung der Kataraktbildung , Verminderung der Schwäche und Verminderung des Haarausfalls.

Ich werde als Einführung in meinen Vortrag einige Daten zeigen, die kürzlich veröffentlicht wurden. Sie ließen mich denken, dass es sich als Therapie lohnen würde - dies ist die Arbeit von Peter de Keyser , die im letzten Jahr veröffentlicht wurde und p53- und FOXO4- Mechanismen verwendet. Er konnte ein beschleunigtes Alterungsmodell anwenden, bei dem Mäuse, die Haare verlieren, schwach werden, und zeigte, dass das Entfernen von alternden Zellen, nachdem diese Veränderungen bereits stattgefunden hatten, diese verändern kann. Dies hat für mich wirklich bestätigt, dass die Zerstörung von alternden Zellen der richtige Entwicklungsweg ist.

Daher ist dies das Fundament der Oisin-Technologie. Als Ingenieurgruppe dachten wir schon während der Entwicklung der Therapie, die wir zur Behandlung einer bestimmten Krankheit verwenden können, über das Altern im Allgemeinen nach und wie dies in Zukunft angewendet werden kann, nachdem wir die Wirksamkeit klinisch überprüft haben. Aus diesem Grund wollten wir eine ähnliche Strategie verfolgen und dabei moderne Tiermodelle verwenden, die in unserer Zeit entwickelt wurden. Wir wollten etwas entwickeln, das ein geringes Toxizitätsprofil aufweist, das gut verträglich ist und das sich zyklisch wiederholen lässt. Etwas, das nicht immunogen ist und keine Nebenwirkungen hat. Offensichtlich sind viele Alterungsphänotypen gewebespezifisch, und die Möglichkeit, verschiedene Gewebe gezielt zu therapieren, wäre von Vorteil.

Was ich Ihnen heute sagen werde, ist die von uns entwickelte Oisin-Technologie. Es wird die SENSOlytic- Plattform genannt. Dies ist eine Lipid-Nanopartikel- Plattform (LNP), die ein nicht integrierbares DNA-Plasmid enthält . Es wurde entwickelt, um durch ein chemisches Dimerisiermittel aktiviert zu werden , das eine sehr schnelle und irreversible apoptotische Reaktion auslöst. Der vielleicht wichtigste Teil davon ist das Arzneimittelabgabesystem - die Fähigkeit, Plasmid-DNA ohne signifikante Toxizität systemisch an verschiedene Gewebe abzugeben. Oisin hat eine Mehrzweck-Plasmid-basierte Technologie entwickelt, und im Gegensatz zu Interferenz-RNA oder Messenger-RNA können Plasmide elegant so gestaltet werden, dass sie nur dann aktiviert werden, wenn ein bestimmter Signalweg wie p16, p21 oder p53 aktiviert wird. Sie können aber auch mit Enhancern oder Repressoren entwickelt werden und auf bestimmte Gewebe oder Krankheiten abzielen. Wir haben ein System und eine Bibliothek von Designs erstellt, die unter verschiedenen Bedingungen aktiv sind. Zwei davon, die ich Ihnen heute zeigen werde, sind Versionen des p16- und p53-Promotors, einschließlich der Suizidgene.

Wir haben eine Bibliothek von Plasmiden erstellt, die im Grunde genommen ein spezifischer selektiver Promotor sind, der mit dem iCas9-induzierten Suizid-Gen assoziiert ist und der dann unter Verwendung eines chemischen Dimerisators inkorporiert oder dimerisiert wird. Viele von Ihnen haben dies vielleicht schon einmal gesehen, aber iCas9 ist eine modifizierte Caspase. Sie ist also verkürzt, die Einschlussdomäne wurde entfernt und durch die FKBP- Dimerisierungsdomäne ersetzt. Diese Bereiche interagieren sehr stark mit dem chemischen Dimerisiermittel AP20187 oder seinem klinischen Analogon AP1903, das sicher ist, wie in klinischen Studien der Phase II gezeigt wurde. Was in diesem System wirklich gut ist, ist, dass Sie die Gene Ihres Plasmids in unserem Fall nur vorübergehend in Zellen mit aktiver Expression von p16 oder p53 exprimieren. Und nichts passiert, bis Sie einen Dimerizer hinzufügen. Der niedermolekulare Dimerisator ist sehr gut verträglich, sättigt alle Gewebe innerhalb weniger Minuten und verursacht eine irreversible apoptotische Reaktion. iCas9 dimerisiert unter diesen Bedingungen, spaltet sich selbst, aktiviert die Apoptosomenbildung und verursacht innerhalb von 2 bis 3 Stunden einen sehr schnellen Zelltod. Zellen können dem nicht widerstehen. Sie können sich nicht entwickeln oder auf andere Weise widerstehen.

Einige unserer In-vitro-Studien verwendeten die Plazenta- Myofibroblasten- Zelllinie IMR-90. In diesem Fall induzierten wir die Seneszenz unter Verwendung von 10 Grad Bestrahlung und transfizierten Zellen unter Verwendung von iCas9. iCas9 ist etwas weniger als Caspase-9 und kann mit Antikörpern gegen Caspase-9 nachgewiesen werden. In nicht bestrahlten Zellen wurde iCas9 nicht exprimiert. In Fällen, in denen Zellen durch Expression von p16 altern, beginnt die iCas9-Induktion, und wenn wir diesen Zellen ein wenig Dimerisiermittel hinzufügen, verschwindet sie. Die Kultur wird sehr schnell von diesen Zellen befreit. Wenn wir uns dann die Fähigkeit ansehen, diese Zellen abzutöten, sehen wir in Lebensfähigkeitstests, dass jede Zelle, die erfolgreich mit einem Plasmid transfiziert wurde, stirbt. Wir haben andere Experimente durchgeführt. Ich zeige nur ein Beispiel, in dem wir Durchflusszytometrie verwenden , und wir bestätigen, dass wir in diesen Zellen Apoptose verursachen.

Somit haben wir ein Plasmid, das für p16-exprimierende Zellen sehr selektiv ist. Wir können sie sehr schnell töten, indem wir ein Dimerisiermittel hinzufügen. Die Frage ist, wie wir daraus eine Therapie machen, die beim Menschen wirkt. Brauchen Sie einen Lieferungsmechanismus, sehr effizient und sicher. Wir haben uns für die Verwendung von Lipidnanopartikeln entschieden. Lipidnanopartikel werden seit vielen Jahren verwendet, und ich würde sagen, dass es viele Versprechungen und Investitionen und sehr wenige Erfolge gegeben hat. Alnylam Pharmaceuticals in Boston führte kürzlich eine erfolgreiche Phase-III-Studie mit einem mRNA-Präparat durch. Das Problem besteht darin, dass sich Lipidnanopartikel normalerweise in der Leber ansammeln und ihr Mechanismus zur Abgabe von Nukleinsäuren an Zellen eine positive Ladung verwendet. Dies ist eine sehr einfache Technologie. Sie erzeugten Lipide mit einer positiven Ladung. Wenn Sie eine positive Ladung verwenden, können sie sehr leicht Löcher in die Membranen stechen, und Sie können effizient Material in Zellen ablagern, außer dass sie sehr giftig sind. Somit haben sie eine sehr niedrige sichere Dosis.

In Reaktion darauf haben mehrere Unternehmen das sogenannte bedingt kationische Lipid entwickelt . Dieses Lipid , das normalerweise im Blutkreislauf neutral ist, gelangt in die Endosomen und wird in einer sauren Umgebung kationisch . Sie sind Gegenstand laufender Programme, die klinische Studien mit Lipidnanopartikeln durchlaufen. Sie wirken, sind aber immer noch sehr giftig. Ein ideales Abgabesystem ist eines, das neutrale Lipide mit einem alternativen Mechanismus für die Zellabgabe von Nukleinsäuren verwenden kann. Ich werde Ihnen ein wenig darüber erzählen, wie wir zu ihm gekommen sind. Wenn Sie ein Lipid-Nanopartikel haben und es in die Zelle gelangen muss, muss es die Plasmamembran mit all seinem Schutz passieren. Viren haben sich über Millionen von Jahren entwickelt, um dieses Problem zu lösen, und viele fusogene Proteine ​​entwickelt . Diese Proteine ​​sind wunderschön, gigantisch und elegant, und die Art und Weise, wie sie die Membranen miteinander verbinden, Poren bilden und Lipide mischen, ist wirklich fantastisch. Sie können jedoch nicht an Lipidnanopartikel gebunden werden, da es sich um große Proteine ​​mit riesigen aktiven Zentren und hoher Immunogenität handelt.

Glücklicherweise gibt es einen kanadischen Wissenschaftler, der diese fusogenen Orthoreviren sein ganzes Leben lang untersucht hat und herausgefunden hat, dass sie das fusogene Protein nicht verwenden, um in die Zellen einzudringen, sondern alle Zellen um sie herum schnell miteinander verschmelzen. Er verbrachte seine Karriere damit, diese Klasse von Transmembranproteinen zu charakterisieren, die um zwei Größenordnungen kleiner sind als das kleinste fusogene Protein, das von anderen Viren exprimiert wird, aber ausreichen, um die Fusion von Zellen und vor allem Lipidnanopartikeln und -zellen zu initiieren.

Wenn Sie diese Proteine ​​in eine Plattform einbauen, die auf neutralen Lipidnanopartikeln basiert, werden Sie feststellen, dass neutrale Lipide allein die Ladung nur sehr schlecht abgeben können. In unserem Beispiel verwenden wir das mCherry- Plasmid gegen Krebszellen, und daher gibt es ohne fusogene Proteine ​​überhaupt keine Lieferung, und mit ihnen erhalten wir eine fantastische Lieferung. Somit erhöhen sie die Abgabe eines neutralen Lipidteilchens um das 80-350-fache und werden in vivo gut vertragen. In einem Experiment mit Luciferase injizieren wir mRNA, die Luciferase exprimiert, in die Schwanzvene. Wir bekommen Luziferase-Expression im ganzen Körper. Wir bemerken eine Anreicherung in der Lunge und in der Leber, aber wir bekommen eine gute Expression in vielen Geweben, einschließlich Haut und Weichteilen im ganzen Körper.

Wir nutzen unsere Plattform, um Nutzlast gegen seneszierende Zellen zu liefern. Die Plattform heißt Fusogenix . Es wird ein neutrales Lipid-Nanopartikel verwendet, das ungiftig und gut verträglich ist. Und sie nutzt diese fusogenen Proteine, um in die Zelle zu gelangen. Ich möchte nicht auf all die kleinen Dinge eingehen. Wir haben drei Jahre gebraucht, um Antikörper gegen diese Proteine ​​herzustellen, sie sind wirklich nicht immunogen. Der Grund dafür ist, dass die meisten von ihnen Transmembrandomänen sind. Sie sind lipophil , daher packen sie Lipide um sich und sind nicht immunogen. Wir haben viel Zeit damit verbracht, diese fusogenen Proteine ​​zu verbessern, um sie besser zu machen. Ich werde mich nicht mit all den kleinen Dingen befassen, aber jetzt haben wir eine Plattform für ihre industrielle Produktion in großen Mengen und Lyophilisierung , und wir können sie auf Anfrage zur Verwendung senden.

Lassen Sie mich Ihnen die in einem Experiment erhaltenen Daten zeigen - in dem sie aktivierte p16-Caspase-9 nahmen und in Mäuse einführten. In diesem Fall führten wir ein Experiment mit 16 Mäusen durch, einer älteren Mausgruppe von 80 Wochen. Wir haben sie in drei Gruppen eingeteilt und ihnen das Kontroll-LNP ohne Dimerisator oder zwei Dosen, 5 und 10 mg / kg - und 10 mg / kg - eingeführt. Dies ist eine große Dosis. Wir haben diese Tiere einmal durch Injektion in die Schwanzvene behandelt. Wir warteten 96 Stunden und führten dann einen Dimerisator ein, ebenfalls intravenös. Dann warteten wir noch zwei Tage, sammelten Gewebe und Blut, führten eine empfindliche RT-PCR durch und kontrollierten sie mit mehreren Genen. Wir erhielten eine überzeugende dosisabhängige Abnahme der p16-Expression in verschiedenen Geweben.

Ich werde Ihnen ein paar Bilder zeigen, in denen wir viel Zeit damit verbringen, die β-Gal-Färbung in Mäusen zu optimieren. Dies sind die besten Bilder, die wir haben, aber in einigen Geweben haben wir eine dosisabhängige Abnahme der β-Galactosidase-Expression erhalten. Sehr ermutigende Informationen. Natürlich ist die Arbeit im Labor gut, aber wenn wir sie in Menschen übersetzen wollen, müssen viele Dinge geklärt werden. Die Toxikologie ist äußerst wichtig. Dies ist wichtig für ein Medikament, das Sie im Begriff sind, zyklisch durchzuführen, um sicherzustellen, dass Ihr Körper keine neutralisierenden Antikörper bildet. Daher haben wir viele Studien zur wiederholten Verabreichung durchgeführt und keine Antikörper aufgezeichnet, sodass wir sie in wiederholten Dosen verabreichen können, ohne die Wirksamkeit zu beeinträchtigen. CARPA ist das, worüber ich kürzlich erfahren habe, eine komplementär aktivierte Pseudoallergie , eine Immunantwort, die viele Patienten, die eine Nanopartikel-Therapie wie Doxil erhalten, haben können . Wir haben alle Analysen durchgeführt und sie haben ein geringeres Profil als Doxil, daher sind sie sehr gut verträglich.

Ich bin erfreut zu sagen, dass wir mehrere Pilotstudien mit Primaten durchgeführt haben, denen eine zehnfache maximale menschliche Dosis verabreicht wurde und die sehr gut vertragen wurde. Diese Affen erhielten tatsächlich eine Behandlung, sowohl p53 als auch p16, getrennt und in Kombination, und einen Dimerisator, sodass wir auf gute Daten zählen. Jetzt arbeiten wir daran.

Die Verträglichkeit dieser Partikel ist sehr wichtig. Ich zeige diese Folie, weil sie alle Anstrengungen zeigt, die in den klinischen Studien mit Lipidnanopartikeln unternommen wurden, und warum sie fehlgeschlagen sind. Wenn Sie sich die ersten drei Programme ansehen, waren sie vor zehn Jahren mit kationischen Liposomen und Lipidnanopartikeln vielversprechend. Sie können sehen, dass ihre maximal tolerierte Dosis weniger als 1 mg / kg beträgt und alle diese Programme aufgrund von Lebertoxizität fehlgeschlagen sind. Bei der zweiten Generation, bedingt kationische Lipide, wurden sie mehr oder weniger stark übertragen, und einige dieser Programme waren erfolgreich und werden zur Zulassung von Arzneimitteln führen, aber alle Ziele sind die Leber. Da sich Lipidnanopartikel in der Leber ansammeln, werden Sie eine dosislimitierende Toxizität feststellen, wenn Sie keine neutrale Lipidzusammensetzung verwenden. Dann können Sie die Arbeit sehen, die eine neutrale Lipidzusammensetzung wie unsere verwendet, und sie konnten nicht die maximal tolerierte Dosis in einer Studie finden. Aufgrund unserer Untersuchungen an nichtmenschlichen Primaten erwarten wir, dass unsere Partikel gleich gut verträglich sind.

Wir evaluieren derzeit verschiedene Konstrukte, um herauszufinden, welches am besten für den Menschen geeignet ist, und wir haben auf dieser Konferenz offensichtlich darüber gesprochen - die Schaffung von Biomarkern, die gute Indikatoren für klinische Studien sind, sowie in Tiermodellen zur Evaluierung der Wirksamkeit. Wir möchten wirklich mit Wissenschaftlern sprechen, die einen guten Biomarker haben. Wir haben Gruppen von Mäusen, in denen wir die Lebensdauer und Gesundheit dieser Mäuse untersuchen. Wir denken darüber nach, in die klinische Phase überzugehen, wenn wir die GMP- und GLP-Toxizitätsanalyse erhalten .

Deshalb werde ich auf Krebs umsteigen, weil dies unser Hauptweg zur Klinik ist. Mein Hauptberuf ist das Studium von Prostatakrebs . Eine Sache, die mich wirklich fasziniert hat, ist die Aktivierung des p53-Signalwegs. Das p53-Gen ist das am stärksten mutierte Gen bei Krebs und es gibt viele Krebsarten, die eine hohe Mutationslast in p53 aufweisen. Ich nehme die Prostata, weil sie niedrige Raten aufweist, im Durchschnitt machen sie 10% aus, und die meisten Prostatakrebsarten sind wenig beweglich.Sobald Sie eine metastatische Erkrankung bekommen , liegt diese Mutationsrate bei über 50%. Daher ist es ein gutes Ziel bei der Behandlung von Krebs. Obwohl p53-Protein selbst noch nicht in Krebstherapien eingesetzt wurde, halte ich sie für sehr vielversprechend. In p53 können Sie zwei Arten von Mutationen erhalten. Während der Zellreplikation oder der Mutation aktivieren sie p53, um den Schaden zu reparieren oder Apoptose zu erleiden. Daher mutieren die Zellen entweder oder werden p53 los, um es zu umgehen. Infolgedessen sind die tatsächlichen Aktivierungspfade sehr reguliert. Kann diese Aktivierung also verwendet werden, um Krebszellen abzutöten?

in vitro , , in vivo , . , . p53, iCas9, . . NOD/SCID . 500 ³ . , , . , 90-95% 48 – , , , , .

, . . , 500 ³ . LNP , . , : 50-98% . . 70% .

, : . , , . , . , , LNP , . .

. , Oisin , . , , , , . , I / IIb , GLP, . 2019 . . : , . I , , , , . , , II.