CRISPR-resistente Viren bauen Schutzräume, um das Genom vor DNA-durchdringenden Enzymen zu schützen

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Die Bakterien und Viren, die sie infizieren, nehmen an ihrem eigenen Wettrüsten teil: so alt wie das Leben. Die Evolution hat Bakterien ein ganzes Arsenal an Immunenzymen gegeben, einschließlich CRISPR-Cas-Systemen, die virale DNA zerstören können. Viren, die Bakterien (Phagen) abtöten, haben jedoch eigene Tools entwickelt, mit denen Sie selbst die größten bakteriellen Abwehrkräfte überwinden können.

Wissenschaftler der University of California haben eine wunderbare neue Strategie entdeckt, mit der einige Phagen vor Enzymen schützen, die in ihre DNA eindringen. Nach der Infektion der Bakterien schaffen diese Phagen einen undurchdringlichen Schutz, eine Art "Sicherheitsraum" im Körper, der die verwundbare Phagen-DNA vor antiviralen Enzymen schützt. Dieses dem Zellkern sehr ähnliche Kompartiment kann als das effektivste CRISPR-Schutzschild bezeichnet werden, das jemals in Viren gefunden wurde.

In Experimenten, die im Labor der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Universität von Kalifornien in San Francisco (UCSF) durchgeführt wurden, ergaben diese Phagen kein CRISPR-System. "Es war das erste Mal, dass jemand Phagen entdeckte, die diese Resistenz gegen CRISPR aufweisen", sagte Joseph Bondi-Denomi, Associate Professor von UCSF. Er beschrieb seine Entdeckung in einem Artikel, der am 9. Dezember 2019 in der Zeitschrift Nature veröffentlicht wurde .

Eine DNA-Jagd, die CRISPR nicht durchdringen kann

Joseph Bondi-Denomi leitete das Forscherteam, das den "Schutz" der Phagen eröffnete

Um CRISPR-resistente Phagen zu finden, wählten die Forscher Viren aus fünf verschiedenen Familien von Phagen aus und infizierten damit gängige Bakterien, die gentechnisch so verändert wurden, dass vier verschiedene Cas-Enzyme, die DNA-durchdringende Komponente von CRISPR-Systemen, eingesetzt werden.


Das HsdR-Restriktionsenzym (rot), ein Protein, das normalerweise Phagen-DNA schneidet (blau), kann DNA nicht durchdringen. Die vom Phagen zusammengesetzte kernhaltige Hülle umgibt die Phagen-DNA und bildet eine Barriere, die das Phagengenom für HsdR und andere Enzyme, die in die DNA eindringen, unzugänglich macht.

Diese mit CRISPR angereicherten Bakterien traten gegen die meisten der angetroffenen Phagen als Sieger an. Es stellte sich jedoch heraus, dass zwei Riesenphagen (die ihren Namen erhielten, weil ihr Genom 5-10-mal größer war als das der am besten untersuchten Phagen) für alle vier CRISPR-Systeme undurchdringlich waren.

Die Wissenschaftler beschlossen, zusätzliche Tests dieser riesigen Phagen durchzuführen, um die Grenzen ihrer Resistenz gegen CRISPR zu untersuchen. Sie setzten sie Bakterien aus, die mit einem völlig anderen CRISPR-Typ ausgestattet waren, sowie Bakterien, die mit Restriktionsmodifikationssystemen ausgestattet waren. Das heißt, ein DNA-spaltendes Enzym ist häufiger als CRISPR (Restriktionssysteme sind in etwa 90% der Bakterienarten zu finden, während CRISPR nur in etwa 40% vorhanden ist), kann jedoch nur auf eine begrenzte Anzahl von DNA-Sequenzen abzielen.

Die Ergebnisse waren die gleichen wie zuvor: Petrischalen waren mit zerstörten Überresten von mit Phagen infizierten Bakterien übersät. Diese Phagen waren gegen alle sechs getesteten bakteriellen Immunsysteme resistent. Kein anderer Phage war dazu in der Lage.

Die riesigen Phagen schienen fast unzerstörbar. In-vitro-Experimente zeigten jedoch, dass die DNA der Riesenphagen genauso anfällig für CRISPR- und Restriktionsenzyme ist wie jede andere DNA. Eine Resistenz gegen CRISPR, die in mit Phagen infizierten Zellen beobachtet wurde, sollte das Ergebnis von etwas sein, das Viren hervorbrachte, die CRISPR störten. Aber woran könnte es liegen?


Modell einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa mit dem Phagen φKZ. Illustration: Mendoza et al., 2019.

Der Anti-CRISPR schien schuld zu sein. Diese Proteine, die Bondi-Denomi erstmals 2013 entdeckte, waren potente CRISPR-Inaktivatoren, die in einigen Phagengenomen kodiert sind. Bei der Analyse der Genomsequenzen des Riesenphagen stellten die Forscher jedoch keine Spur von Anti-CRISPR fest. Darüber hinaus kann jedes bekannte Anti-CRISPR nur bestimmte CRISPR-Systeme deaktivieren, während Riesenphagen gegen alle in ihnen sezernierten antiviralen Enzyme resistent waren. Alles, was die DNA des Riesenphagen schützte, sollte auf einem anderen Mechanismus beruhen.

Undurchlässiger Schild von CRISPR

Wissenschaftler waren ratlos und bauten Modelle. Jemand in der Wolke , einige auf Papier. Nach einer großen Anzahl von Experimenten konnte ich verstehen, was passierte. Wenn Riesenphagen Bakterien infizieren, bilden sie in der Mitte der Wirtszelle ein kugelförmiges Kompartiment, das die antiviralen Enzyme hemmt und ein "Refugium" für die Replikation des Virusgenoms darstellt.

Eine ähnliche Entdeckung machten 2017 zwei weitere Wissenschaftler, Joe Polyano und David Agard. Diese Forscher haben gezeigt, dass sich das Phagengenom in der kernartigen Membran repliziert. Aber bisher wusste niemand, dass die Hülle auch als undurchdringlicher Schutzschild gegen CRISPR dient.

Interessanterweise ist eine Kompartimentierung bei Bakterien äußerst selten. Bei Viren wird es grundsätzlich nicht angenommen. Und noch mehr, dass das Kompartiment dem eukaryotischen Kern so ähnlich war. Aber du gehst - das ist es, der Pseudokern!


Das mit dem Phagen 201φ2-1 infizierte Bakterium Pseudomonas chlororaphis: Foto (a) und Rekonstruktion (b). Der Pseudokern ist blau, das gesammelte Kapsid der Viruspartikel ist grün, die Ribosomen sind gelb.

Viele Fragen zum Umschlag und den Viren, die ihn verursachen, bleiben jedoch unbeantwortet, einschließlich grundlegender Informationen über das Protein, aus dem der Umschlag des "Sicherheitsraums" hergestellt wird. Laut Joseph Bondi-Denomi gelang es seinem Team bei der Sequenzierung dieser Phagen, eines der hypothetischen Proteine ​​zu finden. In einigen nahe verwandten Phagen konnte ein solches Protein jedoch nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus ist noch nicht klar, wie die Struktur des Proteins auf atomarer Ebene aussieht.

Das Protein der Gebäudehülle ist jedoch nicht das einzige Rätsel, das Bondi-Denomi und seine Kollegen lösen müssen. Während sie die mit dem Phagen infizierten Bakterien beobachteten, bemerkten sie etwas anderes Interessantes: Während der Konstruktion des „Schutzes“ für den Phagen (dies dauert ungefähr 30 Minuten) verbleibt sein Genom an der Stelle, an der es in die Wirtszelle eingeführt wurde. Während dieser Zeit scheint das Phagengenom gegenüber jeglichen antiviralen Enzymen, die in der Wirtszelle schweben, anfällig zu sein. Aber auf die eine oder andere Weise bleibt das Genom unverändert, während sein „Raum“ gebaut wird.

Vielleicht schützt eine Art temporäre Membran die eingeführte DNA des Virus in einem frühen Stadium. Wie eine Schutzhülle, die zurückgesetzt wird, wenn die Waffe kampfbereit ist. Das ist nur, dass die Wissenschaftler noch nicht verstanden haben, welche Art von Schutz.



Den Wissenschaftlern gelang es jedoch herauszufinden, dass die Hülle nicht so undurchdringlich ist, wie die ersten Experimente zeigten. Der Hauptautor der Studie, Senen Mendoza, ein Doktorand am Bondi-Denomi-Labor, fand mit kniffliger Entwicklung einen Weg, um einen kernhaltigen Schild zu umgehen, indem er ein Restriktionsenzym an eines der viralen Hüllproteine ​​anbrachte. Diese Strategie des trojanischen Pferdes ermöglichte es dem Enzym, während des Zusammenbaus in das Tierheim zu gelangen und das Phagengenom innerhalb der immunitätsfreien Zone zu zerstören, dank derer die Bakterien überleben konnten.

Dieses Experiment ist besonders für Forscher interessant, da es zeigt, dass es tatsächlich Möglichkeiten gibt, in den „undurchlässigen“ Kokon zum Schutz des Virusgenoms einzudringen. Und angesichts der Tatsache, dass Bakterien und Phagen immer wieder neue Wege finden, um die Abwehrkräfte des anderen aufzubrechen, werden die Wissenschaftler nach Ansicht von Bondi-Denomi sehr bald feststellen, dass die Bakterien bereits mit den notwendigen Werkzeugen ausgerüstet sind, um diese Schutzmethode zu durchbrechen oder zu umgehen. Der Krieg wird weitergehen.

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