Ingeniería genética de bacterias: cómo obtener la proteína que necesitamos de las bacterias

Entonces, en dos artículos anteriores sobre la ingeniería genética de las bacterias ( una y dos veces ) descubrimos cómo recolectar los genes que necesitamos, en qué forma pueden introducirse en la bacteria y cómo exactamente pueden introducirse allí. Supongamos que hicimos todas estas manipulaciones para hacer una biofábrica para la producción de proteínas. Entonces ahora es la pequeña empresa: obtener nuestra proteína de la bacteria en su forma más pura.
Existen muchos métodos para resolver este problema; la mayoría de ellos se relacionan con la cromatografía. Lea cómo funcionan estos métodos debajo del gato.

La fase estacionaria "atrapa" las moléculas que pasan por sus grupos (-OH).

Entonces, obtuvimos la cepa que necesitábamos y aumentamos la biomasa. Ahora necesitamos eliminar de alguna manera nuestra proteína.

En primer lugar, tomamos nuestra cultura y la vertimos en botellas de centrífuga. Las bacterias son objetos bastante grandes y pesados, por lo tanto, para precipitarlas, no se necesitan valores de sobrecarga monstruosos durante la centrifugación: 10000 g serán más que suficientes durante 20 minutos. Como resultado, obtenemos un sedimento en el fondo de las botellas y un líquido (se llama sobrenadante). Derramamos el líquido, ya que nuestra proteína está en las bacterias que están en el sedimento. Puede continuar más según las circunstancias: trabaje inmediatamente con el precipitado obtenido o congele y almacene hasta que sea necesario. Se puede almacenar durante mucho tiempo. El procedimiento adicional para trabajar con lodos no depende de si lo almacenamos en el congelador o no.

Digamos que es hora de trabajar con sedimentos. Que sigue

En primer lugar, necesitamos destruir las células para que la proteína pueda salir. Para hacer esto, use los siguientes métodos:

• Secuencial congelación-descongelación. No es la herramienta más efectiva para la destrucción de la membrana celular, pero es segura para las proteínas, por lo que a menudo comienza con varios de esos ciclos y luego pasa a métodos más efectivos;
  
• Tratamiento de ultrasonido (sonicación). El método es ampliamente utilizado, es simple y efectivo. El ultrasonido generalmente se administra directamente al volumen de agua utilizando un "altavoz" alargado que se inserta en el líquido con las células de modo que el extremo del "altavoz" casi llegue al fondo. Este es un método bastante difícil. También hay una alternativa más suave: la ecografía se introduce en el baño de agua en el que flotan los tubos.
  
  
  
  
  Un graduado de MIT advierte: observe a sus sonadores cuidadosamente.
  
  Al llevar a cabo la destrucción ultrasónica de las células, es importante controlar la temperatura: el agua se calienta rápidamente bajo la influencia del ultrasonido, y no necesitamos desnaturalizar nuestra proteína en absoluto, y no nos gustaría hervirla. Por lo tanto, en el primer caso (con una "columna alargada"), el tubo de ensayo con células se inserta en una taza con hielo y agua, y debe haber mucho hielo. El agua en este caso actúa como una interfaz térmica entre el hielo y el tubo de ensayo enfriado por él. En el caso de la "alternativa suave", se agrega hielo directamente al baño de agua.
  
  
  Demostración de procesamiento ultrasónico "duro". Preste atención al terrible ruido que se encuentra cerca de la instalación, se escucha especialmente bien a las 2:06 de este video. Alguien se salva lo mejor que puede: alguien intenta salir de la habitación durante la duración de la sonicación, alguien usa auriculares especiales que absorben el ruido.
  
  
  Demostración de tratamiento ultrasónico "suave".
  
• Agregar agentes de lisis al medio. Estos son principalmente detergentes, es decir, "jabón" (en general, la palabra "detergente" en inglés significa "detergente"). Los detergentes están esencialmente relacionados con los lípidos en las membranas celulares. Una vez en el ambiente con las células, los detergentes comienzan a integrarse en las membranas, lo que conduce a su destrucción. Y solo necesitamos esto. A veces también se agrega lisozima, una enzima que destruye la pared celular bacteriana.
  
• Prensa francesa. La suspensión de la celda es succionada a través de la válvula de entrada hacia el cilindro de trabajo, desde donde es exprimida por una prensa a través de una ranura estrecha. Las fuerzas transversales que surgen de una caída de presión a la presión atmosférica cuando las células pasan a través del espacio conducen a la destrucción de la pared celular y la membrana.

Desde mi propia experiencia, puedo decir que la sonicación en combinación con detergentes suele ser más que suficiente.

Entonces, obtuvimos un lisado celular: “sopa”, que consiste en la proteína que necesitamos y una gran cantidad de “basura” (ADN cromosómico y plasmídico, fragmentos de la pared celular, varias proteínas, etc.). ¿Cómo deshacerse de todo esto?

La primera pregunta que debe responderse es: "¿De qué forma existía nuestra proteína en la célula?" Hay dos opciones principales:

• La proteína era soluble antes de la lisis y, con una probabilidad muy alta, permaneció así después de ella, lo que significa que no podemos sedimentarla por centrifugación. Pero podemos precipitar la gran "basura" que queda después de la lisis: de esta manera eliminaremos los pedazos de la pared celular, el ADN cromosómico y otros fragmentos grandes. El precipitado se descarta y el sobrenadante se envía para cromatografía;
  
• La proteína en las condiciones del citoplasma bacteriano era insoluble y formó el llamado "Cuerpos de inclusión" conservados después de la lisis. Los cuerpos de inclusión son perlas de proteínas que se forman si la proteína durante la síntesis no tiene tiempo de plegarse (es decir, tomar su forma soluble normal) antes de colisionar con otra proteína no plegada similar. Las proteínas desplegadas casi siempre tienen parches hidrófobos que sobresalen, con la ayuda de los cuales se adhieren entre sí. Después de que las dos ardillas "se unieron" ya no tienen suficientes grados de libertad para completar su plegamiento. Luego un tercero, cuarto, quinto nadar hacia ellos ... Como resultado, se forma un gránulo de proteína. Por lo general, esto sucede cuando sintetizamos proteínas eucariotas en bacterias (como escribí antes, la bacteria no puede plegarlas). Como resultado, tenemos una masa de proteína con una estructura espacial "pobre". Pero cada nube tiene un revestimiento plateado, porque al final se forman gránulos, ¡que consisten casi por completo en la proteína que necesitamos!
  
  Como en este caso nuestra proteína es insoluble, cuando se centrifuga, junto con la "basura", se encuentra en el sedimento. Desechamos el sobrenadante, y luego los cuerpos en el sedimento se lavan de todo lo innecesario de la siguiente manera:
  
  1. Se vertió el tampón de lavado No. 1, en el que se disolvió el "componente de basura del sedimento No. 1";
  2. Revuelva el precipitado hasta que esté suave y colóquelo en un agitador (un dispositivo que sacude);
  3. El sobrenadante se centrifugó y se vertió. Como resultado, lo que se disolvió en el tampón de lavado No. 1 se separó del precipitado;
  4. Se vertió el tampón de lavado No. 2, en el que se disolvió el "componente de basura del sedimento No. 2";
  5. Bueno y así sucesivamente. Por lo general, se necesitan un total de aproximadamente 5 lavados.
  
  Permítame recordarle una vez más que si estamos tratando con cuerpos de inclusión, entonces estamos tratando con una proteína desplegada , lo que significa que no puede cumplir con las funciones establecidas en ella. Por lo tanto, antes de la limpieza posterior, se está replegando, es decir, se lleva a una forma activa. El método de replegamiento más común consiste en los siguientes pasos:
  
  1. Disuelva los cuerpos en condiciones "no fisiológicas". Típicamente, los cuerpos se disuelven bien a pH alto (aproximadamente 12) en presencia de urea bipolar. La idea de este método es que a un pH alto en el medio hay muy pocos protones y todos los que puedan deshacerse de ellos lo hacen fácilmente. El protón está cargado positivamente, lo que significa que todos los donantes de protones reciben una carga negativa, y luego la ley de Coulomb hace todo: las proteínas que tienen una gran carga negativa comienzan a repelerse entre sí;
     
  2. Gota a gota, agregue todo el volumen de la "solución de proteína" del primer párrafo a un volumen mucho más activo de la mezcla amortiguadora con condiciones que sean cómodas para la proteína. La idea de esta etapa es que, a una baja concentración de proteínas, es mucho más probable que se doble antes de encontrarse con su contraparte desplegada. Típicamente, la transferencia de gotas de una solución de proteína se lleva a cabo en volúmenes de tampón que exceden el volumen de la solución en sí mismo al menos 10 veces.

Por lo tanto, estamos listos para algunos volúmenes de soluciones de proteínas en un estado plegado. El procedimiento adicional es el mismo para cualquier "condición inicial": filtramos nuestras soluciones a través de filtros con un tamaño de poro de 100-450 nm (para no obstruir las columnas cromatográficas y el propio cromatógrafo), y luego realizamos la cromatografía.

Tipos de cromatografía

El principio de cualquier cromatografía es que los diversos componentes de la solución se mueven a través de la columna a diferentes velocidades, como resultado, los componentes que fueron "a la entrada de la columna" salen en diferentes momentos.

Pero primero, recordemos otro método: la electroforesis de proteínas en un gel.

Este método permite la separación de proteínas según sus masas. Para hacer esto, se agrega un tampón que contiene SDS y un tinte (generalmente azul de bromofenol) a la muestra. Al mismo tiempo, la densidad del tampón es mayor que la densidad del agua, esto se hace para que la mezcla de muestra y tampón sea más fácil de agregar a los pocillos en el gel. El tinte se agrega para controlar el procedimiento para introducir la muestra en el pozo, y también sirve como un indicador de que es hora de terminar la foresis: la pintura se mueve más rápido que la proteína, por lo que cuando llega al final del gel, se detiene la foresis. Esto es muy conveniente, ya que no vemos el movimiento de la proteína a lo largo del gel.


SDS-PAGE electroforesis. Es mejor leer y ver una vez que leer cien veces. Se aplica un marcador de peso molecular al primer pozo en silvicultura en el video, y las muestras estudiadas se aplican a los pozos restantes.

El SDS es un componente clave: este detergente con carga negativa (surfactante) desnaturaliza las proteínas, después de lo cual las "rodea", y resulta que el número de moléculas de SDS adheridas a la proteína es directamente proporcional a su masa. Luego se desprende de la ley de Coulomb que, en ausencia de cualquier resistencia al movimiento, todas las proteínas rodeadas por moléculas SDS tendrían la misma aceleración en el campo eléctrico (la fuerza crece linealmente con una carga creciente, pero la masa también crece linealmente con la carga).


Esquema de acción del detergente con carga negativa SDS sobre proteína. Primero, lo denuncia y luego lo "envuelve". Como resultado, la proteína consiste en una cubierta cargada negativamente que consiste en SDS, cuya carga es directamente proporcional a la masa de la proteína.

Y aquí PAAG (PAAG - gel de poliacrilamida) viene en nuestra ayuda. Durante la polimerización, forma una red de canales de aproximadamente el mismo diámetro, a través del cual, ceteris paribus, los objetos pequeños se mueven más rápido que los grandes. Obviamente, la proteína pesada es más grande que la ligera, por lo que las proteínas ligeras se mueven más rápido.

Después de completar el procedimiento de electroforesis, el gel se tiñe. Más precisamente, aquellos lugares en los que la proteína se encuentra en el gel están manchados: se obtienen rayas azules (o negras, dependiendo de qué pintar). Para comprender a qué masa corresponde una u otra banda, debe compararla con algo, por lo que el llamado gel se aplica a cada gel. El "marcador de peso molecular" es una mezcla de componentes con masas conocidas.


Un ejemplo de tiras marcadoras de peso molecular. Este marcador también es conveniente porque sus dos rayas están pintadas en un color individual: rojo (70 kilodaltons) y verde (10 kilodaltons). Esto ayuda al experimentador a navegar en el marcador en sí. 1 dalton, es una unidad atómica de masa, se define como 1⁄12 de la masa de un átomo de carbono en reposo libre-12, que se encuentra en el estado fundamental.

Parece un milagro, no un método: las tiras no se superponen, lo que significa que las proteínas están perfectamente divididas. Pero, de hecho, los científicos no han aprendido cómo realizar la electroforesis de proteínas a escala industrial y, por lo tanto, todavía utilizamos la cromatografía en columna.


Un esquema aproximado de cualquier cromatografía. La columna es un cilindro lleno de algo. Este "algo" se llama la "fase estacionaria", y la "fase móvil" es la solución cuyos componentes necesitamos separar. Los componentes se mueven a diferentes velocidades y, por lo tanto, salen de la columna por separado.

La mayoría de las técnicas cromatográficas se basan en el hecho de que las ardillas que se aferran a un relleno de columna estacionario "con diferente entusiasmo": los que se "aferran" a menudo y se mueven mucho más lentamente que todos, y los que no se "aferran" a nada abandonan la columna rápidamente. Como resultado, una parte sustancial de la mezcla a menudo sale de la columna sin "engancharse" en ella: salen juntas al comienzo de la cromatografía (esta fracción se llama "deslizamiento", ya que se deslizaron a través de la columna sin "engancharse"). ¿Pero qué hacer con los que están "enganchados"?

Primero, descubramos qué sucede en la columna con aquellos que se "aferran". El "gancho" en sí ocurre porque hay algo en la superficie de la fase estacionaria que es capaz de "capturar" una proteína que pasa (por un momento) sobre cómo sucede esto. Es decir, la proteína "aferrada" pasa algún tiempo en el estado asociado con la fase sólida, luego se separa de ella (debido a su propio movimiento térmico, colisiones, etc.), flota, se une nuevamente a la fase sólida, se separa nuevamente, etc. hasta que salga de la columna. Está claro que cuanto más a menudo y más fuerte se une a la fase estacionaria, más lento se mueve a lo largo de la columna.


El principio de la cromatografía. Lo que no se une a la columna (deslizamiento) se mueve con la velocidad de la fase móvil (ajustada por el tamaño). Los componentes de unión tienen diferentes velocidades, lo que conduce a su separación en la salida.

En términos generales, solo en el caso de mucha mala suerte en la mezcla habrá diferentes componentes que se mueven a la misma velocidad, por lo que podemos esperar hasta que salgan de la columna. Pero a menudo es "solo esperar" durante mucho tiempo, ya que los componentes se mueven lentamente. En este caso, deben "personalizarse" y la forma en que se "personalizan" depende del tipo de columna.

Finalmente, examinemos los métodos cromatográficos en sí, que son adecuados para la producción industrial de blancos.

1. Cromatografía de intercambio iónico. La idea del método es que la fase estacionaria tiene una carga bajo las condiciones de cromatografía. Si la carga es positiva, entonces hablan de "cromatografía de intercambio aniónico", si es negativa, entonces de "intercambio catiónico".
   
   La lógica del nombre es simple, consideremos usar un intercambiador de aniones como ejemplo: los componentes con carga negativa de la mezcla se "adhieren" a la fase sólida con carga positiva de la columna. Además, si seguimos algún grupo específico con carga positiva en la superficie de la fase sólida, entonces uno u otro componente con carga negativa se "adherirá" a él y saldrá. Por lo tanto, se produce un tipo de intercambio aniónico entre las fases estacionaria y móvil, de ahí el nombre: "cromatografía de intercambio aniónico".
   
   Obviamente, si queremos utilizar la cromatografía de intercambio aniónico, debemos llevar a cabo la separación de la mezcla en las condiciones en que la fase sólida se carga positivamente. Además, tenemos una opción de dos opciones para el desarrollo posterior de eventos, dependiendo de la carga que tenga la proteína en estas condiciones: si "-", entonces "se sentará" en la columna, y si "+", estará en resbalón.
   
   ¿Cómo acelerar la salida de componentes relacionados, es decir, cómo llevar a cabo la "elución"? Puedes actuar de dos maneras:
   
   • Puede cambiar la carga de la fase estacionaria y los componentes unidos cambiando el pH de la fase móvil. Es importante llevar a cabo el proceso de cambiar gradualmente el pH, luego los componentes acelerarán su movimiento, pero no se "caerán" al mismo tiempo de una vez;
     
   • Agregue otros aniones a la columna. De hecho, la columna tiene un número finito de lugares para los que los aniones pueden aferrarse y si ocupamos todos estos lugares con algo, entonces los componentes de la mezcla se moverán más rápido. Para la cromatografía de intercambio aniónico, la adición de aniones de cloro es típica. La introducción de aniones competidores también debe llevarse a cabo gradualmente.
   
   El procedimiento para la cromatografía de intercambio catiónico es generalmente el mismo, solo lo opuesto.
   
   
   
   
   Cromatografía de intercambio catiónico con elución debido a un cambio en el pH de la fase móvil.
   1 - a pH = 2 hay muchos protones en la fase móvil, por lo tanto, todos los componentes de la mezcla fueron recogidos del líquido, mientras recibían una carga positiva;
   2 - a pH = 5, el número de protones en la fase móvil disminuyó y el componente "púrpura" ya no actúa como un receptor, sino como un donante de protones; por lo tanto, a este valor de pH, la carga es negativa y sale de la columna. El componente "verde" todavía actúa como un aceptor de protones y retiene una carga positiva a un valor de pH dado, lo que significa que todavía se mantiene en la columna;
   3 - a pH = 9 hay muy pocos protones en la fase móvil, el componente "verde" también se convierte en un donante de protones, adquiere una carga negativa y deja la columna al final.
   
   En general, la elección del tipo de intercambiador iónico y las condiciones para la separación dependen de lo que queramos aislar y de lo que hay en nuestra mezcla.
   
2. Otro método de separación se basa en la hidrofobicidad (~ no polaridad) y la hidrofilia (~ polaridad) de ciertas sustancias. La idea aquí es exactamente la misma que en el caso del intercambiador de iones: de acuerdo con sus propiedades físicas, los componentes se “apresuran” entre los medios hidrofóbicos e hidrofílicos, algunos persisten más, otros menos.
   
   Antes que nada, les recuerdo que no polar se disuelve en no polar y polar en polar. A menudo, "hidrofóbico" y "no polar" son lo mismo que "hidrofílico" y "polar", aunque en el caso general esto no es así. El etanol es un ejemplo de un solvente no polar, y el agua es un ejemplo de un polar.
   
   
   
   
   , , . «» .
   
   . , (). (). «» , «». , . «» . , . .
   
3. (His-tag). , ( — 20 ) . , , , .
   
   
   
   
   .
   
   , , . 6 , . , , , : .
   
   
   
   
   . , -« » His- . -« » .
   
   «» . , — His- ( , ). , .
   
   
   
   
   .
   1 — «» ; 2 — ; 3 4 — ; — ; 5-10 — . . , , «». . .
   
   , . , , . : , ( 75 100 , ), . , .
   
   His- - . , ( « < 1»), , . .
   
4. -. , : , - , , .
   
   « » , . - : , , . , - - , ( , ), . : - 1-2% . , , , 10 400 : , . - .
   
   
   
   
   -: , .
   
   - ? , , . , , , . - , .
   
   
   
   
   -. . , . — . .
   
   -, . , , , . - — , .

Pues bien. Así que aislamos nuestra proteína y ahora puede usarse para estudios estructurales o funcionales, como reactivo en un laboratorio científico o para análisis ambientales, con fines médicos o en la industria.