Más recientemente, en 2016, el liderazgo indiscutible en el mercado de secuenciación genómica pertenecía a los Estados Unidos. Más precisamente, la compañía estadounidense Illumina , que desarrolló una gama de secuenciadores fluorescentes.
Fig. 1. Secuenciadores fluorescentes Illumina
( Presentación de inversores de Illumina, 18 de agosto de 2017 )
La mejora de estos dispositivos y la tecnología fluorescente utilizada por ellos permitió a mediados de 2016 reducir el costo de secuenciar el genoma humano a $ 1000.
El segundo lugar en 2016 fue ocupado por la empresa estadounidense Thermo Fisher Scientific , que desarrolla tecnología de secuenciación de ADN de semiconductores. A pesar de su rendimiento relativamente modesto (hasta 12 Gb), su secuenciador Ion S5 compitió bastante bien con los secuenciadores de escritorio de Illumina en el nicho de la secuenciación (clínica) dirigida.
Fig. 2. Secuenciador de semiconductores Ion S5
En septiembre de 2017, BGI anunció el inicio de la aceptación de solicitudes para la secuenciación del genoma por $ 600, lo que inmediatamente llevó a China a los líderes de las carreras genómicas. Este avance fue posible gracias a la creación de CNGB (China National GeneBank), un importante centro con 150 secuenciadores chinos fluorescentes BGISEQ-500.
Fig. 3. En la sala de informática CNGB
http://www.presstv.com/Detail/2016/09/22/485893/China-national-gene-bank
Es cierto que el rendimiento de un NovaSeq 6000 estadounidense es igual al rendimiento de 50 ... 60 BGISEQ-500 chino. Por lo tanto, el centro de secuenciación más grande hasta la fecha puede considerarse la compañía china Novogene , que a principios de este año adquirió 25 NovaSeq 6000 a la vez. Su productividad total es de aproximadamente un cuarto de millón de genomas por año. La cifra es impresionante, pero si se secuencian 0.3 millones de genomas anualmente (~ 0.05 millones en CNGB más ~ 0.25 millones en Novogen ), entonces se secuenciarán 100 millones de genomas como parte del programa de Medicina de Precisión de China lanzado el año pasado Iniciativa ”(2016 ... 2030, $ 9,2 mil millones) llevará más de 300 años. Y para cumplir con los plazos (hasta finales de 2030), los chinos deberán construir y equipar varias docenas de centros con secuenciadores.
A principios de 2017, los secuenciadores de poros miniION nanion MinION aparecieron a la venta y, en mayo, GridION X5, desarrollado por Oxford Nanopore Technologies (ONT, Reino Unido). El modelo más productivo (PrometION) se está sometiendo a pruebas beta en varios centros genómicos y debería estar disponible en los próximos meses.
Fig. 4. ONT Nanopore Sequencers
La precisión relativamente baja de la secuenciación de nanoporos (~ 90% para una sola lectura) no permite que estos dispositivos compitan con secuenciadores fluorescentes (precisión ~ 99.9% para una sola lectura) en la determinación de mutaciones puntuales (polimorfismos de un solo nucleótido, SNP), pero la longitud de lectura larga (> 10.000 pb) los hace indispensables para mapear polimorfismos como las variaciones de número de copia (CNV). Además, los secuenciadores de nanoporos hacen un buen trabajo identificando virus y bacterias, evaluando su resistencia a los medicamentos, análisis de transcriptomas, tipificación de HLA, estableciendo la paternidad y muchas otras tareas de secuenciación dirigidas, lo que les permite competir con éxito por estos nichos de mercado NGS (secuenciación de próxima generación) .
La intervención en la carrera genómica de China y el Reino Unido ha intensificado la competencia. Esto aún no ha afectado los precios de la secuenciación dirigida, pero el costo de secuenciar el genoma humano durante el año pasado ha disminuido en un 40% (de $ 1000 a $ 600).
¿Debería Rusia participar en las carreras genómicas, o es más fácil esperar a que aparezcan secuenciadores chinos, ingleses o estadounidenses baratos? Pero tal expectativa puede ser arrastrada. Y es una pena para el estado. Esto determina la relevancia de considerar la posibilidad de desarrollar un secuenciador doméstico y su provisión de consumibles y reactivos.
El objetivo principal de tal desarrollo es "alcanzar y superar a América" (así como a China, Gran Bretaña, Corea del Sur, Australia, Arabia Saudita, etc.). O al menos simplemente ponerse al día. O ni siquiera te pongas al día, solo intenta hacer que la secuencia en Rusia sea más accesible. En primer lugar, lograr la sustitución de importaciones de al menos parte de consumibles y reactivos. Será más difícil copiar secuenciadores. Pero no solo puede copiar desarrollos extranjeros, sino tratar de mejorarlos. Y si no mejora, al menos reduzca el costo. La tarea no es demasiado ambiciosa, pero factible.
Uno de los proyectos de este tipo fue desarrollado por cuatro institutos de la Rama Siberiana de la Academia de Ciencias de Rusia (2012 ... 2014), que intentaron sin éxito dominar la tecnología de secuenciación SMRT ( Pacific Bioscience , EE. UU.). También podemos mencionar dos intentos de desarrollar una tecnología de secuenciación monomolecular basada en la espectroscopía Raman: en Chernogolovka ( InSpektr LLC , 2010 ... 2012) y Zelenograd ( Nano Vizhin LLC , 2013 ... 2014). - Y sobre el proyecto de ZeSenograd RuSeq, dirigido a mejorar la tecnología tSMS ( Helicos , EE. UU.).
Está claro que al elegir las tecnologías NGS para dominar (copiar / mejorar / "triturar"), se deben tener en cuenta las perspectivas de su desarrollo. Y, dadas las posibilidades extremadamente limitadas, evaluar estas perspectivas solo para las tres tecnologías más avanzadas: fluorescentes, semiconductores y nanoporos.
Tecnología fluorescente
En este caso, los secuenciadores son microscopios de epifluorescencia de escaneo de precisión equipados con un sistema de suministro de reactivo para células de flujo. Un rasgo característico de los últimos modelos es la disposición ordenada de grupos de ADN submicrométricos ( Illumina , NovaSeq 6000) o nanobolas de ADN ( BGI , BGISEQ-500) en celdas de flujo desechables.
Tales microscopios en Rusia deberán ensamblarse principalmente a partir de componentes importados, por lo que no costarán más barato que sus contrapartes chinas. Es cierto que estos análogos aún no se venden, pero en 2 ... 3 años, lo más probable es que estén disponibles con nosotros. Por lo tanto, es mejor centrarse no en el desarrollo de secuenciadores fluorescentes, sino en el desarrollo de la producción de sus componentes y reactivos consumibles: células de flujo y nucleótidos marcados. A menos, por supuesto, que las tecnologías fluorescentes sean reemplazadas en varios años por otras luminiscentes. Además, dicho reemplazo puede comenzar en 2018.
La luminiscencia ya se ha utilizado en NGS, una tecnología de pirosecuenciación que permitió a 454 Life Sciences leer el primer genoma humano individual (Proyecto Jim, 2005 ... 2007). Esta tecnología, basada en el registro bioluminiscente (luciferasa) de la formación de pirofosfato, ahora está desactualizada. Pero la luminiscencia es más fácil de determinar que la fluorescencia. Por lo tanto, Illumina lleva mucho tiempo desarrollando tecnología de secuenciación luminiscente (el proyecto "Firefly").
Un secuenciador luminiscente puede no ser peor, pero mucho más barato que los secuenciadores de escritorio fluorescentes MiniSeq y MiSeq, por lo que su desarrollo progresa muy lentamente. Sin embargo, recientemente en la exposición ASHG 2017 (17 ... 21.10.2017), se demostró el secuenciador Firefly terminado, así como las celdas de flujo (chips) y los cartuchos de reactivos necesarios para su funcionamiento.
Fig. 5. Illumina Firefly Fluorescent Sequencer
https://twitter.com/illumina
El principal problema en el caso de la orientación a la tecnología luminiscente no será tanto el desarrollo del dispositivo como el dominio de la síntesis de los reactivos prescindibles necesarios para su funcionamiento: trifosfatos desoxinucleósidos (dNTP) con etiquetas capaces de generar fotones. Además, estos marcadores deberían estar conectados a nucleósidos con enlazadores fácilmente escindibles que contienen grupos azidometilo.
Una característica importante de los derivados de azidometilo de DNTF, cuya síntesis fue desarrollada por científicos rusos (IBCh RAS) a principios de los años 90 del siglo pasado, es su estabilidad relativamente alta, combinada con la simplicidad y la velocidad de liberación al procesar grupos de ADN (o nanobolas de ADN) con una solución Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). Fue la complejidad de la síntesis de tales reactivos lo que hasta hace poco protegió a Illumina de los competidores, y el desarrollo de su producción permitió a China alcanzar y superar a Estados Unidos.
¿Son los químicos rusos capaces de dominar la síntesis de tales reactivos? A juzgar por los enlaces en las patentes de Illumina, esto no estaba en duda en los años 90 del siglo pasado. Y ahora en Rusia hay 3 ... 4 grupos de químicos capaces de hacer frente a tal tarea (IHBFM SB RAS, Synthol LLC, IBCh RAS, IMB RAS).
Tecnología de semiconductores
Thermo Fisher Scientific ha invertido miles de millones de dólares en la adquisición de tecnología de secuenciación de semiconductores. Ahora, la intensificación de la competencia requiere una fuerte disminución de los precios, y es poco probable que pueda devolver los miles de millones gastados, especialmente con ganancias. Los desarrolladores de terceros no se preocupan por tales problemas, por lo que para ellos, la tecnología de semiconductores sigue siendo atractiva. Especialmente si puede usar chips de sensor de pH ya preparados, cuyo desarrollo se ha gastado millones de dólares.
Fig. 6. S5 Semiconductor Sequencer Chips de sensor de pH
El costo de estos chips está exagerado, al menos en un orden de magnitud. Y puede usarlos (según los desarrolladores) solo una vez. Sin embargo, algunos artesanos lograron usarlos más de diez veces, y este claramente no es el límite. Por lo tanto, la tarea principal para mejorar (reducir el costo) de la tecnología de secuenciación de semiconductores es dominar la regeneración de los chips de sensor de pH utilizados.
El prototipo del dispositivo necesario para tal regeneración ya se ha desarrollado. Más precisamente, se ha desarrollado un sistema electrónico que lee la información de los chips del sensor de pH y permite controlar su calidad.
Fig. 7. Secuenciador de semiconductores casero
https://www.youtube.com/watch?v=eojg02AUAxw
Si aumenta la velocidad y la resolución del ADC, dicho lector puede utilizarse como un subsistema electrónico del secuenciador de semiconductores doméstico. Es cierto que todavía tendrá que estar equipado con un sistema de suministro de reactivos. Y domine la producción de estos mismos reactivos. Con un fuerte deseo (y buena financiación), no se esperan problemas especiales con esto.
El problema es que todos estos desarrollos y sus modificaciones tomarán 2 ... 3 años, y durante este tiempo, muchas cosas pueden cambiar. Por ejemplo, se puede mejorar la precisión y la productividad de la secuenciación de nanoporos. Como resultado, todos los esfuerzos de los competidores "semiconductores" serán en vano.
Tecnología Nanopore
El primer secuenciador de nanoporos MinION es similar al primer panqueque: ya es "comestible", pero los siguientes deberían ser mucho mejores. Su precisión de lectura no es más que satisfactoria, y aun así no es para todas las aplicaciones. En cuanto a la productividad, claramente no es suficiente para la secuenciación del genoma, ya que al menos cinco células únicas que cuestan entre $ 500 y $ 900 (dependiendo de su cantidad en el pedido) deben gastarse en cada genoma.
Los chips están integrados en las células MinION, amplificando y digitalizando señales (corrientes picoamperias) de 512 nanoporos. GridION X5 funciona simultáneamente con cinco de las mismas celdas, pero en las celdas de PromethION el número de nanoporos analizados aumenta en 6 veces (hasta tres mil). Esto permitirá que el genoma humano sea secuenciado en una célula. Es cierto, con baja calidad, pero con lecturas largas, lo que facilita su montaje preciso. Y complementa bien las lecturas cortas (2x150 o 2x100), pero precisas (> Q30) obtenidas por secuenciadores fluorescentes. Por lo tanto, la secuenciación de nanoporos en PomethION puede complementar la fluorescencia, pero no puede competir con ella. Aunque si las células de la próxima generación no contienen miles, sino decenas o cientos de miles de nanoporos, su uso aumentará la frecuencia de lectura de ADN, mejorará la calidad de los datos y permitirá que los secuenciadores de nanoporos genómicos compitan con éxito en el mercado NGS con secuenciadores fluorescentes.
Para la mayoría de las tareas de secuenciación dirigida, el rendimiento de MinION (5 ... 10 Gb) es claramente excesivo. Por lo tanto, ONT planea lanzar MinION Dx (o FLONGLE), una modificación de MinION con un inserto adaptador para 128 o 256 células de poro.
Fig. 8. Secuenciador FLONGLE
Las celdas desechables para FLONGLE pueden ser mucho más baratas, porque sus componentes electrónicos se colocan en un inserto adaptador reutilizable, con el que se unen mediante una almohadilla de contacto tipo LGA (Land Greed Array).
Otro secuenciador compacto de nanoporos (SmidgION), conectado a un teléfono inteligente (iPhone 7 ... X), debería aparecer a la venta en los próximos meses.
Fig. 9. El primer secuenciador "gadget" SmidgION
La secuenciación de nanoporos barata y asequible puede cambiar todo el mercado NGS (y el mundo al mismo tiempo). Pero esta habilidad se manifestará completamente solo después de la aparición de competidores dignos. Uno de esos competidores podría ser Roche Sequencing , que ha estado desarrollando su propia tecnología de secuenciación de nanoporos desde 2014. A juzgar por algunas publicaciones y mensajes en Internet, otros competidores pueden aparecer pronto.
Sería bueno tener competidores similares en Rusia también, pero el desarrollo de secuenciadores, especialmente los nanoporos, no se incluyó en la lista de "Instrucciones prioritarias para el desarrollo de la ciencia, la tecnología y la tecnología en la Federación de Rusia", aprobado por el Decreto del Presidente de la Federación de Rusia No. 899 del 7 de julio de 2011. Por lo tanto, solo podemos esperar que los geeks desarrollen secuenciadores de semiconductores en sus propias cocinas o microscopios electrónicos en garajes personales . No será posible prescindir de hackers que puedan hackear el software MinION. El hecho es que este secuenciador solo puede funcionar si tiene una conexión a Internet. Y cada lanzamiento autónomo debe coordinarse con los desarrolladores. Pero hay más "problemas" extraños. Por ejemplo:
• Cada dispositivo y cada celda de flujo están vinculados a un usuario específico, detrás del cual se encuentra la dirección real del laboratorio donde trabaja y realiza la investigación. Al mismo tiempo, Oxford Nanopore Technologies puede obtener información sobre la ubicación de cada dispositivo.
• Política de sanciones: Oxford Nanopore Technologies revisa cada organización y nuevos usuarios finales antes de entregar productos.
• Para evitar estar en la Lista de envío, los laboratorios tienen prohibido transferir productos de Oxford Nanopore Technologies a terceros.
Curiosamente, de acuerdo con la mencionada "Lista de laboratorios de envío prohibidos", la ONT se negó recientemente a vender MinION a organizaciones "paramilitares" como la Universidad Estatal de Moscú y la Universidad Estatal de San Petersburgo.
En este sentido, la primera prioridad para Rusia en el campo de la secuenciación de nanoporos es piratear el software utilizado por el secuenciador MinION.
La siguiente tarea es la ingeniería inversa de las células de este dispositivo. Y, por último, el desarrollo de la formación de membranas lipídicas bicapa en ellas con canales iónicos integrados adecuados para la secuenciación de ADN de nanoporos. Es mejor buscar biohackers (biofísicos, biólogos moleculares, ingenieros genéticos, etc.) para tal trabajo en otros lugares, pero aquí, en Geektimes, me gustaría discutir los problemas del pirateo de software y la ingeniería inversa con hackers y geeks que están bien versados en electrónica.
Le agradecería cualquier pregunta, comentario y sugerencia.
Sinceramente suyo, genseq