En general, subimos a Filipinas y buscamos bacterias astutas. Luego fuimos a Islandia con químicos, y hablaron sobre las expediciones de biólogos a las montañas en busca de bacterias termofílicas (que viven cerca de las aguas termales), y resultó que toda esta historia era necesaria para la reacción en cadena de la polimerasa. Me resultó sumamente interesante qué relación tiene el laboratorio con los análisis de sangre con la fuente geotérmica, y ahora te contaré esta emocionante historia.
Esto significa que ayer en Vladivostok, Rospotrebnadzor y la Universidad Federal del Lejano Oriente abrieron un centro de capacitación en PCR. Conduje hasta allí junto con reporteros y encontré científicos normales y locos que explicaron todo con los dedos. Porque esto es exactamente lo que harán allí: enseñar vietnamita y chino. Básicamente, aprenda a lidiar con las bioamenazas.
Entonces, ¿qué es la PCR?
Esta es una historia sobre cómo hacer varios millones de exactamente lo mismo a partir de una sola molécula de ADN.
Basic es una reacción de tres pasos: desenrollar el ADN en hélices separadas, luego buscar y marcar el comienzo y el final de los sitios deseados, y luego completar las moléculas marcadas usando polimerasa para completar. Es decir, es un simulador de replicación de ADN en nuestro cuerpo, solo hecho in vitro. Y extremadamente rápido.
Es decir, cortamos todo el ADN en mitades, solo encontramos las mitades del patógeno, las marcamos, luego la polimerasa se acumula en los pares marcados. Repetimos Repetimos
La reacción moderna duplica la cantidad de ADN en el matraz cada 40 segundos. Más precisamente, la eficiencia del ciclo es ligeramente menor: del 78% al 99%, porque no todo y no siempre está vinculado en el mundo real.
¿Por qué se necesita esto?
Si algún patógeno flota en su sangre, puede generar una reacción específica para él, que amplificará (aumentará la cantidad) de su ADN. En algún momento, habrá tantos de ellos en la preparación que puedes notarlo. Y aquí el robot gritará: "¡Sí, lo tengo!", Y el resultado será "positivo".
Como iniciación, solo necesitamos 50 moléculas por mililitro en el caso general. A modo de comparación, el virus de la gripe ni siquiera está en la sangre, sino en la saliva del paciente con los primeros síntomas: alrededor de 10 mil piezas por mililitro.
¿Por qué todavía se necesita esto?
Literalmente, puede comprar un par de ADN de la momia de la piel del faraón, el mamut o el tigre y secuenciarlo con el genoma. Es decir, es realmente posible considerarlo completamente, porque de una cantidad insignificante de material para la investigación obtendrá muchas moléculas de ADN. De ahí la aplicación en la ciencia forense: puede establecer cuál de los reyes fallecidos de quién fue hijo. O por un par de moléculas de saliva en la escena del crimen para encontrar al delincuente (directamente Gattaka). O incluso más frío: puede replicar moléculas con cambios y obtener mutagénesis controlada. Pero esto último es difícil.
Y la PCR es la misma reacción que cambia el comportamiento social de la sociedad. Porque con la ayuda de esto se determina la paternidad: puede seleccionar solo diferentes secciones de ADN y evaluar dónde y qué es diferente (y cuánto), es decir, buscar parientes cercanos. Bueno, o simplemente secuencia y evalúa las diferencias.
Pero luego estamos hablando del diagnóstico de infecciones virales y bacterianas: este es el uso más extendido. Y aquí le enseñan en Vladivostok.
¿Cómo es la PCR en general?
Tomamos material, como sangre u otra cosa. Preparamos cuidadosamente el medicamento (generalmente se toma 1/3 del material, de modo que en caso de errores en el análisis, permanezcan dos dosis más en el archivo hasta el final del estudio). El medicamento se mezcla con un sistema de prueba. En un matraz cerrado colocamos esta "sopa" en el dispositivo para llevar a cabo la reacción.
A continuación, comienzan los ciclos de desenrollado del ADN, la unión de los cebadores y la alineación de las moléculas completas utilizando la polimerasa. Los métodos modernos de PCR en tiempo real sugieren que las etiquetas deseadas se acumulan y brillan. Esto es increíble porque no tiene que abrir el tubo para reaccionar al aislamiento de las secuencias de ADN deseadas. Cuando se puede registrar el resplandor, se toma la decisión de cuáles fueron las cepas deseadas en los materiales.
Unos pocos ciclos más le permiten evaluar el grado de cambio de señal e hipotetizar cuántas moléculas de ADN estaban inicialmente en el material, es decir, con suficiente precisión para determinar la concentración del patógeno.
¿Cómo sabe la cartilla a qué aferrarse?
Un cebador es una mierda que se adhiere a lo que coincide con su código de nucleótidos. Si necesita el virus de la rabia, debe secuenciarlo con un genoma (más precisamente, estamos interesados en el principio y el final del ADN) y registrar los lugares a ambos lados de la molécula donde las cadenas de nucleótidos son únicas. Y hacer cartillas para ellos. Los cebadores se unen a las mitades del ADN y la polimerasa comenzará a funcionar desde arriba.
Entonces nada se aferra al ADN de las células sanguíneas, solo a la rabia.
Los cebadores de la rabia solo se aferrarán a la rabia. Para diagnosticar a su vaca por rabia y gripe, necesitará dos dosis de sangre y dos reacciones diferentes.
Ahora la parte divertida. No necesitamos el comienzo y el final exactos de la molécula de ADN para el diagnóstico. Solo necesitamos muchos sitios reconocibles. Es decir, en el genoma completo, por ejemplo, la gripe aviar, deben distinguirse dos fragmentos únicos: el comienzo de la copia y el final de la copia. De modo que entre ellos hay algo que puede identificarse inequívocamente como gripe aviar sin desencadenantes falsos positivos y falsos negativos.
Además, las matemáticas entran en juego: es necesario distinguir los lugares únicos del genoma y, por lo tanto, son muy cortos, idealmente de 15 a 30 nucleótidos. Y para que entre ellos sea lo correcto. Dos cebadores dan algo así como un hash de una molécula de ADN, es decir, permiten que se describa en 30-60 nucleótidos.
En estos mínimos se adjuntan sitios suficientes para reconocimiento y cebadores. Si se aferran a otra cosa, era un mal objetivo, y la precisión cae.
Entonces, ¿qué tienen que ver las aguas termales con él?
El hecho es que la reacción ocurre a alta temperatura, de lo contrario el ADN no se desnaturaliza. La polimerasa a esta temperatura generalmente se descompone. Por lo general, porque es específicamente con las bacterias termofílicas que se preocupa con calma. Por lo tanto, hubo expediciones a Kamchatka en el siglo pasado, donde los geólogos buscaban medios para la medicina molecular, disparando a los osos. Y en Europa condujeron a Islandia.
Lo curioso es que en 1976 y en 1980 hubo publicaciones sobre la polimerasa (la nuestra y la estadounidense), pero a todos les pareció un hecho curioso, y no encontraron una aplicación práctica.
Ahora en Resulta que la polimerasa Taq de Thremus aquaticus funciona de acuerdo con un protocolo como UDP, es decir, sin corrección de errores. En general Reúne lo que sucede y llévate allí solo. Pero rapido.
Las polimerasas Pfu y Pwo se aislaron de las arqueas: funcionan con corrección de errores, es decir, no dan mutaciones en el proceso de replicación (está bien, casi no lo hacen), pero actúan mucho más lentamente.
Anteriormente, las existencias de esta sed se obtuvieron directamente de las fuentes, ahora la polimerasa se cría en laboratorios. Y hacen una mezcla complicada de Pfu, Pwo y Taq: resulta muy rápido y relativamente correcto.
¿Cómo se ve en el mundo real?
En el mundo real, tiene una caja de sistemas de prueba con la intrigante inscripción "sífilis", por ejemplo. O la gripe. Dentro de un sistema de prueba: todos los componentes para la PCR, excepto la matriz de ADN, es decir, la sangre del paciente. O otra parte de él donde se busca el patógeno.
Luego, debe mezclar la sangre y el sistema de prueba, calentar y enfriar muchas veces bajo presión, y el catalizador, los cebadores, la polimerasa y los componentes auxiliares harán todo por sí mismos. La salida es un tubo de ensayo con 10 en la duodécima molécula de ADN por mililitro.
¿Se puede hacer en la cocina?
En teoría El dispositivo en sí es muy simple, toda la alta tecnología en el sistema de prueba y un pequeño software que registra el cambio en la señal luminosa de la etiqueta. Todavía necesita precisión en la temperatura de 0.1 grados y programas para su cambio. Además de un fotosensor. Es decir, el hierro no es muy complejo. Por lo tanto, hay muchos de estos laboratorios, son realmente baratos de implementar.
Pero en la cocina, no funcionará, porque la peor historia es la contaminación de la muestra (contaminación). Los protocolos de pureza son lo que se enseña más que las reacciones mismas. Si uno de los tubos resultantes con ADN patógeno se rompe en el laboratorio, todo se cubrirá con una capa uniforme de resultados falsos positivos. Es decir, todos los análisis actuales, inmediatamente por el bosque, luego una larga limpieza, verificación, luego recuperación de sangre archivada y nuevamente el lanzamiento de la línea.
Bueno, esto, les recuerdo, que el ADN del patógeno y el patógeno en sí son dos cosas diferentes, como el código fuente y el código compilado. Y el peligro de que rompas un tubo de ensayo con 10 en el duodécimo ADN del patógeno de la tuberculosis es casi lo mismo que esparcir un paquete de hojas de código fuente para lanzar una ojiva nuclear por el suelo.
4-7% de los resultados pueden ser falsos positivos debido al trabajo descuidado y las características del mundo real. Por lo tanto, se realiza una verificación exhaustiva de la fiabilidad del resultado, en particular, utilizando métodos matemáticos.
Junto con los materiales de PCR convencionales, se somete un tubo de ensayo con agua. Si algo comienza a amplificarse allí, el técnico se arrancará las amígdalas.
Esto no es seguro, es una puerta de entrada para transferir material al laboratorio. El personal es transferido al laboratorio en un área limpia después de una ducha, cambiarse de ropa y un par de procedimientos más degradantes para la dignidad humana.¿Cómo puedes entender que algo está mal con la reacción?
Por la naturaleza de su desarrollo. La reacción habitual comienza lentamente, luego la fase de crecimiento exponencial, luego en el área de los últimos ciclos: salida a la meseta. La cantidad de ADN no aumenta con los nuevos ciclos por docenas de razones desde el agotamiento del cebador hasta la finalización de uno de los recursos, los pirofosfatos se acumulan. Además, las mitades de ADN que no han reaccionado antes nadan en la sopa y se escapan para abrazarse. Como resultado, puede identificar artefactos y un curso atípico de la reacción; esto ya hace software para la minería de datos pequeños. Doméstico, gratuito, actualizado regularmente, pero no de código abierto.
¿Y por qué necesita aumentar la cantidad de ADN en el medicamento, si todo lo que necesita es mejorar los métodos de detección?
Existe tal camino de desarrollo. Se están mejorando los métodos fisicoquímicos, pero hasta ahora no son suficientes. La última experiencia: tomaron plasma sanguíneo, se centrifugaron, los virus "pesados" cayeron al fondo del tubo. Luego se frieron con un espectrógrafo de masas láser. Nifiga Funciona con colonias de bacterias (lo han estado haciendo en los laboratorios de Moscú durante mucho tiempo), pero no funciona con virus. Y la colonia aún necesita ser cultivada. Por lo tanto, hasta ahora (y, al parecer, los próximos diez años), la PCR será lo más rápido para el análisis.
Por cierto, se realiza un análisis completo en aproximadamente 45 minutos (con la preparación del material), es decir, medio día de
cito o 4 días si el laboratorio está en la ciudad y usted en el pueblo.
Para algunas enfermedades infecciosas, la concentración del virus es extremadamente baja. Por ejemplo, hubo un caso de encefalitis: el médico vio síntomas focales (daño en el sistema nervioso central), tomó sangre, incluso la PCR aún no muestra nada y los anticuerpos ya están desplegados. Es decir, la PCR daría un resultado más tarde que el análisis de anticuerpos y la espectrografía de masas; incluso más tarde, sigue siendo un orden de magnitud menos preciso que la PCR.
Es decir, ¿solo se amplifica un genoma específico?
En el caso habitual, sí. Se encuentra la cepa más avanzada de la enfermedad que es relevante para la región, y los cebadores se dirigen a su ADN. Pero esta es una situación ligeramente utópica, porque al mismo tiempo debes buscar seis piezas de cepas diferentes a la vez. Para hacer esto, se agregan diferentes cebadores al conjunto, además de una serie de cambios. Naturalmente, el sistema de prueba es más caro. O necesita hacer varias reacciones para diferentes patógenos.
¿Puedo multiplicar el ARN?
Sí, solo necesitas hacer ADN con él. La reacción es más compleja, pero interesante porque le permite separar las células muertas de las células vivas. El ADN es increíblemente fuerte, por lo que incluso se puede despegar de un mamut. Si el virus ya ha sido eliminado, el ADN de sus muestras muertas "brillará" durante otras 3 semanas. Y el ARN se desmoronará mucho más rápido. Por lo tanto, los métodos NASBA (búsqueda de virus de ARN, por ejemplo) son mucho más precisos en algunos casos. Pero mucho más caro.
Un par de cosas mas bonitas
Toda la historia de la implementación de PCR después de la invención de la teoría es directamente problemas físicos y químicos difíciles. Por ejemplo, secciones desconocidas de ADN pueden amplificarse. Para hacer esto, la molécula se corta en un área conocida, luego los restos se pegan. Algunos se dan vuelta para formar moléculas con un código conocido al principio y al final. Los cebadores se aferran, y en aquellos donde hay un principio y un final, y no solo un marcador, se lleva a cabo la amplificación.
Una historia muy divertida sobre cómo evitar pasos de reacción innecesarios al calentar el tubo. El hecho es que la primera parte de la reacción se desarrolla a alta temperatura, pero mientras el tubo de ensayo se calienta, puede comenzar accidentalmente con un latido incorrecto; esto aumentará drásticamente el ruido y la probabilidad de error. Por lo tanto, las opciones con el hecho de que uno de los reactivos del sistema se coloca en una cápsula de cera (se derrite solo después de pasar por el punto deseado y libera el componente a tiempo) llegó a la opción cuando se agrega una sustancia a la solución que bloquea la reacción, pero se descompone a alta temperatura.
Existe protección contra la contaminación: las moléculas en la amplificación se pueden etiquetar de cierta manera, y luego, al comienzo de la reacción, se destruyen todas las etiquetas de esta manera. Es decir, si algo de un tubo se metió en otro, se llenará automáticamente a las reacciones principales.
La fluorescencia también es fría: se coloca una sustancia en los reactivos, que se destruye como resultado de las reacciones con el ADN. Es decir, cuanto más ADN se forma, más moléculas de esta sustancia se rompen. El todo no brilla, pero en pedazos comienza. Y mientras más moléculas de ADN reaccionan durante la replicación, más brilla el tubo.
Dado que la complejidad de los sistemas de prueba está creciendo, los trucos de la vida y las soluciones elegantes son el mar.
¿Por qué los centros de formación de PCR en las universidades?
Porque esta sigue siendo la historia principal sobre el diagnóstico de enfermedades, y no necesariamente en las personas. Aquí, en el Lejano Oriente, por ejemplo, el enfoque puede estar en los fitovirus. Hay un virus binario con especias de arroz en los contenedores de la Patria (más precisamente, dos virus bien emparejados) que pueden tomar y distribuir toda la cosecha en Asia. Naturalmente, tal cosa no es solo nuestra, y no necesariamente se lanzará maliciosamente, sino que puede desarrollarse de acuerdo con la idiotez o simplemente en un hogar natural. Al igual que la encefalitis japonesa en Primorye, los focos estacionales de mosquitos surgen constantemente aquí. Y la mortalidad es del 60 por ciento.
El supuesto adversario también tiene virus en animales y humanos.
Entonces, los especialistas en PCR representan la bioseguridad del país. Monitorean las infecciones, atrapan a todos los pasajeros en el avión, donde algunas personas tosieron, y así sucesivamente. Michael, por ejemplo, voló en un ébola, tanto en gripe aviar como en mucho más. Secuenció el genoma completo de la única copia viva del virus de la rabia en el mundo.
Mikhail Shchelkanov, Profesor, FEFU, Jefe del Centro Federal de Investigación de Virología para la Biodiversidad, Rama del Lejano Oriente de la Academia de Ciencias de Rusia.Con un oso en general, una historia increíble. El oso levantó 5 perros y luego atacó a la abuela. Le giró el pulmón y le arrancó el cuero cabelludo, además de babear por todo y cubierto de sangre. Los cazadores decidieron sobre la bestia que era una especie de oso equivocado. Y dieron sus restos a los científicos para experimentos.
Aquí hay más detalles.
Mikhail también es fanático de los lobos marinos, porque ama las islas con colonias. Transmiten virus y parásitos extremadamente rápido a toda la población. Encontraron en los gatos en las fosas nasales un piojo frío con bacterias no menos frías. Cuando un sello se zambulle, cierra sus fosas nasales. El piojo en el interior se siente cálido y encantador.
Además de la bioseguridad, la segunda historia es la capacitación de especialistas extranjeros. Hay dos cosas importantes: en primer lugar, estudian en nuestros sistemas de prueba (y luego serán más propensos a comprarlos), y esto es importante para la exportación: somos líderes en la CEI (aproximadamente 25 millones de reacciones por año), pero no en el mundo . En segundo lugar, la uniformidad de la experiencia permite el mismo monitoreo mediante protocolos comunes, es decir, luego cambia las bases de datos y la experiencia. Las bases, por supuesto, son más importantes. Esto significa una respuesta mucho más consistente a posibles epidemias.
En Vladivostok, la apertura oficial no coincidió con la técnica: un grupo de médicos vietnamitas está terminando sus últimas lecciones. Dos saben ruso, el resto aprende a través de ellos. Hay un curso de inglés completo. El mismo centro trabaja en Novosibirsk para médicos rusos y médicos de los países de la CEI, y los especialistas se han graduado allí durante un año.También estamos haciendo todo por nuestros sistemas de prueba en Rusia, y en la práctica la biología molecular es una de las más poderosas del mundo (en teoría, no, pero implementamos todo de manera rápida y creativa). Por lo tanto, la educación ayudará a expandir este mercado para nosotros. En total, 3881 especialistas fueron capacitados en dichos centros (grupos pequeños, porque hay mucha práctica), y ahora la tarea es ir ampliamente a capacitar especialistas extranjeros.
Esto se llama totalmente el Centro Internacional de Capacitación de Rospotrebnadzor en la Escuela de Biomedicina de la Universidad Federal del Lejano Oriente. Fue abierto, de hecho, por Mikhail Shchelkanov con la foto de arriba y German Shipulin (FBUN CRI de Rospotrebnadzor en Moscú). Las pruebas en los medios serán mañana, aparentemente. Bueno, no soy un microbiólogo, así que si cometí un error en algún lugar arriba, por favor, por favor.
UPD: aquí están las noticias sobre
RG , que todavía tiene un punto de vista sobre esta historia.