Análisis de velocidad micromotor molecular para diagnóstico de VIH

El virus de la inmunodeficiencia humana o simplemente el VIH es la plaga del siglo XX. Un título bastante alto, pero no es exagerado. Esta enfermedad cobró millones de vidas. Y cada año crece el número de víctimas de esta enfermedad insidiosa, así como el número de estudios destinados a tratar y diagnosticar el VIH. Cualquier enfermedad, y el VIH no es una excepción, es más fácil de tratar en las primeras etapas de desarrollo. Pero esto requiere una forma de reconocerlo lo antes posible, incluso antes de que los primeros síntomas comiencen a manifestarse. Cuando, por ejemplo, se corta un dedo, ve un corte, es decir, claramente sabe qué tratar. El VIH puede vivir en el cuerpo humano sin manifestarse, es decir, asintomáticamente, durante bastante tiempo. Hoy consideraremos una nueva invención que puede determinar de manera rápida y precisa la presencia del virus de inmunodeficiencia a través de un pequeño dispositivo conectado a un teléfono inteligente. ¿Cómo funciona esta innovación, qué tan precisos son sus resultados y qué planean los investigadores en el futuro? Buscaremos respuestas a estas y otras preguntas en el informe del grupo de investigación.

Base teórica

Hablar de enfermedades es desagradable, pero necesario. Cuanto más sepamos acerca de ellos, mejor podremos protegernos a nosotros mismos y a nuestros seres queridos de su influencia.



El VIH - virus de la inmunodeficiencia humana mostró por primera vez su terrible mueca a principios de los años 80 del siglo pasado. Entonces nadie supo qué era, y el virus en sí mismo ni siquiera tenía un nombre. Investigaciones posteriores han demostrado que el VIH es un retrovirus que infecta las células del sistema inmunitario del cuerpo, uno de los sistemas más importantes. El efecto del virus es la supresión de la defensa inmune y el desarrollo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida por el SIDA. En este estado, el cuerpo permanece indefenso y cualquier infección, incluso la más leve, (así como las células cancerosas) puede afectarla dramáticamente. En esencia, el VIH destruye nuestra defensa y los enemigos frente a las infecciones se apoderan del cuerpo con calma.

El VIH tiene un mecanismo de transmisión de contacto. La infección puede ocurrir por contacto con sangre, semen, leche materna, líquido previamente sembrado o secreciones vaginales. En otras palabras, las relaciones sexuales sin protección, los instrumentos médicos infectados e incluso las agujas no infectadas en los salones de tatuajes son una excelente manera de propagar el virus. En el período de la aparición del VIH, cuando el pánico se extendió entre la población más rápido que la información confiable sobre qué es el VIH y cómo se propaga, se creía que la infección podría ser un simple apretón de manos. Esto es un mito, porque el virus no se propaga a través de un simple contacto con una persona infectada. Sin embargo, esta opción de infección también es posible, pero solo en el caso de heridas abiertas en las manos de los infectados y posibles víctimas de la infección. No estoy hablando del hecho de que algunos consideran que los mosquitos transmiten el VIH (un mosquito bebe la sangre de un paciente y, al haber picado a una persona sana, puede infectarlo) también es un mito.


Prevalencia mundial del VIH según la Organización Mundial de la Salud (2017).

No describiré en detalle el virus y las consecuencias de su desarrollo en el cuerpo, porque vamos a discutir no tanto el virus en sí como un nuevo método para su diagnóstico. Pero vale la pena señalar que el VIH es un virus paciente que puede mutar en el cuerpo de una persona infectada con el tiempo, lo que lo hace aún más resistente a varios métodos de contención o tratamiento. Esta es otra razón por la que debe detectarse lo antes posible. Mientras más tiempo tenga el virus, más fuerte es y más débil es la persona infectada.

¿En qué consiste el dispositivo?

Los científicos involucrados en este estudio dicen que uno de los problemas y barreras más serios en el diagnóstico temprano del VIH, como otras enfermedades, en el mundo es la falta de condiciones apropiadas: laboratorios, personal, instalaciones médicas. Es por eso que decidieron crear un dispositivo que pueda indicar con precisión si hay un virus en el cuerpo o no. Los niveles de azúcar en la sangre ya se pueden verificar durante mucho tiempo utilizando dispositivos compactos portátiles (glucómetros), es decir, sin tener que visitar el laboratorio y esperar los resultados de la prueba durante varios días. El costo de tales dispositivos es bastante bajo, lo que también acompaña su distribución.

El dispositivo con el que nos familiarizaremos hoy puede describirse brevemente de la siguiente manera: un analizador móvil para la determinación molecular del VIH-1 basado en la amplificación isotérmica de asa (LAMP) y nanomotores (CALM). Y ahora, en orden.

Nanomotores

Los nanomotores (también llamados micromotores) se denominan dispositivos moleculares microscópicos que son capaces de convertir energía en movimiento. Si se colocan en una solución química específica, comienzan a moverse independientemente a lo largo de una ruta específica, que se puede utilizar en diagnósticos e incluso en el suministro de energía de dispositivos nanotecnológicos.


El esquema de formación micromotor para un probador de VIH.

Los micromotores son esferas de poliestireno recubiertas con nanopartículas de Pt (platino) con una densidad de 1,04 g / cm. Además, las nanopartículas de Au (oro) también se usaron para modificar los micromotores con sondas de ADN (en el diagrama anterior, se presentan como "tentáculos" rojos).

Un TEM (microscopio electrónico de transmisión) mostró que las nanopartículas de platino y oro utilizadas en el recubrimiento de los micromotores tenían forma esférica y tenían un diámetro de 57.721 ± 5.181 nm (Pt) y 3.43 ± 1.336 nm (Au).


Arriba están las imágenes TEM, frascos fotográficos con nanopartículas preparadas y los resultados de la espectroscopía óptica.

Era necesario verificar qué tan eficientemente una sonda de ADN de un micromotor completamente formado puede capturar moléculas de ADN. Para esto, se utilizó la técnica de electroforesis en gel de agarosa * (C ₁₂ H ₁₈ O ₉ ).

La agarosa * es un polisacárido lineal formado por una secuencia de residuos de β-D-galactopiranosa y 3,6-anhídrido-α-L-galactopiranosa unidos por un enlace 1 → 4. Obtenido de agar.

Esta técnica nos permitió confirmar que los micromotores tienen sondas de ADN en su superficie, ya que pudieron unir una molécula de ADN artificial de aproximadamente 180 pb (bases emparejadas), que es un excelente resultado para una muestra (artificial) (imagen a la izquierda). El grado de eficiencia de captura durante las primeras pruebas fue aproximadamente del 30%, lo que se confirma por fluorimetría (imagen a la izquierda).


Aquí vemos cómo los micromotores se mueven en solución con diferentes concentraciones de H2O2 (0, 5, 10 y 15%).

También fue necesario verificar la característica más importante de los micromotores: el movimiento. Para esto, _{se utilizó} una solución con y sin H2O2 (comparación de las trayectorias en la imagen d a continuación). Cuando el peróxido de hidrógeno estaba ausente, los micromotores vibraban, lo que se debía al movimiento browniano. Cuando el H2O2 comenzó a introducirse en la solución, la velocidad de los micromotores aumentó en aproximadamente 0.7 μm / s por cada 1% de peróxido de hidrógeno en la solución.


Medición de la velocidad de los micromotores en una solución de prueba.

La Figura a muestra la dependencia de la velocidad de los micromotores con un diámetro de 6 μm y la concentración de H2O2 en solución. También (a la derecha) hay una instantánea del micromotor y su trayectoria. El diagrama b muestra el grado de estabilidad de los micromotores a diversas temperaturas en una solución de peróxido de hidrógeno al 5%. A continuación (gráfico e instantánea) vemos cómo cambia el indicador de estabilidad con el tiempo (120 s), así como la trayectoria del movimiento ya en una solución del 15%. El desplazamiento cuadrático medio a lo largo del tiempo se muestra en los gráficos e : puntos negros: una solución sin H2O2, rojo: 5% H2O2.

A continuación, en la imagen f , vemos que no solo el estado de la solución donde se encuentran los micromotores afecta su comportamiento, sino que los propios micromotores, y más precisamente su estructura, también lo cambian significativamente. Vemos cómo se mueven los micromotores con un diámetro de 3 μm sin depósito de platino y oro (líneas azules) en comparación con los micromotores probados con un diámetro de 6 μm (líneas rojas). A la derecha de la comparación de las trayectorias hay una comparación del desplazamiento cuadrado medio de los micromotores (3 μm y 6 μm de diámetro).

Dispositivo móvil

Motorola XT1575 (sistema operativo Android) se usó para visualizar y rastrear micromotores (es decir, para monitorear cómo ocurren los diagnósticos).


Apariencia y detalles del dispositivo.

Un componente importante del dispositivo es el chip necesario para verificar el movimiento de los micromotores. Estaba hecho de polimetilmetacrilato (plexiglás). Se fijó una base de vidrio con un "canal" cortado con láser de 2 mm de ancho utilizando una capa de pegamento de 80 μm.


La apariencia del chip y sus dimensiones.

Como se puede ver en las imágenes de arriba, el chip no es la única parte del dispositivo. La carcasa azul extraíble estaba hecha de materiales económicos en una impresora 3D. Dentro de este estuche hay un LED blanco, una batería de 3.3 V, un interruptor y lentes ópticos económicos. También en el caso hay un soporte de muestra que le permite colocarlos entre las lentes y la cámara del teléfono.

Y ahora sobre el componente de software. El software fue creado en Android Studio usando las bibliotecas OpenCV 3.1.0. La interfaz, según los científicos, se ha hecho lo más clara y práctica posible para los usuarios.


Interfaz de prueba de VIH.

Cuando la muestra se coloca en el dispositivo, el programa graba un video (30 fps, 320x240 píxeles), que muestra el movimiento de los micromotores, calcula su velocidad y en 1 minuto da el resultado del análisis.

Amplificación isotérmica de bucle (LAMP)

¿Qué tan efectivo es el sistema micromotor para reconocer el VIH-1? La respuesta a esta pregunta radica en las reacciones de LAMP. Para la prueba, se prepararon varias muestras con diferentes concentraciones de ARN del VIH-1 (ácido ribonucleico). El resultado de amplificación se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa.


Prueba de LAMP.

Los resultados de la electroforesis mostraron la formación gradual de un gran amplicón de ADN (secuencia de ADN, resultado de amplificación). El número de amplicones fue proporcional a la concentración de ARN del VIH-1.

Los micromotores se mezclaron con amplicones de ARN del VIH-1, lo que permitió someterse a un proceso de hibridación (a una temperatura de 80 ° C). A continuación, la "mezcla" resultante se probó en una solución al 5% de H2O2. Cuando los amplicones de ARN del VIH-1 estaban presentes en el sistema, la velocidad de los micromotores se redujo mucho, en aproximadamente un 95,26%. Se observa una disminución en la tasa incluso a una baja concentración de amplicones (aproximadamente 3.394 ± 0.245 ng / μl).


Demostración del movimiento micromotor en ausencia de ARN del VIH-1.


Demostración del movimiento micromotor en presencia de ARN del VIH-1.

Los científicos también lograron restaurar los micromotores y su velocidad. Para esto, la muestra "infectada" con micromotores y amplicones se incubó durante 30 segundos a una temperatura de 90ºC. Esto hizo posible liberar amplicones de las sondas de ADN micromotor. Esto fue seguido por centrifugación a 6000 x g durante 5 minutos. La verificación de la muestra obtenida en una solución al 5% de H2O2 mostró que la velocidad del micromotor se restableció al nivel del 75.52% del original, antes de la prueba con la participación de amplicones de ARN del VIH-1.

También se probó la reacción del sistema a otros tipos de virus de transmisión sexual: hepatitis C y B, herpes, virus del papiloma 16 (HPV-16). Debido a los frecuentes casos de infección paralela tanto con el VIH como con algunos de los virus anteriores, esta prueba también fue de gran importancia. El resultado fue satisfactorio: los amplicones de ADN se formaron solo en presencia de VIH. Es decir, la presencia de otros virus en la muestra de prueba no afectó el proceso de verificación.

La conclusión es simple: el método puede determinar la presencia del VIH. Pero ahora es necesario llevar a cabo una calibración para que el sistema pueda distinguir la presencia y ausencia del virus en la muestra, centrándose en la concentración estándar de 1000 partículas / ml. Si la concentración está por debajo de este indicador, el resultado es negativo (no hay virus), si la concentración es mayor, es positivo. Para llevar a cabo la calibración, fue necesario determinar qué velocidad de micromotores corresponde a qué concentración. Para esto, se utilizó PBS - tampón de fosfato de sodio (una solución especial para la investigación) y el plasma de pacientes con y sin VIH.

La calibración se realizó usando PBS, en el que la concentración de ARN de VIH-1 estabilizado sintético varió de 0 a 107.

Después de la calibración, quedó claro que la velocidad promedio del micromotor a una concentración de VIH de 1000 es 0.705 ± 0.082 μm / s.


Los resultados de determinar la concentración de ARN del VIH-1.

Los científicos también analizaron el sistema utilizando la curva ROC, que mostró resultados muy alentadores. La sensibilidad * del sistema probado fue de aproximadamente 94.6% con un IC * de 81.8-99.3%, y la especificidad * de 99.1% con un IC de 80.5-100%.

Sensibilidad * : un indicador que refleja la proporción de resultados positivos (en este caso, es la probabilidad de que la concentración de VIH en la muestra sea superior a 1000).

La especificidad * es un indicador que refleja la proporción de resultados negativos (en este caso, es la probabilidad de que la concentración de VIH en la muestra sea inferior a 1000).

DI * : intervalo de confianza, es decir, el intervalo que cubre un parámetro desconocido con una confiabilidad dada.

El diagrama de dispersión de los resultados del sistema también mostró resultados increíbles. Por lo tanto, la precisión de determinar una muestra con una alta concentración de VIH como positiva es del 100%, y la precisión de determinar muestras negativas es del 90%.



Aquellos que deseen familiarizarse con el estudio con más detalle pueden consultar el informe de los científicos y materiales adicionales .

Epílogo

Los científicos que crearon este increíble dispositivo no niegan que todavía tienen que realizar muchas pruebas, calibraciones y mejoras. Pero están claramente en el camino correcto. Dichos dispositivos pueden reducir significativamente la propagación del VIH, especialmente entre personas en lugares donde los laboratorios con personal y un montón de equipos médicos simplemente no están disponibles.

Sí, el dispositivo aún no se ve muy compacto y el hecho de que requiera el uso de un teléfono inteligente puede alejar a alguien. Sin embargo, en el futuro, dichas tecnologías para el diagnóstico temprano del VIH continuarán mejorando, no solo en términos de eficiencia y precisión, sino también en términos de conveniencia y asequibilidad.

El VIH es la plaga del siglo XX, como escribí al comienzo de esta historia. Pero, desafortunadamente, este virus no está tan lejos del título de "plaga del siglo XXI". Hoy en día, varias enfermedades ya reclaman un título tan fuerte (por ejemplo, depresión, diabetes, etc.). Y cada una de estas enfermedades requiere gran atención. Y aunque no existe una píldora mágica que pueda curar cualquier dolencia, solo podemos mejorar los métodos de diagnóstico disponibles, que nos dan tiempo adicional para buscar tratamiento o contener la enfermedad. Como dicen, cuanto antes sepamos sobre un problema, más posibilidades tenemos de resolverlo.

Otro punto importante es la actividad social, la apertura y la discusión. El problema debe ser discutido, porque incluso si da miedo hablar de ello, ¿cómo piensa la sociedad luchar contra él?

En cualquier caso, eso es todo para mí. Cuídate a ti mismo y a tus seres queridos.

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