Moscas invisibles: un nuevo método para estudiar el sistema nervioso a través de la despigmentación de tejidos

El estudio de un organismo es un proceso complejo y requiere precisión. Los métodos modernos de escaneo han tenido éxito en esto. Hoy podemos estudiar con suficiente detalle el cuerpo o un órgano individual en imágenes tridimensionales. Hace unos 100 años, una visión tridimensional de los órganos solo se podía obtener quitándolos del cuerpo y examinándolos en vivo, por así decirlo. Sin embargo, siempre hay algún "pero". Pero incluso los escáneres y microscopios más precisos no pueden dar una precisión del 100%. Ahora, si fuera posible hacer invisible todo lo innecesario, y dejar visible esa parte del cuerpo que queremos estudiar. Suena a ciencia ficción, ¿no? Estoy de acuerdo Pero ahora es real. Hoy conoceremos el estudio de un nuevo método para escanear organismos utilizando el ejemplo de Drosophila. ¿Cómo lograron los científicos hacer que un mosquito común de la fruta fuera "invisible", cuán preciso es su método de escaneo y cómo ayudará esto en el diagnóstico de enfermedades humanas? Las respuestas a estas y otras preguntas solo las podemos obtener en el informe de los investigadores. Así que no lo jalemos. Vamos

Base de estudio

Como dije en uno de los artículos anteriores , cuyo personaje principal, como hoy, era Drosophila, este pequeño y, en verdad, molesto insecto es el tema de muchos estudios. Con su ayuda, los científicos están estudiando muchas cosas: desde la aerodinámica hasta el sistema nervioso. Y se trata de esto último que se discutirá hoy. El estudio de sistemas tan complejos en organismos tan pequeños está lleno de ciertas dificultades. Ya estamos familiarizados con los métodos para estudiar organismos cortándolos en muchas capas ultrafinas. Este método permite estudiar muchos sistemas con más detalle. Sin embargo, con respecto al sistema nervioso, este método, según los investigadores, viola la integridad celular, lo que complica el proceso de estudiar partes individuales del sistema.



Si aplicamos el escaneo en organismos pequeños sin "capas" físicas, veremos todos los sistemas al mismo tiempo. Pero los científicos quieren estudiar solo un sistema, mientras que otros no deberían interferir con este proceso. Por lo tanto, se les ocurrió una idea brillante y simple: hacer que todo sea invisible (o más bien transparente) y dejar intacto el sistema necesario.

Por el momento, hay suficientes herramientas para implementar tal idea, solo queda combinarlas. Los ingredientes principales de un nuevo método de escaneo llamado FlyClear (en honor al primer sujeto de prueba - Drosophila vuela) son la “limpieza” de tejidos y la ultramicroscopía.



Drosophila fue elegido como sujeto de prueba por una razón. La base de la mayoría de los métodos de limpieza de tejidos es la modificación genética del organismo de prueba. En este caso, es fluorescencia. Este proceso es extremadamente complejo y requiere mucho tiempo. Cuanto más grande sea el cuerpo, más tiempo se dedicará a su modificación. Además, no todas las criaturas pueden modificarse de la manera que los científicos quieren. Drosophila se presta a manipulaciones genéticas similares con bastante facilidad, y este proceso no lleva tanto tiempo.

Por el momento, el método más popular para estudiar organismos es la microscopía confocal, pero se realiza solo después de la disección de los tejidos. Surge la pregunta, ¿y si no es para diseccionar? En este caso, obtenemos una imagen pálida de baja calidad, y el proceso en sí llevará mucho tiempo. También se observará una fuerte absorción y dispersión de fotones en la muestra, especialmente con el aumento de la pigmentación del tejido (como en Drosophila). En consecuencia, la muestra debe limpiarse, es decir, hacerse transparente. Por lo tanto, para nivelar la disminución de la intensidad de la señal y lograr una resolución espacial uniforme. La forma principal de tejido "opaco" (disculpe por una palabra ficticia) es reducir el índice de refracción en los límites entre los componentes celulares.

Los investigadores no niegan que ahora hay varias formas que ya se han convertido en clásicas para hacer que las telas sean transparentes. Sin embargo, también afirman que estos métodos tienen una serie de desventajas. Preservación de la morfología, estabilidad de la fluorescencia, profundidad de exploración, etc. Con todos estos aspectos, los métodos existentes, por decirlo suavemente, no están bien. Además, ninguno de ellos proporciona una despigmentación completa de los tejidos.

Resulta que para una mejor exploración de cuerpos pequeños, ¿aún es necesario realizar una sección transversal de los tejidos? En realidad no Los científicos citan la misma Drosophila como ejemplo. Ubicadas en sus regiones periféricas (piernas, ojos, antenas), las neuronas sensoriales de Drosophila tienen conexiones muy largas con numerosos nervios y con el cerebro. Si estas regiones están en capas, entonces no obtendremos una imagen completa de cómo está estructurado el sistema nervioso en estas regiones.

En este estudio, el método FlyClear nos permitió eliminar la pigmentación del tejido de Drosophila, exponiendo su sistema nervioso. Tomó alrededor de un mes. Y la ultramicroscopía nos permitió visualizar las conexiones neuronales más pequeñas y construir un mapa completo del sistema nervioso del mosquito. Una sustancia también jugó un papel importante, con la ayuda de la cual fue posible "colorear" el sistema nervioso en un color verde brillante: una proteína fluorescente verde (en adelante denominada ZFB). El gen para esta proteína, obtenido de la medusa Aequorea victoria, se usa precisamente para la modificación genética de muestras de prueba.


Medusa Aequorea victoria.

Los datos obtenidos por microscopía de fluorescencia se procesaron mediante un algoritmo especial que le permite crear una imagen tridimensional con alta resolución.

Preparación del estudio

La limpieza óptica del tejido de Drosophila no es un proceso fácil. El exoesqueleto quitinoso y los fotopigmentos de ojo facetario son las regiones más difíciles del cuerpo del enanos para el procedimiento. Los métodos actualmente disponibles de limpieza de tejidos están lejos de ser ideales, porque los investigadores crearon los suyos: FlyClear, que mencioné anteriormente.

FlyClear combina varios de los métodos anteriores. El primero de estos en el proceso es CUBIC (cócteles de imágenes cerebrales claros y sin obstrucciones). Los pasos adicionales dependen del estado de la muestra (larva o adulto).


Opciones para el procedimiento FlyClear.

En el caso de la larva, se utiliza el 0,03% de fijación de proteasa y formaldehído. El hecho es que la proteasa rompe los enlaces peptídicos entre los aminoácidos de las proteínas, y esto ayuda a "decolorar" los tejidos. A continuación, se usa acetona en la muestra para la permeabilización (cambios en la permeabilidad de la membrana celular).

Los científicos lograron mejorar la etapa CUBIC al reemplazar [CH ₃ CH (OH) CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH (OH) CH ₃ ] ₂ (N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroxipropilo (etilendiamina) en C10H24N2O4 (2.2 ', 2 ", 2"' - (etileno dinitrilo) -tetraetanol)). Este cambio permitió lograr una despigmentación completa de los tejidos, incluso en áreas complejas (ojos y epidermis).

Entonces, el método de despigmentación completa de tejidos funciona. Ahora debe verificar la segunda etapa importante del estudio: la fluorescencia. Más precisamente, es necesario verificar si el nuevo reactivo C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ suprimirá las señales de fluorescencia, dado que Drosophila ya tiene baja fluorescencia después de las manipulaciones genéticas. Para la prueba, las muestras (cuerpos de Drosophila) se dividieron por la mitad: la mitad no se trató, la segunda con tratamiento. El análisis mostró que el nivel de severidad de ZFB realmente disminuye cuando se usa C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ , pero esto no afecta la precisión general. Y todo gracias al hecho de que el mismo reactivo permitió lograr un alto grado de despigmentación del tejido. Es decir, las ventajas del reactivo nivelaron sus deficiencias.

La muestra terminada debe considerarse, por así decirlo, y para esto, se usó ultramicroscopía avanzada para obtener una imagen de la muestra con la misma resolución en todos los planos.


Sistema óptico: 1 y 3 - una lente cilíndrica asférica plano-convexa; 2 - lente Powell; 4 - apertura suave apodizante elíptica; 5 y 6 - lentes cilíndricas.

Por lo general, la ultramicroscopía estándar usa lentes cilíndricos y una abertura rectangular. En este estudio, se utilizaron componentes adicionales que cambian la forma del haz a ultradelgado con características mejoradas.

El uso de lentes esféricas se debe a la capacidad de obtener una imagen sin distorsión y con una aberración mínima.

La apertura estándar también se ha cambiado a una apertura suave apodizante elíptica (en la imagen de arriba en el número 4). La nueva apertura eliminó la distribución de intensidad no deseada en el sistema óptico.

Resultados de la investigación

A continuación se muestran los sistemas específicos del organismo Drosophila (respiratorio, visual, nervioso, etc.) que ZFB resalta, mientras que el resto del tejido está completamente despigmentado.

Para no estirar el artículo, escondí todo bajo un spoiler.









Los científicos sin dudarlo llaman al mayor logro de su investigación la capacidad de crear un mapa tridimensional completo del sistema nervioso. Y si considera que este sistema pertenece a un organismo tan pequeño (Drosophila), este logro se vuelve aún más significativo.

La nueva técnica le permite determinar con precisión dónde y cómo se conectan estas u otras neuronas, tanto entre ellas como con el cerebro. Si se usara una sección transversal, esto no hubiera sido posible.



Como demostración de las capacidades de su método, los científicos nos muestran dos tipos de neuronas del sistema visual de Drosophila: DCN - neuronas de racimo dorsal y MCN - neuronas columnares cerebrales (columnas de corteza en la parte posterior del cerebro). En la región dorsal-lateral del cerebro, los grupos de DCN forman compuestos comisurales para excitar las neuronas sinápticas de la médula y el lóbulo en el lóbulo óptico. (imágenes arriba de a , c ).

En las imágenes byd , la pérdida de la conexión comisural en mutantes homocigotos de las células neuronales de Neuroglian es visible. Estos cambios en el sistema nervioso están asociados precisamente con el proceso de purificación de células FlyClear.



Para construir una reconstrucción tridimensional, se tomaron imágenes desde dos direcciones ortogonales, que luego se combinaron. El algoritmo basado en 3D FFT determina los detalles de una muestra que se ven más claros en una de las dos pilas de imágenes. Además, todo esto se combinó en una reconstrucción tridimensional.

Aquellos que deseen familiarizarse con el estudio con más detalle pueden leer el informe de los científicos y materiales adicionales .

Epílogo

Los científicos no se jactan en vano y están orgullosos de su trabajo, porque esto no ha sucedido antes. El método de estratificación por sección transversal fue dominante en el campo de la investigación sobre organismos. Pero este método, aunque tiene muchas ventajas, tiene enormes desventajas. En particular, las incisiones violan la integridad celular y tisular, lo que complica el proceso de reconstrucción de un sistema corporal particular.

Explorar un organismo con un sistema nervioso complejo, cuando cada detalle es importante, ahora será mucho más fácil. Los científicos podrán obtener más datos, lo que les permitirá describir con más detalle esos u otros procesos en el cuerpo.

Además, no olvide que Drosophila solo es experimental en este estudio, y no su base. Mejorar el nuevo método de escaneo también puede servir a la persona. Y no solo para estudiar el cuerpo y sus elementos constitutivos, sino también para diagnosticar enfermedades que pueden ocultarse en las primeras etapas donde los métodos de escaneo disponibles actualmente no pueden determinarlas.

La investigación abre muchas cosas nuevas: nuevas especies de animales, nuevas sustancias, procesos y fenómenos. Pero sin una investigación dirigida a crear herramientas de investigación, todo esto hubiera sido imposible.


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