Génie génétique des bactéries: comment obtenir les protéines dont nous avons besoin à partir des bactéries

Ainsi, dans deux articles précédents sur le génie génétique des bactéries ( une et deux fois ), nous avons trouvé comment collecter les gènes dont nous avons besoin, sous quelle forme ils peuvent être introduits dans la bactérie et comment exactement ils peuvent y être introduits. Supposons que nous ayons fait toutes ces manipulations afin de faire une biofactory pour la production de protéines. Alors maintenant, c'est la petite entreprise - obtenir notre protéine de la bactérie dans sa forme la plus pure.
Il existe de nombreuses méthodes pour résoudre ce problème, la plupart d'entre elles concernent la chromatographie. Découvrez comment ces méthodes fonctionnent sous le chat.

La phase stationnaire «capture» les molécules passant par leurs groupes (-OH).

Nous avons donc obtenu la souche dont nous avions besoin et augmenté la biomasse. Maintenant, nous devons en quelque sorte en retirer nos protéines.

Tout d'abord, nous prenons notre culture et la versons dans des bouteilles de centrifugeuse. Les bactéries sont des objets assez gros et lourds, par conséquent, pour les précipiter, des valeurs de surcharge monstrueuses ne sont pas nécessaires pendant la centrifugation: 10000g seront plus que suffisants pendant 20 minutes. En conséquence, nous obtenons un sédiment au fond des bouteilles et un liquide (on l'appelle surnageant). Nous déversons le liquide, car notre protéine se trouve dans les bactéries qui se trouvent dans les sédiments. Vous pouvez continuer selon les circonstances: soit travailler immédiatement avec le précipité obtenu, soit congeler et conserver jusqu'à ce qu'il soit nécessaire. Il peut être conservé très longtemps. La procédure à suivre pour travailler avec des boues ne dépend pas de si nous les avons stockées dans le congélateur ou non.

Disons qu'il est temps de travailler avec les sédiments. Et ensuite?

Tout d'abord, nous devons détruire les cellules pour que la protéine puisse sortir. Pour ce faire, utilisez les méthodes suivantes:

• Congélation-décongélation séquentielle. Ce n'est pas l'outil le plus efficace pour la destruction de la membrane cellulaire, mais il est sans danger pour les protéines, alors commencez souvent par plusieurs de ces cycles, puis passez à des méthodes plus efficaces;
  
• Traitement par ultrasons (sonication). La méthode est largement utilisée, elle est simple et efficace. L'échographie est généralement délivrée directement au volume d'eau à l'aide d'un «haut-parleur» allongé qui est inséré dans le fluide avec les cellules de sorte que l'extrémité du «haut-parleur» atteint presque le fond. C'est une méthode assez difficile. Il existe également une alternative plus douce - les ultrasons sont introduits dans le bain-marie dans lequel les tubes flottent.
  
  
  
  
  Un diplômé du MIT met en garde - surveillez attentivement vos sonateurs.
  
  Lors de la destruction ultrasonique de cellules, il est important de surveiller la température: l'eau se réchauffe rapidement sous l'influence des ultrasons, et nous n'avons pas du tout besoin de dénaturer notre protéine, et encore plus nous ne voulons pas la faire bouillir. Par conséquent, dans le premier cas (avec une «colonne allongée»), le tube à essai avec des cellules est inséré dans une tasse avec de la glace et de l'eau, et il devrait y avoir beaucoup de glace. Dans ce cas, l'eau agit comme une interface thermique entre la glace et le tube à essai refroidi par celle-ci. Dans le cas de «l'alternative douce», de la glace est ajoutée directement au bain-marie.
  
  
  Démonstration de traitement ultrasonore "dur". Faites attention au bruit terrible qui se tient près de l'installation, il est particulièrement bien entendu à 2h06 de cette vidéo. Quelqu'un est sauvé du mieux qu'il peut: quelqu'un essaie de sortir de la pièce pendant la durée de la sonication, quelqu'un porte un casque antibruit spécial.
  
  
  Démonstration d'un traitement par ultrasons "doux".
  
• Ajout d'agents de lyse au milieu. Il s'agit principalement de détergents, c'est-à-dire «soap» (en général, le mot «detergent» en anglais signifie «detergent»). Les détergents sont essentiellement liés aux lipides dans les membranes cellulaires. Une fois dans l'environnement avec les cellules, les détergents commencent à s'intégrer dans les membranes, ce qui entraîne leur destruction. Et nous en avons juste besoin. Parfois, du lysozyme est également ajouté - une enzyme qui détruit la paroi cellulaire bactérienne.
  
• Presse française. La suspension cellulaire est aspirée par la soupape d'admission dans le cylindre de travail, d'où elle est expulsée par une presse à travers une fente étroite. Les forces transversales résultant d'une chute de pression à la pression atmosphérique lorsque les cellules passent à travers l'espace conduisent à la destruction de la paroi cellulaire et de la membrane.

D'après ma propre expérience, je peux dire que la sonication en combinaison avec des détergents est généralement plus que suffisante.

Nous avons donc obtenu un lysat cellulaire - «soupe», composé de la protéine dont nous avons besoin et d'une énorme quantité de «déchets» (ADN chromosomique et plasmidique, morceaux de la paroi cellulaire, diverses protéines, etc.). Comment se débarrasser de tout ça?

La première question à laquelle il faut répondre est: "Sous quelle forme notre protéine existait-elle dans la cellule?" Il existe deux options principales:

• La protéine était soluble avant la lyse et, avec une probabilité très élevée, elle l'est restée après, ce qui signifie que nous ne pouvons pas la sédimenter par centrifugation. Mais nous pouvons précipiter les gros «déchets» laissés après la lyse: de cette façon, nous nous débarrasserons des morceaux de la paroi cellulaire, de l'ADN chromosomique et d'autres gros fragments. Le précipité est jeté et le surnageant est envoyé pour chromatographie;
  
• La protéine dans les conditions du cytoplasme bactérien était insoluble et elle a formé le soi-disant «Corps d'inclusion» conservés après lyse. Les corps d'inclusion sont des billes de protéines qui se forment si la protéine pendant la synthèse n'a pas le temps de se replier (c'est-à-dire de prendre sa forme soluble normale) avant qu'elle ne heurte une autre protéine similaire non repliée. Les protéines dépliées ont presque toujours des taches hydrophobes qui sortent, à l'aide desquelles elles se collent les unes aux autres. Après que les deux écureuils se soient «collés», ils n'ont plus assez de degrés de liberté pour terminer leur pliage. Puis un troisième, quatrième, cinquième nagent jusqu'à eux .... En conséquence, un granule de protéines est formé. Habituellement, cela se produit lorsque nous synthétisons des protéines eucaryotes dans des bactéries (comme je l'ai écrit plus tôt, la bactérie ne peut pas les plier). En conséquence, nous avons une masse de protéines avec une structure spatiale «médiocre». Mais chaque nuage a une doublure d'argent, car à la fin, des granules se forment, presque entièrement constitués de la protéine dont nous avons besoin!
  
  Puisque dans ce cas, notre protéine est insoluble, alors lorsqu'elle est centrifugée, elle, avec les "déchets", se trouve dans les sédiments. Nous jetons le surnageant, puis les corps dans les sédiments sont lavés de tout ce qui n'est pas nécessaire comme suit:
  
  1. Le tampon de lavage n ° 1 a été versé, dans lequel le "composant de déchets du sédiment n ° 1" a été dissous;
  2. Remuer le précipité jusqu'à consistance lisse et le placer sur un shaker (un appareil qui secoue);
  3. Le surnageant a été centrifugé et versé. En conséquence, ce qui a été dissous dans le tampon de lavage n ° 1 a été séparé du précipité;
  4. Le tampon de lavage n ° 2 a été versé, dans lequel le "composant de déchets du sédiment n ° 2" a été dissous;
  5. Eh bien et ainsi de suite. Un total d'environ 5 lavages est généralement nécessaire.
  
  Permettez-moi de vous rappeler une fois de plus que si nous avons affaire à des corps d'inclusion, nous avons affaire à une protéine non dépliée , ce qui signifie qu'elle n'est pas en mesure de remplir les fonctions qui y sont définies. Par conséquent, avant le nettoyage ultérieur, il se replie, c'est-à-dire qu'il est mis sous forme active. La méthode de repliement la plus courante comprend les étapes suivantes:
  
  1. Dissoudre les corps dans des conditions "non physiologiques". Typiquement, les corps se dissolvent bien à pH élevé (environ 12) en présence d'urée bipolaire. L'idée de cette méthode est qu'à pH élevé dans le milieu, il y a très peu de protons et que tous ceux qui pourraient s'en débarrasser le font facilement. Le proton est chargé positivement, ce qui signifie que tous les donneurs de protons reçoivent une charge négative, puis la loi de Coulomb fait tout - les protéines ayant une grande charge négative commencent à se repousser;
     
  2. Goutte à goutte, ajoutez le volume entier de la «solution protéique» du premier paragraphe à un volume beaucoup plus mélangé activement du tampon avec des conditions qui sont confortables pour la protéine. L'idée de cette étape est qu'à une faible concentration en protéines, il est beaucoup plus susceptible de se replier avant de rencontrer son homologue déplié. Typiquement, le transfert en gouttelettes d'une solution de protéines est effectué dans des volumes de tampon dépassant le volume de la solution elle-même d'au moins 10 fois.

Nous sommes donc prêts pour certains volumes de solutions de protéines dans un état plié. La procédure suivante est la même pour toutes les "conditions initiales" - nous filtrons nos solutions à travers des filtres avec une taille de pore de 100 à 450 nm (afin de ne pas obstruer les colonnes chromatographiques et le chromatographe lui-même), puis nous effectuons la chromatographie.

Types de chromatographie

Le principe de toute chromatographie est que les différents composants de la solution se déplacent dans la colonne à différentes vitesses, en conséquence, les composants qui sont passés "à l'entrée de la colonne" sortent à des moments différents.

Mais d'abord, rappelons une autre méthode - l'électrophorèse des protéines dans un gel.

Cette méthode permet la séparation des protéines en fonction de leurs masses. Pour ce faire, un tampon contenant du SDS et un colorant (généralement du bleu de bromphénol) est ajouté à l'échantillon. Dans le même temps, la densité du tampon est supérieure à la densité de l'eau, cela est fait de sorte que le mélange d'échantillon et de tampon soit plus facile à ajouter aux puits sur le gel. Le colorant est ajouté pour contrôler la procédure d'introduction de l'échantillon dans le puits, et il sert également d'indicateur qu'il est temps de terminer la phorèse: la peinture se déplace plus rapidement que la protéine, donc lorsqu'elle atteint la fin du gel, la phorèse est arrêtée. Ceci est très pratique, car nous ne voyons pas le mouvement de la protéine le long du gel.


Électrophorèse SDS-PAGE. Il vaut mieux lire et voir une fois que de lire cent fois. Un marqueur de poids moléculaire est appliqué au premier puits sur foresic dans la vidéo, et les échantillons étudiés sont appliqués aux puits restants.

Le SDS est un composant clé: ce détergent chargé négativement (surfactant) dénature les protéines, après quoi il les «entoure», et il s'avère que le nombre de molécules SDS adhérant à la protéine est directement proportionnel à sa masse. Il découle ensuite de la loi de Coulomb qu'en l'absence de résistance au mouvement, toutes les protéines entourées de molécules SDS auraient les mêmes accélérations dans le champ électrique (la force croît linéairement avec l'augmentation de la charge, mais la masse croît aussi linéairement avec la charge).


Schéma d'action du SDS détergent chargé négativement sur les protéines. D'abord, il le dénonce, puis «l'enveloppe». En conséquence, la protéine consiste en une coquille chargée négativement constituée de SDS, dont la charge est directement proportionnelle à la masse de la protéine.

Et ici PAAG (PAAG - gel de polyacrylamide) vient à notre secours. Au cours de la polymérisation, il forme un réseau de canaux approximativement du même diamètre, à travers lesquels, ceteris paribus, les petits objets se déplacent plus rapidement que les gros. De toute évidence, les protéines lourdes sont plus grandes que la lumière, donc les protéines légères se déplacent plus rapidement.

Après l'achèvement de la procédure d'électrophorèse, le gel est coloré. Plus précisément, les endroits où la protéine est située dans le gel sont tachés - des rayures bleues (ou noires, en fonction de quoi peindre) sont obtenues. Afin de comprendre à quelle masse correspond une bande ou une autre, vous devez la comparer à quelque chose, de sorte que le soi-disant gel est appliqué à chaque gel. Le "marqueur de poids moléculaire" est un mélange de composants avec des masses connues.


Un exemple de bandes de marqueur de poids moléculaire. Ce marqueur est également pratique en ce que ses deux bandes sont peintes dans une couleur individuelle: rouge (70 kilodaltons) et vert (10 kilodaltons). Cela aide l'expérimentateur à naviguer dans le marqueur lui-même. 1 dalton, c'est une unité de masse atomique, est défini comme 1⁄12 de la masse d'un atome de carbone au repos libre-12, qui est à l'état fondamental.

Il semblerait qu'un miracle, pas une méthode - les bandes ne se chevauchent pas, ce qui signifie que les protéines sont parfaitement divisées! Mais en fait, les scientifiques n'ont pas appris à réaliser l'électrophorèse des protéines à l'échelle industrielle et nous utilisons donc toujours la chromatographie sur colonne.


Un schéma approximatif de toute chromatographie. La colonne est un cylindre rempli de quelque chose. Ce «quelque chose» est appelé la «phase stationnaire» et la «phase mobile» est la solution dont nous devons séparer les composants. Les composants se déplacent à des vitesses différentes et sortent donc séparément de la colonne.

La plupart des techniques chromatographiques reposent sur le fait que les écureuils passant par s'accrochent au remplisseur de colonne fixe «avec un enthousiasme différent»: ceux qui «s'accrochent» souvent et se déplacent beaucoup plus lentement que tout le monde, et ceux qui ne «s'accrochent» à rien quittent rapidement la colonne. En conséquence, une partie substantielle du mélange quitte souvent la colonne sans «s'y accrocher» - ils sortent ensemble au tout début de la chromatographie (cette fraction est appelée «glissement», car ils ont glissé à travers la colonne sans «s'y accrocher»). Mais que faire de ceux qui sont «accrochés»?

Voyons d'abord ce qui se passe dans la colonne avec ceux qui «s'accrochent». Le «crochet» lui-même se produit parce qu'il y a quelque chose à la surface de la phase stationnaire qui est capable de «capturer» temporairement une protéine qui passe (sur la façon dont cela se produit, un peu plus bas). Autrement dit, la protéine «collante» passe un certain temps dans l'état associé à la phase solide, puis s'en détache (en raison de son propre mouvement thermique, des collisions, etc.), flotte, se lie à nouveau à la phase solide, se détache à nouveau, etc. jusqu'à ce qu'il quitte la colonne. Il est clair que plus elle se lie souvent à la phase stationnaire, plus elle se déplace lentement le long de la colonne.


Le principe de la chromatographie. Ce qui ne lie pas à la colonne (glissement) se déplace avec la vitesse de la phase mobile (ajustée en fonction de la taille). Les composants de liaison ont des vitesses différentes, ce qui conduit à leur séparation en sortie.

De manière générale, ce n'est que dans le cas de beaucoup de malchance dans le mélange que différents composants se déplaceront à la même vitesse, nous pouvons donc attendre jusqu'à ce qu'ils sortent de la colonne. Mais souvent, cela «attend juste» très longtemps, car les composants se déplacent lentement. Dans ce cas, ils doivent être «personnalisés» et la façon dont ils sont «personnalisés» dépend du type de colonne.

Enfin, examinons les méthodes chromatographiques elles-mêmes, qui conviennent à la production industrielle de blancs.

1. Chromatographie d'échange d'ions. L'idée de la méthode est que la phase stationnaire a une charge dans les conditions de la chromatographie. Si la charge est positive, alors ils parlent de "chromatographie d'échange d'anions", si elle est négative, alors "d'échange de cations".
   
   La logique du nom est simple, considérons-le en utilisant un échangeur d'anions comme exemple: les composants chargés négativement du mélange «collent» à la phase solide chargée positivement de la colonne. De plus, si nous suivons un groupe spécifique chargé positivement à la surface de la phase solide, alors l'un ou l'autre des composants chargés négativement «s'y collera» et se détachera. Ainsi, une sorte d'échange d'anions se produit entre les phases stationnaire et mobile, d'où le nom - «chromatographie d'échange d'anions».
   
   Évidemment, si nous voulons utiliser la chromatographie d'échange d'anions, nous devons alors effectuer la séparation du mélange dans des conditions dans lesquelles la phase solide est chargée positivement. De plus, nous avons le choix entre deux options pour le développement ultérieur des événements, en fonction de la charge de la protéine dans ces conditions: si "-", alors elle "s'assoira" sur la colonne, et si "+", elle sera en glissement.
   
   Comment accélérer la sortie des composants associés, c'est-à-dire comment effectuer une "élution"? Vous pouvez agir de deux manières:
   
   • Vous pouvez modifier la charge de la phase stationnaire et des composants liés en modifiant le pH de la phase mobile. Il est important d'effectuer le processus de changement du pH progressivement, puis les composants accéléreront leur mouvement, mais ils ne «tomberont» pas en même temps d'un coup;
     
   • Ajoutez d'autres anions à la colonne. En effet, la colonne a un nombre fini d'emplacements pour lesquels les anions peuvent s'accrocher et si nous occupons tous ces endroits avec quelque chose, alors les composants du mélange se déplaceront plus rapidement. Pour la chromatographie d'échange d'anions, l'addition d'anions chlore est typique. L'introduction d'anions concurrents devrait également être effectuée progressivement.
   
   La procédure pour la chromatographie d'échange de cations est généralement la même, seulement l'inverse.
   
   
   
   
   Chromatographie d'échange de cations avec élution due à un changement de pH de la phase mobile.
   1 - à pH = 2, il y a beaucoup de protons dans la phase mobile; par conséquent, tous les composants du mélange ont été captés dans le liquide, tout en recevant une charge positive;
   2 - à pH = 5, le nombre de protons dans la phase mobile a diminué et le composant "violet" n'agit plus comme un accepteur, mais comme un donneur de protons; par conséquent, à cette valeur de pH, la charge est négative et quitte la colonne. Le composant «vert» agit toujours comme un accepteur de protons et il conserve une charge positive à une valeur de pH donnée, ce qui signifie qu'il tient toujours la colonne;
   3 - à pH = 9 il y a très peu de protons dans la phase mobile, le composant "vert" devient également donneur de protons, acquiert une charge négative et quitte la colonne en dernier.
   
   En général, le choix du type d'échangeur d'ions et des conditions de séparation dépend de ce que nous voulons isoler et de ce qu'il y a d'autre dans notre mélange.
   
2. Une autre méthode de séparation est basée sur l'hydrophobicité (~ non-polarité) et l'hydrophilicité (~ polarité) de certaines substances. L'idée ici est exactement la même que dans le cas de l'échangeur d'ions: selon leurs propriétés physiques, les composants «se précipitent» entre les milieux hydrophobes et hydrophiles, certains s'attardent plus, d'autres moins.
   
   Tout d'abord, je vous rappelle que le non polaire se dissout en non polaire et polaire en polaire. Souvent, «hydrophobe» et «non polaire» sont une seule et même chose que «hydrophile» et «polaire», bien que dans le cas général ce ne soit pas le cas. L'éthanol est un exemple de solvant non polaire et l'eau est un exemple de polaire.
   
   
   
   
   L'ours polaire se plaint de se dissoudre dans l'eau, qui est un solvant polaire. Ceci n'est pas menacé par un ours brun «non polaire».
   
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Eh bien. Nous avons donc isolé notre protéine et maintenant elle peut être utilisée pour des études structurales ou fonctionnelles, comme réactif dans un laboratoire scientifique ou pour des analyses environnementales, à des fins médicales ou dans l'industrie.