Plus récemment, en 2016, le leadership incontesté sur le marché du séquençage génomique appartenait aux États-Unis. Plus précisément, la société américaine Illumina , qui a développé une gamme de séquenceurs fluorescents.
Fig. 1. Séquenceurs fluorescents Illumina
( Illumina Investor Presentation, 18 août 2017 )
L'amélioration de ces appareils et de la technologie fluorescente utilisée par eux a permis à la mi-2016 de réduire le coût du séquençage du génome humain à 1000 $.
La deuxième place en 2016 était occupée par la société américaine Thermo Fisher Scientific , qui développe une technologie de séquençage d'ADN semi-conducteur. Malgré leurs performances relativement modestes (jusqu'à 12 Go), leur séquenceur Ion S5 a concurrencé assez dignement les séquenceurs de bureau d' Illumina dans le créneau du séquençage ciblé (clinique).
Fig. 2. Séquenceur semi-conducteur Ion S5
En septembre 2017, BGI a annoncé le début de l'acceptation des demandes de séquençage du génome pour 600 $, ce qui a immédiatement placé la Chine en tête des courses génomiques. Cette percée a été rendue possible par la création de CNGB (China National GeneBank), un centre majeur avec 150 séquenceurs chinois fluorescents BGISEQ-500.
Fig. 3. Dans la salle informatique du CNGB
http://www.presstv.com/Detail/2016/09/22/485893/China-national-gene-bank
Certes, les performances d'un NovaSeq 6000 américain sont égales à celles de 50 ... 60 BGISEQ-500 chinois. Par conséquent, le plus grand centre de séquençage à ce jour peut être considéré comme la société chinoise Novogene , qui au début de cette année a immédiatement acquis 25 NovaSeq 6000. Leur productivité totale est d'environ un quart de million de génomes par an. Le chiffre est impressionnant, mais si 0,3 million de génomes sont séquencés chaque année (~ 0,05 million en CNGB plus ~ 0,25 million en Novogen ), alors 100 millions de génomes seront séquencés dans le cadre du programme China Precision Medicine lancé l'année dernière Initiative »(2016 ... 2030, 9,2 milliards de dollars) prendra plus de 300 ans. Et pour respecter les délais (jusqu'à fin 2030), les Chinois devront construire et équiper plusieurs dizaines de ces centres de séquenceurs.
Début 2017, les séquenceurs de pores miniION nanion MinION sont apparus en vente, et en mai - GridION X5 développé par Oxford Nanopore Technologies (ONT, UK). Le modèle le plus productif (PrometION) subit des tests bêta dans plusieurs centres de génomique et devrait être disponible dans les prochains mois.
Fig. 4. Séquenceurs nanopores ONT
La précision relativement faible du séquençage des nanopores (~ 90% pour une seule lecture) ne permet pas à ces appareils de rivaliser avec les séquenceurs fluorescents (précision ~ 99,9% pour une seule lecture) pour déterminer les mutations ponctuelles (polymorphismes de nucléotides simples, SNP), mais la longue longueur de lecture (> 10 000 pb) les rend indispensables pour cartographier les polymorphismes tels que les variations de nombre de copies (CNV). De plus, les séquenceurs de nanopores font un bon travail pour identifier les virus et les bactéries, évaluer leur résistance aux médicaments, l'analyse des transcriptomes, le typage HLA, établir la paternité et de nombreuses autres tâches de séquençage ciblées, ce qui leur permet de concurrencer avec succès ces niches de marché NGS (Next Generation Sequencing) .
L'intervention dans la race génomique de la Chine et du Royaume-Uni a intensifié la concurrence. Cela n'a pas encore affecté les prix du séquençage ciblé, mais le coût du séquençage du génome humain au cours de la dernière année a diminué de 40% (de 1000 $ à 600 $).
La Russie devrait-elle participer aux courses génomiques, ou est-il plus facile d'attendre l'apparition de séquenceurs chinois, anglais ou américains bon marché? Mais une telle attente peut être traînée. Et c'est une honte pour l'État. Cela détermine la pertinence de considérer la possibilité de développer un séquenceur domestique et sa fourniture en consommables et réactifs.
L'objectif principal d'un tel développement est de «rattraper et dépasser l'Amérique» (ainsi que la Chine, la Grande-Bretagne, la Corée du Sud, l'Australie, l'Arabie saoudite, etc.). Ou du moins, rattrapez-vous. Ou ne rattrapez même pas, mais essayez simplement de rendre le séquençage en Russie plus accessible. Tout d'abord, réaliser une substitution à l'importation d'au moins une partie des consommables et des réactifs. Il sera plus difficile de copier des séquenceurs. Mais vous ne pouvez pas simplement copier des développements étrangers, mais essayer de les améliorer. Et si vous ne vous améliorez pas, réduisez au moins le coût. La tâche n'est pas trop ambitieuse, mais réalisable.
L'un de ces projets a été développé par quatre instituts de la branche sibérienne de l'Académie russe des sciences (2012 ... 2014), qui ont tenté en vain de maîtriser la technologie de séquençage SMRT ( Pacific Bioscience , USA). On peut également citer deux tentatives de développement d'une technologie de séquençage monomoléculaire basée sur la spectroscopie Raman - à Chernogolovka ( InSpektr LLC , 2010 ... 2012) et Zelenograd ( Nano Vizhin LLC , 2013 ... 2014). - Et sur le projet ZeSenograd RuSeq, visant à améliorer la technologie tSMS ( Helicos , USA).
Il est clair que lors du choix des technologies NGS à maîtriser (copiées / améliorées / "déchiquetées"), les perspectives de leur développement doivent être prises en compte. Et, compte tenu des possibilités extrêmement limitées, d'évaluer ces perspectives uniquement pour les trois technologies les plus avancées - fluorescentes, semi-conductrices et nanopores.
Technologie fluorescente
Dans ce cas, les séquenceurs sont des microscopes à épifluorescence à balayage de précision équipés d'un système d'alimentation en réactifs pour les Flow Cell. Une caractéristique des derniers modèles est l'agencement ordonné de grappes d'ADN submicroniques ( Illumina , NovaSeq 6000) ou de nanobilles d'ADN ( BGI , BGISEQ-500) dans des cellules à écoulement jetables.
Ces microscopes en Russie devront être assemblés principalement à partir de composants importés, ils ne coûteront donc pas moins cher que leurs homologues chinois. Certes, ces analogues ne sont pas encore vendus, mais dans 2 ... 3 ans, très probablement, ils seront disponibles chez nous. Par conséquent, il vaut mieux se concentrer non pas sur le développement de séquenceurs fluorescents, mais sur le développement de la production de leurs composants et réactifs consommables - les Flow Cell et les nucléotides marqués. À moins, bien sûr, que les technologies fluorescentes ne soient remplacées dans plusieurs années par des technologies luminescentes. De plus, un tel remplacement pourrait débuter en 2018.
La luminescence a déjà été utilisée dans NGS, une technologie de pyroséquençage qui a permis à 454 Life Sciences de lire le premier génome humain individuel (Project Jim, 2005 ... 2007). Cette technologie, basée sur l'enregistrement bioluminescent (luciférase) de la formation de pyrophosphates, est désormais dépassée. Mais la luminescence est plus facile à déterminer que la fluorescence. Illumina développe donc depuis longtemps une technologie de séquençage luminescent (le projet «Firefly»).
Un séquenceur luminescent peut ne pas être pire, mais beaucoup moins cher que les séquenceurs de bureau fluorescents MiniSeq et MiSeq, c'est pourquoi son développement progresse très lentement. Cependant, récemment au salon ASHG 2017 (17 ... 21.10.2017), le séquenceur Firefly fini a été présenté, ainsi que les cellules à écoulement (puces) et les cartouches de réactifs nécessaires à son fonctionnement.
Fig. 5. Séquenceur fluorescent Illumina Firefly
https://twitter.com/illumina
Le principal problème dans le cas de l'orientation vers la technologie luminescente ne sera pas tant le développement du dispositif que la maîtrise de la synthèse des réactifs consommables nécessaires à son fonctionnement - les désoxynucléosides triphosphates (dNTP) avec des marqueurs capables de générer des photons. De plus, ces marqueurs doivent être connectés à des nucléosides avec des lieurs facilement clivables contenant des groupes azidométhyle.
Une caractéristique importante des dérivés azidométhyle des DNTF, dont la synthèse a été développée par des scientifiques russes (IBCh RAS) au début des années 90 du siècle dernier, est leur stabilité relativement élevée, combinée à la simplicité et à la vitesse de libération lors du traitement de grappes d'ADN (ou nanobilles d'ADN) avec une solution Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP). C'est la complexité de la synthèse de ces réactifs qui protégeait jusqu'à récemment Illumina de ses concurrents, et le développement de leur production a permis à la Chine de rattraper et de dépasser l'Amérique.
Les chimistes russes sont-ils capables de maîtriser la synthèse de tels réactifs? A en juger par les liens dans les brevets d'Illumina, cela ne faisait aucun doute dans les années 90 du siècle dernier. Et maintenant en Russie, il y a 3 ... 4 groupes de chimistes capables de faire face à une telle tâche (IHBFM SB RAS, Synthol LLC, IBCh RAS, IMB RAS).
Technologie des semi-conducteurs
Thermo Fisher Scientific a investi des milliards de dollars dans l'acquisition de la technologie de séquençage des semi-conducteurs. L'intensification de la concurrence nécessite désormais une forte baisse des prix et il est peu probable qu'elle soit en mesure de restituer les milliards dépensés, notamment avec un profit. Les développeurs tiers ne se soucient pas de ces problèmes, donc pour eux, la technologie des semi-conducteurs reste attrayante. Surtout si vous pouvez utiliser des puces de capteur de pH prêtes à l'emploi, dont le développement a été dépensé des millions de dollars.
Fig. 6. Puces de capteur de pH de séquenceur S5 Semiconductor
Le coût de ces puces est surestimé, au moins d'un ordre de grandeur. Et vous ne pouvez les utiliser (selon les développeurs) qu'une seule fois. Néanmoins, certains artisans ont réussi à les utiliser plus de dix fois, et ce n'est clairement pas la limite. Par conséquent, la tâche principale pour améliorer (réduire le coût) de la technologie de séquençage des semi-conducteurs est de maîtriser la régénération des puces de capteur de pH utilisées.
Le prototype du dispositif nécessaire à une telle régénération a déjà été développé. Plus précisément, un système électronique a été développé qui lit les informations des puces de capteur de pH et permet de contrôler leur qualité.
Fig. 7. Séquenceur semi-conducteur fait maison
https://www.youtube.com/watch?v=eojg02AUAxw
Si vous augmentez la vitesse et la résolution de l'ADC, un tel lecteur peut être utilisé comme sous-système électronique du séquenceur semi-conducteur domestique. Certes, il devra toujours être équipé d'un système d'alimentation en réactifs. Et maîtrisez la production de ces mêmes réactifs. Avec un fort désir (et un bon financement), des problèmes particuliers avec cela ne sont pas attendus.
Le problème est que tous ces développements et leurs modifications prendront 2 ... 3 ans, et pendant ce temps, beaucoup de choses peuvent changer. Par exemple, la précision et la productivité du séquençage des nanopores peuvent être améliorées. En conséquence, tous les efforts des concurrents "semi-conducteurs" seront vains.
Technologie Nanopore
Le premier séquenceur de nanopores MinION est similaire à la première crêpe - il est déjà «comestible», mais les prochains devraient être bien meilleurs. Sa précision de lecture n'est plus que satisfaisante, et même pas pour toutes les applications. Quant à la productivité, elle n'est clairement pas suffisante pour le séquençage des génomes, car chaque génome doit dépenser au moins cinq cellules ponctuelles coûtant de 500 $ à 900 $ (selon leur quantité dans la commande).
Les puces sont intégrées dans les cellules MinION, amplifiant et numérisant les signaux (courants picoampères) de 512 nanopores. GridION X5 fonctionne simultanément avec cinq des mêmes cellules, mais dans les cellules de PromethION, le nombre de nanopores analysés est multiplié par 6 (jusqu'à trois mille). Cela permettra au génome humain d'être séquencé dans une cellule. Certes, avec une faible qualité, mais avec des lectures longues, ce qui facilite leur assemblage précis. Et il complète bien les lectures courtes (2x150 ou 2x100), mais précises (> Q30) obtenues par les séquenceurs fluorescents. Par conséquent, le séquençage des nanopores à PomethION peut compléter la fluorescence, mais ne peut pas rivaliser avec elle. Bien que si les cellules de nouvelle génération ne contiennent pas des milliers, mais des dizaines ou des centaines de milliers de nanopores, leur utilisation augmentera la fréquence de lecture de l'ADN, améliorera la qualité des données et permettra aux séquenceurs de nanopores génomiques de concurrencer avec succès sur le marché NGS avec les séquenceurs fluorescents.
Pour la plupart des tâches de séquençage ciblé, les performances de MinION (5 ... 10 Go) sont clairement excessives. Par conséquent, ONT prévoit de lancer MinION Dx (ou FLONGLE), une modification MinION avec un adaptateur pour 128 ou 256 cellules de pore.
Fig. 8. Séquenceur FLONGLE
Les cellules jetables pour FLONGLE peuvent être beaucoup moins chères, car leurs composants électroniques sont placés dans un adaptateur adaptable réutilisable, avec lequel ils sont reliés par un plot de contact de type LGA (Land Greed Array).
Un autre séquenceur nanopore compact (SmidgION), connecté à un smartphone (iPhone 7 ... X), devrait apparaître en vente dans les prochains mois.
Fig. 9. Le premier séquenceur "gadget" SmidgION
Le séquençage de nanopores bon marché et abordable peut changer l'ensemble du marché NGS (et le monde en même temps). Mais cette capacité ne se manifestera pleinement qu'après l'apparition de dignes concurrents. L'un de ces concurrents pourrait être Roche Sequencing , qui développe sa propre technologie de séquençage de nanopores depuis 2014. A en juger par certaines publications et messages sur Internet, d'autres concurrents pourraient apparaître prochainement.
Ce serait bien d'avoir des concurrents similaires en Russie aussi, mais le développement de séquenceurs, en particulier ceux à nanopores, n'était pas inclus dans la liste des «Orientations prioritaires pour le développement de la science, de la technologie et de la technologie dans la Fédération de Russie», approuvée par décret du président de la Fédération de Russie n ° 899 du 7 juillet 2011. Par conséquent, nous ne pouvons qu'espérer que les geeks développent des séquenceurs semi-conducteurs dans leurs propres cuisines ou des microscopes électroniques dans les garages personnels . Il ne sera pas possible de se passer de pirates qui peuvent pirater le logiciel MinION. Le fait est que ce séquenceur ne peut fonctionner que si vous avez une connexion Internet. Et chaque lancement autonome doit être coordonné avec les développeurs. Mais il y a des "ennuis" plus étranges. Par exemple:
• Chaque appareil et chaque Flow Cell est lié à un utilisateur spécifique, derrière lequel se trouve l'adresse réelle du laboratoire où il travaille et mène ses recherches. Dans le même temps, Oxford Nanopore Technologies peut obtenir des informations sur l'emplacement de chaque appareil.
• Politique de sanctions: Oxford Nanopore Technologies examine chaque organisation et les nouveaux utilisateurs finaux avant de livrer des produits.
• Afin d'éviter d'être sur la liste d'expédition, il est interdit aux laboratoires de transférer des produits Oxford Nanopore Technologies à des tiers.
Fait intéressant, conformément à la «Liste des laboratoires de navigation interdite» susmentionnée, l' ONT a récemment refusé de vendre MinION à des organisations «paramilitaires» telles que l'Université d'État de Moscou et l'Université d'État de Saint-Pétersbourg.
À cet égard, la première priorité pour la Russie dans le domaine du séquençage des nanopores est de pirater le logiciel utilisé par le séquenceur MinION.
La tâche suivante est l'ingénierie inverse des cellules de cet appareil. Et enfin - le développement de la formation de membranes lipidiques bicouches avec des canaux ioniques intégrés adaptés au séquençage de l'ADN des nanopores. Il vaut mieux chercher des biohackers (biophysiciens, biologistes moléculaires, ingénieurs génétiques, etc.) pour un tel travail ailleurs, mais ici, à Geektimes, je voudrais discuter des problèmes de piratage de logiciels et de rétro-ingénierie avec des hackers et des geeks qui connaissent bien l'électronique.
Je serais reconnaissant pour toutes questions, commentaires et suggestions.
Sincèrement vôtre, genseq