En général, nous avons escaladé les Philippines et recherché des bactéries rusées. Ensuite, nous sommes allés en Islande avec des chimistes, et ils ont parlé des expéditions de biologistes dans les montagnes pour les bactéries thermophiles (qui vivent près des sources chaudes) - et il s'est avéré que toute cette histoire était nécessaire pour la réaction en chaîne de la polymérase. Il est devenu extrêmement intéressant pour moi quelle relation le laboratoire a avec les tests sanguins à la source géothermique, et maintenant je vais vous raconter cette histoire passionnante.
Cela signifie que hier à Vladivostok, Rospotrebnadzor et l'Université fédérale d'Extrême-Orient ont ouvert un centre de formation PCR. J'y suis allé avec des journalistes et j'ai trouvé des scientifiques fous normaux qui expliquaient tout sur les doigts. Parce que c'est exactement ce qu'ils feront là-bas - pour enseigner le vietnamien et le chinois. Fondamentalement - apprenez à faire face aux bio-menaces.
Alors, qu'est-ce que la PCR?
C'est une histoire sur la façon de fabriquer plusieurs millions d'exactement les mêmes à partir d'une seule molécule d'ADN.
La base est une réaction en trois étapes: détordre l'ADN en hélices séparées, puis rechercher et marquer le début et la fin des sites souhaités, puis compléter les molécules marquées en utilisant la polymérase pour terminer. Autrement dit, c'est un tel simulateur de réplication de l'ADN dans notre corps, uniquement fait in vitro. Et extrêmement rapide.
Autrement dit, nous coupons tout l'ADN en moitiés, nous ne trouvons que les moitiés du pathogène, les marquons, puis la polymérase se construit pour les paires marquées. Nous répétons. Nous répétons.
La réaction moderne double la quantité d'ADN dans le ballon toutes les 40 secondes. Plus précisément, l'efficacité du cycle est légèrement inférieure - de 78% à 99%, car tout n'est pas et n'est pas toujours lié dans le monde réel.
Pourquoi est-ce nécessaire?
Si un agent pathogène flotte dans votre sang, vous pouvez créer une réaction spécialement pour lui, qui amplifiera (augmentera la quantité) de son ADN. À un moment donné, il y en aura tellement dans le brassage que vous pourrez le remarquer. Et ici, le robot crie: "Ouais, je l'ai!", Et le résultat sera "positif".
En entrée, nous n'avons besoin que de 50 molécules par millilitre dans le cas général. À titre de comparaison, le virus de la grippe n'est même pas dans le sang, mais dans la salive du patient avec les premiers symptômes - environ 10 000 pièces par millilitre.
Pourquoi est-ce toujours nécessaire?
Vous pouvez littéralement acheter un couple d'ADN de la momie de la peau de pharaon, de mammouth ou de tigre et le séquencer avec le génome. Autrement dit, il est vraiment possible de l'envisager complètement, car à partir d'une quantité négligeable de matériel pour la recherche, vous obtiendrez beaucoup de molécules d'ADN. D'où l'application en médecine légale - vous pouvez déterminer lequel des rois décédés à qui était un fils. Ou par une paire de molécules de salive sur les lieux du crime pour retrouver le coupable (directement Gattaka). Ou encore plus cool - vous pouvez répliquer des molécules avec des changements et vous obtenez une mutagenèse contrôlée. Mais ce dernier est difficile.
Et la PCR est la même réaction qui change le comportement social de la société. Parce qu'à l'aide de cela, la paternité est déterminée - vous ne pouvez sélectionner que différentes sections d'ADN et évaluer où et ce qui est différent (et combien), c'est-à-dire rechercher des parents proches. Eh bien, ou simplement séquencer et évaluer les différences.
Mais nous parlons ensuite du diagnostic des infections virales et bactériennes - c'est l'utilisation la plus répandue. Et ici, ils lui enseignent à Vladivostok.
Comment est la PCR en général?
Nous prenons du matériel, comme du sang ou autre chose. Nous préparons soigneusement le médicament (généralement 1/3 du matériel est prélevé, de sorte qu'en cas d'erreurs dans l'analyse, deux doses supplémentaires restent dans les archives jusqu'à la fin de l'étude). Le médicament est mélangé avec un système de test. Dans une fiole fermée, nous plaçons cette "soupe" dans le dispositif pour effectuer la réaction.
Ensuite, les cycles de déroulement de l'ADN, la fixation des amorces et l'alignement des molécules complètes à l'aide de la polymérase commencent. Les méthodes modernes de PCR en temps réel suggèrent que les étiquettes souhaitées s'accumulent et brillent. C'est génial car vous n'avez pas besoin d'ouvrir le tube pour réagir à l'isolement des séquences d'ADN souhaitées. Lorsque l'éclat peut être enregistré, il est décidé que les déformations souhaitées dans les matériaux étaient.
Quelques cycles supplémentaires vous permettent d'évaluer le degré de changement de signal et de faire l'hypothèse du nombre initial de molécules d'ADN dans le matériau, c'est-à-dire avec une précision suffisante pour déterminer la concentration de l'agent pathogène.
Comment l'amorce sait-elle à quoi s'accrocher?
Une amorce est une merde qui colle à ce qui correspond à son code nucléotidique. Si vous avez besoin du virus de la rage, vous devez le séquencer avec un génome (plus précisément, nous sommes intéressés par le début et la fin de l'ADN) et enregistrer les endroits des deux côtés de la molécule où les chaînes nucléotidiques sont uniques. Et faites-leur des amorces. Les amorces s'attachent aux moitiés de l'ADN et la polymérase commencera à fonctionner par le haut.
Alors rien ne s'accroche à l'ADN des cellules sanguines, seulement à la rage.
Les apprêts antirabiques s'accrochent uniquement à la rage. Pour diagnostiquer la rage et la grippe de votre vache, vous aurez besoin de deux doses de sang et de deux réactions différentes.
Maintenant, la partie amusante. Nous n'avons pas besoin du début et de la fin exacts de la molécule d'ADN pour le diagnostic. Nous avons juste besoin de beaucoup de sites reconnaissables. Autrement dit, sur le génome complet, par exemple, la grippe aviaire, deux fragments uniques doivent être distingués - le début de la copie et la fin de la copie. De sorte qu'entre eux, il y a quelque chose qui peut être identifié sans ambiguïté comme la grippe aviaire sans déclencheurs faux positifs et faux négatifs.
De plus, les mathématiques entrent en jeu - il est nécessaire de distinguer les endroits propres au génome, et de sorte qu'ils soient très courts, idéalement de 15 à 30 nucléotides. Et pour qu'entre eux c'est la bonne chose. Deux amorces donnent quelque chose comme un hachage d'une molécule d'ADN, c'est-à-dire qu'elles permettent de la décrire dans 30 à 60 nucléotides.
Dans ces sites minimums suffisants pour la reconnaissance et les amorces sont attachées. S'ils s'accrochent à autre chose - c'était une mauvaise cible et la précision baisse.
Alors qu'est-ce que les sources chaudes ont à voir avec ça?
Le fait est que la réaction se produit à haute température, sinon l'ADN ne se dénature pas. La polymérase à cette température se décompose généralement. Habituellement - car c'est spécifiquement avec les bactéries thermophiles qu'elle s'inquiète calmement. Par conséquent, il y a eu des expéditions au Kamtchatka au siècle dernier, où les géologues cherchaient des moyens pour la médecine moléculaire, tirant sur les ours. Et en Europe, ils ont conduit en Islande.
Ce qui est drôle, c'est qu'en 1976 et en 1980, il y avait des publications sur la polymérase (la nôtre et américaine), mais cela semblait à tout le monde comme un fait drôle, et ils n'ont pas trouvé d'application pratique.
Maintenant. Il s'avère que la Taq polymérase de Thremus aquaticus fonctionne selon un protocole comme UDP, c'est-à-dire sans correction d'erreur. Généralement. Rassemble ce qui se passe - et partez seul. Mais vite.
Les polymérases Pfu et Pwo ont été isolées des archées - elles fonctionnent avec une correction d'erreur, c'est-à-dire qu'elles ne donnent pas de mutations dans le processus de réplication (d'accord, elles ne le font presque pas), mais elles agissent beaucoup plus lentement.
Auparavant, les stocks de cette soif étaient prélevés directement à partir de sources, maintenant la polymérase est élevée dans des laboratoires. Et ils font un mélange délicat de Pfu, Pwo et Taq - il se révèle rapide et relativement correctement.
À quoi ça ressemble dans le monde réel
Dans le monde réel, vous avez une boîte de systèmes de test avec l'inscription intrigante «syphilis», par exemple. Ou la grippe. À l'intérieur d'un système de test - tous les composants de la PCR, à l'exception de la matrice d'ADN, c'est-à-dire le sang du patient. Ou un autre morceau de celui-ci où l'agent pathogène est recherché.
Ensuite, vous devez mélanger le sang et le système de test, chauffer et refroidir plusieurs fois sous pression, et le catalyseur, les amorces, la polymérase et les composants auxiliaires feront tout eux-mêmes. Le résultat est un tube à essai avec 10 dans la douzième molécule d'ADN par millilitre.
Peut-on le faire dans la cuisine?
En théorie. L'appareil lui-même est très simple, toute la haute technologie du système de test - et un petit logiciel qui enregistre le changement du signal lumineux de l'étiquette. Il faut encore une précision de température de 0,1 degrés et des programmes pour son changement. Plus un photocapteur. Autrement dit, le fer n'est pas très complexe. Par conséquent, il y a tellement de ces laboratoires - ils sont vraiment bon marché à déployer.
Mais dans la cuisine, ça ne marchera pas, car la pire histoire est la contamination de l'échantillon (pollution). Les protocoles de pureté sont ce qui est enseigné plus que les réactions elles-mêmes. Si l'un des tubes résultants contenant de l'ADN pathogène se casse en laboratoire, tout sera recouvert d'une couche uniforme de faux positifs. Autrement dit, toutes les analyses actuelles - immédiatement par la forêt, puis un long nettoyage, vérification, puis récupération du sang archivé et à nouveau le lancement de la ligne.
Eh bien, ceci, je vous le rappelle, que l'ADN de l'agent pathogène et l'agent pathogène lui-même sont deux choses différentes, comme le code source et le code compilé. Et le danger que vous cassiez un tube à essai avec 10 dans le douzième ADN du pathogène de la tuberculose équivaut à peu près à disperser un paquet de feuilles du code source pour lancer une ogive nucléaire sur le sol.
4 à 7% des résultats peuvent être faussement positifs en raison d'un travail bâclé et des caractéristiques du monde réel. Par conséquent, une vérification approfondie de la fiabilité du résultat est effectuée, en particulier, à l'aide de méthodes mathématiques.
Avec les matériaux de PCR conventionnels, un tube à essai avec de l'eau est soumis. Si quelque chose commence à s'y amplifier, le technicien se déchirera les mains sur les amygdales.
Ce n'est pas un coffre-fort, c'est une passerelle pour transférer du matériel au laboratoire. Le personnel est transféré au laboratoire dans un endroit propre après une douche, changer de vêtements et quelques procédures dégradantes de dignité humaine.Comment pouvez-vous comprendre que quelque chose ne va pas avec la réaction?
Par la nature de son développement. La réaction habituelle commence lentement, puis la phase de croissance exponentielle, puis dans le domaine des derniers cycles - sortie vers le plateau. La quantité d'ADN n'augmente pas avec les nouveaux cycles pour des dizaines de raisons, de l'épuisement des amorces à l'achèvement de l'une des ressources, les pyrophosphates s'accumulent. De plus, des moitiés d'ADN qui n'ont pas réagi avant de nager dans la soupe et de grimper les unes aux autres pour un câlin. En conséquence, vous pouvez identifier des artefacts et un déroulement atypique de la réaction - cela fait déjà un logiciel pour l'exploration de petites données. National, gratuit, régulièrement mis à jour, mais pas open source.
Et pourquoi avez-vous besoin d'augmenter la quantité d'ADN dans le médicament, si tout ce dont vous avez besoin est d'améliorer les méthodes de détection?
Il existe une telle voie de développement. Les méthodes physicochimiques sont en cours d'amélioration, mais jusqu'à présent insuffisantes. La dernière expérience - ils ont prélevé du plasma sanguin, centrifugé, des virus "lourds" sont tombés au fond du tube. Ensuite, ils ont été frits avec un spectrographe de masse au laser. Nifiga. Il fonctionne avec des colonies de bactéries (ils le font déjà depuis longtemps dans les laboratoires de Moscou), mais il ne fonctionne pas avec les virus. Et la colonie doit encore être agrandie. Par conséquent, jusqu'à présent (et, semble-t-il, les dix prochaines années), la PCR sera la chose la plus rapide à analyser.
Soit dit en passant, une analyse complète est effectuée en environ 45 minutes (avec la préparation du matériel), soit une demi-journée de
cito ou 4 jours si le laboratoire est dans la ville et vous êtes dans le village.
Pour certaines maladies infectieuses, la concentration du virus est extrêmement faible. Par exemple, il y a eu un cas d'encéphalite - le clinicien a vu des symptômes focaux (dommages au système nerveux central), a pris du sang - même la PCR ne montre toujours rien, et les anticorps sont déjà déployés. Autrement dit, la PCR donnerait un résultat plus tard que l'analyse des anticorps, et la spectrographie de masse - même plus tard, elle est toujours de plusieurs ordres de grandeur moins précise que la PCR.
Autrement dit, un seul génome spécifique est amplifié?
Dans le cas habituel, oui. On trouve la souche la plus avancée de la maladie qui est pertinente pour la région et les amorces ciblent son ADN. Mais c'est une situation légèrement utopique, car en même temps, vous devez rechercher six morceaux de souches différentes à la fois. Pour ce faire, différentes amorces sont ajoutées à l'ensemble, plus un certain nombre de modifications sont apportées. Naturellement, le système de test est plus cher. Ou vous devez effectuer plusieurs réactions pour différents agents pathogènes.
Puis-je multiplier l'ARN?
Oui, il vous suffit d'en faire de l'ADN. La réaction est plus complexe, mais intéressante en ce qu'elle vous permet de séparer les cellules mortes des cellules vivantes. L'ADN est incroyablement fort, donc il peut même être décollé d'un mammouth. Si le virus a déjà été tué, l'ADN de ses échantillons morts «brillera» pendant encore 3 semaines. Et l'ARN s'effondrera beaucoup plus rapidement. Par conséquent, les méthodes NASBA (recherche de virus à ARN, par exemple) sont beaucoup plus précises dans certains cas. Mais beaucoup plus cher.
Quelques belles choses
Toute l'histoire de la mise en œuvre de la PCR après l'invention de la théorie est un problème physique et chimique directement délicat. Par exemple, des sections inconnues d'ADN peuvent être amplifiées. Pour ce faire, la molécule est coupée dans une zone connue, puis les restes sont collés ensemble. Certains se retournent pour former des molécules avec un code connu au début et à la fin. Les amorces s'accrochent - et sur celles où il y a un début et une fin, et pas seulement un marqueur, l'amplification est effectuée.
Une histoire très drôle avec comment éviter les étapes de réaction inutiles lors du chauffage du tube. Le fait est que la première partie de la réaction se déroule à haute température, mais pendant que le tube à essai se réchauffe, vous pouvez accidentellement repartir du mauvais rythme - cela augmentera considérablement le bruit et la probabilité d'erreur. Par conséquent, les options avec le fait que l'un des réactifs du système est placé dans une capsule de cire (il ne fond qu'après avoir traversé le point souhaité et libère le composant à temps) sont devenues l'option lorsqu'une substance est ajoutée à la solution qui bloque la réaction, mais se décompose à haute température.
Il y a une protection contre la pollution - les molécules à l'amplification peuvent être marquées d'une certaine manière, puis au début de la réaction, détruisez toutes celles marquées de cette façon. Autrement dit, si quelque chose d'un tube a rampé dans un autre, il se remplira automatiquement pour les principales réactions.
La fluorescence est également cool: une substance est introduite dans les réactifs, qui est détruite à la suite de réactions avec l'ADN. Autrement dit, plus l'ADN est formé, plus les molécules de cette substance sont brisées. Le tout ne brille pas, mais en morceaux ça commence. Et plus les molécules d'ADN réagissent pendant la réplication, plus le tube brille.
Étant donné que la complexité des systèmes de test augmente, les astuces de vie et les solutions élégantes sont la mer.
Pourquoi les centres de formation PCR dans les universités?
Parce que c'est toujours l'histoire principale du diagnostic des maladies, et pas nécessairement chez l'homme. Ici, en Extrême-Orient, par exemple, l'accent peut être mis sur les phytovirus. Il y a un virus binaire dans les bacs de la mère patrie avec des épices de riz (plus précisément, deux virus bien assortis) qui peuvent prendre et mettre toute la récolte à travers l'Asie pour la distribution. Naturellement, une telle chose n'est pas seulement la nôtre - et elle ne sera pas nécessairement libérée par malveillance, elle peut se développer selon l'idiotie ou simplement dans un foyer naturel. Tout comme l'encéphalite japonaise à Primorye, des foyers saisonniers de moustiques apparaissent constamment ici. Et sa mortalité est de 60%.
L'adversaire présumé a également des virus chez les animaux et les humains.
Ainsi, les spécialistes de la PCR représentent la biosécurité du pays. Ils surveillent les infections, attrapent tous les passagers dans l'avion, où certaines personnes toussaient, etc. Michael, par exemple, a volé sur une ebola, sur la grippe aviaire et bien plus encore. Il a séquencé le génome complet de la seule copie vivante du virus de la rage rabique au monde.
Mikhail Shchelkanov, professeur, FEFU, chef du Centre fédéral de recherche en virologie pour la biodiversité, section Extrême-OrientAvec un ours en général, une histoire géniale. L'ours a soulevé 5 chiens puis a attaqué la grand-mère. Il lui tourna les poumons et retira le cuir chevelu, en plus de baver partout et couvert de sang. Les chasseurs ont décidé au sujet de la bête que c'était une sorte de mauvais ours. Et ils ont donné ses restes à des scientifiques pour des expériences.
Voici plus de détails.
Mikhail est également un fan des otaries à fourrure, car il aime les îles avec des rookeries. Ils transmettent les virus et les parasites extrêmement rapidement à l'ensemble de la population. Ils ont trouvé chez les chats dans les narines un pou frais avec des bactéries non moins fraîches. Lorsqu'un phoque plonge, il ferme ses narines. Le pou à l'intérieur est chaleureux et charmant.
Outre la prévention des risques biotechnologiques, la deuxième histoire est la formation de spécialistes étrangers. Il y a deux choses importantes: premièrement, ils étudient nos systèmes de test (et ensuite ils seront plus susceptibles de les acheter), et c'est important pour l'exportation - nous sommes leaders dans la CEI (environ 25 millions de réactions par an), mais pas dans le monde . Deuxièmement, l'uniformité de l'expérience permet la même surveillance par des protocoles communs, c'est-à-dire, puis changez les bases de données et l'expérience. Les bases, bien sûr, sont plus importantes. Cela signifie une réponse beaucoup plus cohérente aux épidémies possibles.
À Vladivostok, l'ouverture officielle n'a pas coïncidé avec l'ouverture technique - un groupe de médecins vietnamiens terminent leurs dernières leçons. Deux connaissent le russe, les autres apprennent à travers eux. Il y a un cours entièrement en anglais. Le même centre travaille à Novossibirsk pour les médecins russes et les médecins des pays de la CEI, et des spécialistes y sont diplômés depuis un an.Nous faisons également tout pour nos systèmes de test en Russie, et en biologie moléculaire pratique sont parmi les plus puissants du monde (en théorie, non, mais nous mettons tout en œuvre rapidement et techniquement). Par conséquent, l'éducation contribuera à élargir ce marché pour nous. Au total, 3881 spécialistes ont été formés dans de tels centres (petits groupes, car il y a beaucoup de pratique), et maintenant la tâche est d'aller largement à la formation de spécialistes étrangers.
C'est ce qu'on appelle pleinement le Centre international de formation de Rospotrebnadzor à l'École de biomédecine de l'Université fédérale d'Extrême-Orient. Il a été ouvert, en fait, par Mikhail Shchelkanov avec la photo ci-dessus et German Shipulin (FBUN CRI de Rospotrebnadzor à Moscou). Les preuves dans les médias seront demain, apparemment. Eh bien, je ne suis pas microbiologiste, donc si j'ai fait une erreur quelque part ci-dessus, s'il vous plaît.
UPD: voici l'actualité de
RG , qui a toujours un point de vue sur cette histoire.