Analyse de la vitesse micromotrice moléculaire pour le diagnostic du VIH

Le virus de l'immunodéficience humaine ou simplement le VIH est le fléau du 20e siècle. Un titre assez fort, mais ce n'est pas exagéré. Cette maladie a coûté la vie à des millions de personnes. Et chaque année, le nombre de victimes de cette maladie insidieuse augmente, ainsi que le nombre d'études visant à traiter et à diagnostiquer le VIH. Toute maladie, et le VIH ne fait pas exception, est plus facile à traiter aux premiers stades de développement. Mais cela nécessite un moyen de le reconnaître le plus tôt possible, avant même que les premiers symptômes ne commencent à se manifester. Quand vous, disons, coupez un doigt, vous voyez une coupure, c'est-à-dire que vous savez clairement quoi traiter. Le VIH peut vivre dans le corps humain sans se manifester, c'est-à-dire asymptomatiquement, pendant un certain temps. Aujourd'hui, nous considérerons une nouvelle invention qui peut déterminer rapidement et avec précision la présence du virus de l'immunodéficience via un petit appareil connecté à un smartphone. Comment fonctionne cette innovation, quelle est la précision de ses résultats et que prévoient les chercheurs à l'avenir? Nous chercherons des réponses à ces questions et à d'autres dans le rapport du groupe de recherche.

Base théorique

Parler des maladies est désagréable, mais nécessaire. Plus nous en savons sur eux, mieux nous pouvons nous protéger et protéger nos proches de leur influence.



VIH - Le virus de l'immunodéficience humaine a d'abord montré sa terrible grimace au début des années 80 du siècle dernier. Ensuite, personne ne savait ce que c'était, et le virus lui-même n'avait même pas de nom. Des recherches supplémentaires ont montré que le VIH est un rétrovirus qui infecte les cellules du système immunitaire du corps, l'un des systèmes les plus importants. L'effet du virus est la suppression de la défense immunitaire et le développement du syndrome d'immunodéficience acquise par le SIDA. Dans cet état, le corps reste sans défense et toute infection, même la plus légère, (ainsi que les cellules cancéreuses) peut l'affecter considérablement. Essentiellement, le VIH détruit notre défense et les ennemis face aux infections envahissent calmement le corps.

Le VIH a un mécanisme de contact de transmission. L'infection peut survenir par contact avec du sang, du sperme, du lait maternel, du liquide pré-ensemencé ou des sécrétions vaginales. En d'autres termes, les rapports sexuels non protégés, les instruments médicaux infectés et même les aiguilles non infectées dans les salons de tatouage sont un excellent moyen de propager le virus. Pendant la période de l'émergence du VIH, lorsque la panique s'est propagée au sein de la population plus rapidement que des informations fiables sur ce qu'est le VIH et comment il se propage, on pensait que l'infection pouvait provenir d'une simple poignée de main. C'est un mythe, car le virus ne se propage pas par un simple contact avec une personne infectée. Cependant, cette option d'infection est également possible, mais uniquement dans le cas de plaies ouvertes sur les mains des personnes infectées et éventuelles de l'infection. Je ne parle pas du fait que certains moustiques considérés comme transmettant le VIH (un moustique boit le sang d'un patient et, après avoir mordu une personne en bonne santé, peut l'infecter) est également un mythe.


Prévalence mondiale du VIH selon l'Organisation mondiale de la santé (2017).

Je ne décrirai pas en détail le virus et les conséquences de son développement dans l'organisme, car nous allons discuter non pas tant du virus lui-même que d'une nouvelle méthode pour son diagnostic. Mais il convient de noter que le VIH est un virus qui peut muter dans le corps d'une personne infectée au fil du temps, ce qui le rend encore plus résistant à diverses méthodes de confinement ou de traitement. C'est une autre raison pour laquelle il doit être détecté le plus tôt possible. Plus le virus a de temps, plus il est fort et plus la personne infectée est faible.

En quoi consiste l'appareil?

Les scientifiques impliqués dans cette étude affirment que l'un des problèmes et des obstacles les plus graves dans le diagnostic précoce du VIH, comme d'autres maladies, dans le monde est le manque de conditions appropriées: laboratoires, personnel, installations médicales. C'est pourquoi ils ont décidé de créer un appareil qui peut indiquer avec précision s'il y a un virus dans le corps ou non. La glycémie peut déjà être vérifiée pendant longtemps à l'aide d'appareils compacts portables (glucomètres), c'est-à-dire sans avoir à se rendre au laboratoire et à attendre les résultats des tests pendant plusieurs jours. Le coût de tels appareils est assez faible, ce qui accompagne également leur distribution.

Le dispositif que nous allons connaître aujourd'hui peut être brièvement décrit comme suit: un analyseur mobile pour la détermination moléculaire du VIH-1 basé sur l'amplification isotherme en boucle (LAMP) et les nanomoteurs (CALM). Et maintenant, dans l'ordre.

Nanomoteurs

Les nanomoteurs (également appelés micromoteurs) sont appelés dispositifs moléculaires microscopiques capables de convertir l'énergie en mouvement. S'ils sont placés dans une solution chimique spécifique, ils commencent à se déplacer indépendamment le long d'un itinéraire spécifique, qui peut être utilisé dans le diagnostic, et même dans l'approvisionnement énergétique des appareils nanotechnologiques.


Le schéma de formation micromoteur pour un testeur VIH.

Les micromoteurs sont des sphères en polystyrène recouvert de nanoparticules de Pt (platine) d'une densité de 1,04 g / cm. De plus, des nanoparticules d'Au (or) ont également été utilisées pour modifier les micromoteurs avec des sondes d'ADN (dans le diagramme ci-dessus, elles sont présentées comme des «tentacules» rouges).

Un MET (microscope électronique à transmission) a montré que les nanoparticules de platine et d'or utilisées dans le revêtement des micromoteurs étaient de forme sphérique et avaient un diamètre de 57,721 ± 5,181 nm (Pt) et 3,43 ± 1,336 nm (Au).


Ci-dessus sont des images TEM, des flacons photo avec des nanoparticules préparées et les résultats de la spectroscopie optique.

Il était nécessaire de vérifier l'efficacité avec laquelle une sonde d'ADN d'un micromoteur entièrement formé peut capturer des molécules d'ADN. Pour cela, la technique d'électrophorèse sur gel d' agarose * (C ₁₂ H ₁₈ O ₉ ) a été utilisée.

L'agarose * est un polysaccharide linéaire formé d'une séquence de résidus β-D-galactopyranose et 3,6-anhydride-α-L-galactopyranose liés par une liaison 1 → 4. Obtenu à partir de gélose.

Cette technique nous a permis de confirmer que les micromoteurs ont des sondes d'ADN à leur surface, car ils ont pu fixer une molécule d'ADN artificielle d'environ 180 pb (bases appariées), ce qui est un excellent résultat pour un tel échantillon (artificiel) (image de gauche). Le degré d'efficacité de capture lors des premiers tests était d'environ 30%, ce qui est confirmé par la fluorimétrie (image de gauche).


Ici, nous voyons comment les micromoteurs se déplacent en solution avec différentes concentrations de H ₂ O ₂ (0, 5, 10 et 15%).

Il était également nécessaire de vérifier la caractéristique la plus importante des micromoteurs - le mouvement. Pour cela, une solution avec et sans H ₂ O _{2 a été utilisée} (comparaison des trajectoires dans l'image d ci-dessous). Lorsque le peroxyde d'hydrogène était absent, les micromoteurs vibraient, ce qui était dû au mouvement brownien. Lorsque H ₂ O _{2 a} commencé à être introduit dans la solution, la vitesse des micromoteurs a augmenté d'environ 0,7 μm / s pour chaque peroxyde d'hydrogène à 1% dans la solution.


Mesure de la vitesse des micromoteurs dans une solution d'essai.

La figure a montre la dépendance de la vitesse des micromoteurs d'un diamètre de 6 μm et la concentration de H ₂ O ₂ en solution. Également (à droite) est un instantané du micromoteur et de sa trajectoire. Le diagramme b montre le degré de stabilité des micromoteurs à diverses températures dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 5%. Ci-dessous (graphique et instantané), nous voyons comment l'indicateur de stabilité évolue dans le temps (120 s), ainsi que la trajectoire du mouvement déjà dans une solution à 15%. Le déplacement quadratique moyen dans le temps est indiqué dans les graphiques e : points noirs - une solution sans H ₂ O ₂ , rouge - 5% H ₂ O ₂ .

Ci-dessous, dans l'image f , nous voyons que non seulement l'état de la solution où les micromoteurs sont situés affecte leur comportement, mais que les micromoteurs eux-mêmes, et plus précisément leur structure, le modifient également de manière significative. Nous voyons comment les micromoteurs d'un diamètre de 3 μm sans dépôt de platine et d'or se déplacent (lignes bleues) par rapport aux micromoteurs entièrement testés d'un diamètre de 6 μm (lignes rouges). A droite de la comparaison des trajectoires se trouve une comparaison du déplacement quadratique moyen des micromoteurs (3 μm et 6 μm de diamètre).

Appareil mobile

Le Motorola XT1575 (Android OS) a été utilisé pour visualiser et suivre les micromoteurs (c'est-à-dire pour surveiller la façon dont les diagnostics se produisent).


Apparence et détails de l'appareil.

Un composant important de l'appareil est la puce nécessaire pour vérifier le mouvement des micromoteurs. Il était en polyméthacrylate de méthyle (plexiglas). Une base en verre avec un «canal» découpé au laser de 2 mm de large y a été fixée à l'aide d'une couche de colle de 80 μm.


L'apparence de la puce et ses dimensions.

Comme on peut le voir sur les photos ci-dessus, la puce n'est pas la seule partie de l'appareil. Le boîtier amovible bleu était fait de matériaux bon marché sur une imprimante 3D. À l'intérieur de ce boîtier, il y a une LED blanche, une batterie de 3,3 V, un interrupteur et des lentilles optiques peu coûteuses. Dans le cas également, un porte-échantillon vous permet de les placer entre les objectifs et l'appareil photo du téléphone.

Et maintenant sur le composant logiciel. Le logiciel a été créé dans Android Studio à l'aide des bibliothèques OpenCV 3.1.0. Selon les scientifiques, l'interface a été rendue aussi claire et pratique que possible pour les utilisateurs.


Interface du testeur VIH.

Lorsque l'échantillon est placé dans l'appareil, le programme enregistre une vidéo (30 ips, 320x240 pixels), qui montre le mouvement des micromoteurs, calcule leur vitesse et en 1 minute donne le résultat de l'analyse.

Amplification isotherme en boucle (LAMP)

Quelle est l'efficacité du système micromoteur pour reconnaître le VIH-1? La réponse à cette question réside dans les réactions de LAMP. Pour les tests, plusieurs échantillons ont été préparés avec différentes concentrations d'ARN du VIH-1 (acide ribonucléique). Le résultat de l'amplification a été évalué par électrophorèse sur gel d'agarose.


Test LAMP.

Les résultats de l'électrophorèse ont montré la formation par étapes d'un grand amplicon d'ADN (séquence d'ADN, résultat de l'amplification). Le nombre d'amplicons était proportionnel à la concentration d'ARN du VIH-1.

Les micromoteurs ont été mélangés avec des amplicons d'ARN du VIH-1, permettant de subir un processus d'hybridation (à une température de 80 ° C). Ensuite, le "mélange" résultant a été testé dans une solution à 5% de H ₂ O ₂ . Lorsque des amplicons d'ARN du VIH-1 étaient présents dans le système, la vitesse des micromoteurs était très réduite, d'environ 95,26%. Une diminution de la vitesse est observée même à une faible concentration d'amplicons (environ 3,394 ± 0,245 ng / μl).


Démonstration du mouvement micromoteur en l'absence d'ARN du VIH-1.


Démonstration du mouvement micromoteur en présence d'ARN du VIH-1.

Les scientifiques ont également réussi à restaurer les micromoteurs et leur vitesse. Pour cela, l'échantillon «infecté» avec micromoteurs et amplicons a été incubé pendant 30 secondes à une température de 90 ° C. Cela a permis de libérer les amplicons des sondes micromotrices à ADN. Ceci a été suivi d'une centrifugation à 6000 x g pendant 5 minutes. La vérification de l'échantillon obtenu dans une solution à 5% de H ₂ O _{2 a} montré que la vitesse micromotrice a été restaurée au niveau de 75,52% par rapport à l'original, avant le test avec la participation d'amplicons d'ARN du VIH-1.

La réaction du système à d'autres types de virus sexuellement transmissibles a également été testée: hépatite C et B, herpès, papillomavirus 16 (HPV-16). En raison des cas fréquents d'infection parallèle à la fois par le VIH et certains des virus ci-dessus, ce test était également d'une grande importance. Le résultat a été satisfaisant - des amplicons d'ADN ne se sont formés qu'en présence du VIH. En d'autres termes, la présence d'autres virus dans l'échantillon de test n'a pas affecté le processus de vérification.

La conclusion est simple - la méthode est capable de déterminer la présence du VIH. Mais maintenant, il est nécessaire d'effectuer un étalonnage afin que le système puisse distinguer la présence et l'absence du virus dans l'échantillon, en se concentrant sur la concentration standard de 1000 particules / ml. Si la concentration est inférieure à cet indicateur, le résultat est négatif (il n'y a pas de virus), si la concentration est plus élevée, elle est positive. Pour effectuer l'étalonnage, il a fallu déterminer quelle vitesse des micromoteurs correspond à quelle concentration. Pour cela, du PBS - tampon phosphate de sodium (une solution spéciale pour la recherche) et le plasma des patients avec et sans VIH ont été utilisés.

L'étalonnage a été effectué à l'aide de PBS, dans lequel la concentration d'ARN du VIH-1 stabilisé synthétique variait de 0 à 107.

Après l'étalonnage, il est devenu clair que la vitesse micromotrice moyenne à une concentration de VIH de 1000 est de 0,705 ± 0,082 μm / s.


Les résultats de la détermination de la concentration d'ARN du VIH-1.

Les scientifiques ont également analysé le système à l'aide de la courbe ROC, qui a montré des résultats très encourageants. La sensibilité * du système testé était d'environ 94,6% avec un IC * de 81,8–99,3%, et la spécificité * de 99,1% avec un IC de 80,5–100%.

Sensibilité * - un indicateur reflétant la part des résultats positifs (dans ce cas, c'est la probabilité que la concentration de VIH dans l'échantillon soit supérieure à 1000).

La spécificité * est un indicateur reflétant la part des résultats négatifs (dans ce cas, c'est la probabilité que la concentration de VIH dans l'échantillon soit inférieure à 1000).

DI * - intervalle de confiance, c'est-à-dire l'intervalle couvrant un paramètre inconnu avec une fiabilité donnée.

Le diagramme de dispersion des résultats du système a également montré des résultats incroyables. Ainsi, la précision de la détermination d'un échantillon avec une forte concentration de VIH positif est de 100% et la précision de la détermination des échantillons négatifs est de 90%.



Ceux qui souhaitent se familiariser avec l'étude plus en détail peuvent consulter le rapport des scientifiques et des documents supplémentaires .

Épilogue

Les scientifiques qui ont créé cet incroyable appareil ne nient pas qu'ils n'ont pas encore effectué de nombreux tests, étalonnages et améliorations. Mais ils sont clairement sur la bonne voie. De tels dispositifs peuvent réduire considérablement la propagation du VIH, en particulier chez les personnes dans des endroits où les laboratoires avec du personnel et un tas d'équipements médicaux ne sont tout simplement pas disponibles.

Oui, l'appareil n'a pas encore l'air très compact et le fait qu'il nécessite l'utilisation d'un smartphone peut repousser quelqu'un. Cependant, à l'avenir, ces technologies de diagnostic précoce du VIH continueront de s'améliorer, non seulement en termes d'efficacité et de précision, mais également en termes de commodité et de prix.

Le VIH est le fléau du 20e siècle, comme je l'ai écrit au tout début de cette histoire. Mais, malheureusement, ce virus n'est pas si loin du titre de "peste du XXIe siècle". De nos jours, plusieurs maladies revendiquent déjà un titre aussi fort (par exemple, dépression, diabète, etc.). Et chacune de ces maladies nécessite une grande attention. Et bien qu'il n'y ait pas de pilule magique qui puisse guérir une maladie, nous ne pouvons qu'améliorer les méthodes de diagnostic disponibles, ce qui nous donne plus de temps pour rechercher un traitement ou contenir la maladie. Comme on dit, plus tôt nous connaissons un problème, plus nous avons de chances de le résoudre.

Un autre point important est l'activité sociale, l'ouverture et la discussion. Le problème doit être discuté, car même si ça fait peur d'en parler, comment la société compte-t-elle le combattre?

En tout cas, c'est tout pour moi. Prenez soin de vous et de vos proches.

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