Mouches invisibles: une nouvelle méthode pour étudier le système nerveux par la dépigmentation tissulaire

L'étude d'un organisme est un processus complexe et nécessite de la précision. Les méthodes de numérisation modernes y sont parvenues. Aujourd'hui, nous pouvons étudier suffisamment en détail le corps ou un organe individuel dans des images en trois dimensions. Il y a environ 100 ans, une vue tridimensionnelle des organes ne pouvait être obtenue qu'en les retirant du corps et en les examinant en direct, pour ainsi dire. Cependant, il y a toujours un «mais». Mais même les scanners et microscopes les plus précis ne peuvent pas donner une précision de 100%. Maintenant, s'il était possible de rendre tout ce qui n'est pas nécessaire invisible et de laisser visible cette partie du corps que nous voulons étudier. Cela ressemble à de la science-fiction, n'est-ce pas? Je suis d'accord. Mais maintenant c'est réel. Aujourd'hui, nous apprendrons l'étude d'une nouvelle méthode de balayage des organismes en utilisant l'exemple de la drosophile. Comment les scientifiques ont-ils réussi à rendre un cécidomyie ordinaire des fruits «invisible», quelle est la précision de leur méthode de numérisation et comment cela aidera-t-il au diagnostic des maladies humaines? Les réponses à ces questions et à d'autres ne peuvent être obtenues que dans le rapport des chercheurs. Alors ne tirons pas dessus. Allons-y.

Base d'étude

Comme je l'ai dit dans l'un des articles précédents , dont le personnage principal, comme aujourd'hui, était la drosophile, ce petit insecte ennuyeux en vérité fait l'objet de nombreuses études. Avec son aide, les scientifiques étudient pas mal de choses: de l'aérodynamique au système nerveux. Et c'est à propos de ce dernier qui sera discuté aujourd'hui. L'étude de systèmes aussi complexes dans de si petits organismes pose de nombreuses difficultés. Nous connaissons déjà les méthodes d'étude des organismes en les découpant en plusieurs couches ultrafines. Cette méthode permet d'étudier plus en détail de nombreux systèmes. Cependant, en ce qui concerne le système nerveux, cette méthode, selon les chercheurs, viole l'intégrité cellulaire, ce qui complique le processus d'étude des différentes parties du système.



Si nous appliquons la numérisation sur de petits organismes sans «stratification» physique, nous verrons tous les systèmes en même temps. Mais les scientifiques veulent étudier un seul système, tandis que d'autres ne devraient pas interférer avec ce processus. Par conséquent, ils ont eu une idée brillante et simple: rendre tout invisible (ou plutôt transparent) et laisser le système nécessaire intact.

Pour le moment, il y a suffisamment d'outils pour mettre en œuvre une telle idée, il ne reste plus qu'à les combiner. Les principaux ingrédients d'une nouvelle méthode de numérisation appelée FlyClear (en l'honneur du premier sujet testé - les mouches drosophiles) sont le «nettoyage» des tissus et l'ultramicroscopie.



La drosophile a été choisie comme sujet de test pour une raison. La base de la plupart des méthodes de nettoyage des tissus est la modification génétique de l'organisme d'essai. Dans ce cas, c'est la fluorescence. Ce processus est extrêmement complexe et prend du temps. Plus le corps est grand, plus sa modification sera longue. De plus, toutes les créatures ne peuvent pas être modifiées comme les scientifiques le souhaitent. La drosophile se prête assez facilement à des manipulations génétiques similaires, et ce processus ne prend pas autant de temps.

À l'heure actuelle, la méthode la plus populaire pour étudier les organismes est la microscopie confocale, mais elle n'est effectuée qu'après dissection des tissus. La question se pose - et sinon de disséquer? Dans ce cas, nous obtenons une image pâle de faible qualité et le processus lui-même prendra beaucoup de temps. Une forte absorption et diffusion des photons dans l'échantillon sera également observée, en particulier avec une pigmentation accrue des tissus (comme chez la drosophile). En conséquence, l'échantillon doit être nettoyé, c'est-à-dire rendu transparent. Ainsi, pour niveler la diminution de l'intensité du signal et obtenir une résolution spatiale uniforme. Le principal moyen «opaque» (excusez-moi pour un mot fictif) est de réduire l'indice de réfraction aux frontières entre les composants cellulaires.

Les chercheurs ne nient pas qu'il existe maintenant plusieurs façons qui sont déjà devenues classiques pour rendre les tissus transparents. Cependant, ils affirment également que ces méthodes présentent un certain nombre d'inconvénients. Préservation de la morphologie, stabilité de la fluorescence, profondeur de balayage, etc. - avec tous ces aspects, les méthodes existantes, pour le moins, ne sont pas correctes. De plus, aucun d'eux ne permet une dépigmentation complète des tissus.

Il s'avère que pour une meilleure numérisation des petits corps, il est toujours nécessaire de procéder à une coupe transversale des tissus? Pas vraiment. Les scientifiques citent la même drosophile comme exemple. Situés dans ses régions périphériques (jambes, yeux, antennes), les neurones sensoriels de la drosophile ont de très longues connexions avec de nombreux nerfs et avec le cerveau. Si ces régions sont en couches, nous n'aurons pas une image complète de la structure du système nerveux dans ces régions.

Dans cette étude, la méthode FlyClear nous a permis d'éliminer la pigmentation du tissu de la drosophile, exposant son système nerveux. Cela a pris environ un mois. Et l'ultramicroscopie nous a permis de visualiser les plus petites connexions neuronales et de construire une carte complète du système nerveux du moucheron. Une substance a également joué un rôle important, à l'aide de laquelle il a été possible de «colorer» le système nerveux d'une couleur vert vif - une protéine fluorescente verte (ci-après dénommée ZFB). Le gène de cette protéine, obtenu à partir de la méduse Aequorea victoria, est utilisé précisément pour la modification génétique des échantillons testés.


Méduse Aequorea victoria.

Les données obtenues par microscopie à fluorescence ont été traitées par un algorithme spécial qui vous permet de créer une image tridimensionnelle à haute résolution.

Préparation de l'étude

Le nettoyage optique du tissu de la drosophile n'est pas un processus facile. L'exosquelette chitineux et les photopigments oculaires à facettes sont les régions les plus difficiles du corps du cécidomyie pour la procédure. Les méthodes de nettoyage des tissus actuellement disponibles sont loin d'être idéales, car les chercheurs ont créé leur propre - FlyClear, que j'ai mentionné plus tôt.

FlyClear combine plusieurs des méthodes précédentes. Le premier d'entre eux dans le processus est CUBIC (cocktails d'imagerie cérébrale clairs et non obstrués). Les étapes ultérieures dépendent de l'état de l'échantillon (larve ou adulte).


Options pour la procédure FlyClear.

Dans le cas de la larve, une fixation à 0,03% de protéase et de formaldéhyde est utilisée. Le fait est que la protéase décompose les liaisons peptidiques entre les acides aminés des protéines, ce qui contribue à «décolorer» les tissus. Ensuite, l'acétone est utilisée sur l'échantillon pour la perméabilisation (changements dans la perméabilité de la membrane cellulaire).

Les scientifiques ont réussi à améliorer le stade CUBIC en remplaçant [CH ₃ CH (OH) CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH (OH) CH ₃ ] ₂ (N, N, N ', N'-tétrakis (2-hydroxypropyl ) éthylènediamine) sur C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ (2,2 ', 2 ", 2"' - (éthylène dinitrile) tétraéthanol)). Ce changement a permis d'obtenir une dépigmentation complète des tissus, y compris dans les zones complexes (yeux et épiderme).

Ainsi, la méthode de dépigmentation tissulaire complète fonctionne. Vous devez maintenant vérifier la deuxième étape importante de l'étude - la fluorescence. Plus précisément, il est nécessaire de vérifier si le nouveau réactif C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ supprimera les signaux de fluorescence, étant donné que la drosophile a déjà une faible fluorescence après manipulations génétiques. Pour le test, les échantillons (corps de drosophile) ont été divisés en deux: une moitié n'a pas été traitée, la seconde avec traitement. L'analyse a montré que le niveau de gravité du ZFB diminue vraiment lors de l'utilisation de C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ , mais cela n'affecte pas la précision globale. Et tout cela grâce au fait que le même réactif a permis d'atteindre un haut degré de dépigmentation tissulaire. Autrement dit, les avantages du réactif ont nivelé ses lacunes.

L'échantillon fini doit être considéré, pour ainsi dire, et pour cela, une ultramicroscopie avancée a été utilisée pour obtenir une image de l'échantillon avec la même résolution dans tous les plans.


Système optique: 1 et 3 - une lentille cylindrique asphérique plan-convexe; 2 - lentille Powell; 4 - ouverture douce elliptique apodisante; 5 et 6 - lentilles cylindriques.

En règle générale, l'ultramicroscopie standard utilise des lentilles cylindriques et une ouverture rectangulaire. Dans cette étude, des composants supplémentaires ont été utilisés pour changer la forme du faisceau en ultra-mince avec des caractéristiques améliorées.

L'utilisation de lentilles sphériques est due à la capacité d'obtenir une image sans distorsion et avec une aberration minimale.

L'ouverture standard a également été remplacée par une ouverture douce apodisante elliptique (dans l'image ci-dessus au numéro 4). La nouvelle ouverture a éliminé la distribution d'intensité indésirable dans le système optique.

Résultats de recherche

Vous trouverez ci-dessous les systèmes spécifiques de l'organisme de la drosophile (respiratoire, visuel, nerveux, etc.) mis en évidence par le ZFB, tandis que le reste du tissu est complètement dépigmenté.

Afin de ne pas étirer l'article, j'ai tout caché sous un spoiler.









Les scientifiques appellent sans hésitation la plus grande réussite de leur recherche la capacité de créer une carte tridimensionnelle complète du système nerveux. Et si vous considérez que ce système appartient à un si petit organisme (la drosophile), cette réalisation devient encore plus significative.

La nouvelle technique vous permet de déterminer avec précision où et comment ces neurones ou d'autres sont connectés, à la fois entre eux et avec le cerveau. Si une section transversale avait été utilisée, cela n'aurait pas été possible.



Pour démontrer les capacités de leur méthode, les scientifiques nous montrent deux types de neurones du système visuel de la drosophile: DCN - neurones de l'amas dorsal et MCN - neurones cylindriques du cerveau (colonnes corticales dans la partie postérieure du cerveau). Dans la région dorsale-latérale du cerveau, les grappes de DCN forment des composés commissuraux pour exciter les neurones synaptiques de la moelle et des lobules dans le lobe optique. (images au - dessus de a , c ).

Dans les images b et d , la perte de la connexion commissurale chez les mutants homozygotes des cellules neurales neurogliennes est visible. Ces changements dans le système nerveux sont associés précisément au processus de purification des cellules FlyClear.



Pour construire une reconstruction en trois dimensions, des photos ont été prises à partir de deux directions orthogonales, qui ont ensuite été combinées. L'algorithme basé sur la FFT 3D détermine les détails d'un échantillon qui semblent plus clairs dans l'une des deux piles d'images. De plus, tout cela a été combiné en une reconstruction en trois dimensions.

Ceux qui souhaitent se familiariser avec l'étude plus en détail peuvent lire le rapport des scientifiques et des documents supplémentaires .

Épilogue

Les scientifiques ne se vantent pas en vain et ne sont pas fiers de leur travail, car cela ne s'est jamais produit auparavant. La méthode de stratification par section transversale a été dominante dans le domaine de la recherche sur les organismes. Mais cette méthode, bien qu'elle présente de nombreux avantages, présente d'énormes inconvénients. En particulier, les incisions violent l'intégrité cellulaire et tissulaire, compliquant ainsi le processus de reconstruction d'un système corporel particulier.

Explorer un organisme au système nerveux complexe, lorsque chaque détail est important, sera désormais beaucoup plus facile. Les scientifiques pourront obtenir plus de données, ce qui leur permettra de décrire plus en détail ces processus ou d'autres dans le corps.

N'oubliez pas non plus que la drosophile n'est expérimentale que dans cette étude et non sur sa base. L'amélioration de la nouvelle méthode de numérisation peut également être utile à la personne. Et pas seulement pour étudier le corps et ses éléments constitutifs, mais aussi pour diagnostiquer les maladies qui peuvent être cachées dans les premiers stades où les méthodes de scan actuellement disponibles ne peuvent pas les déterminer.

La recherche ouvre de nombreuses perspectives: de nouvelles espèces d'animaux, de nouvelles substances, de nouveaux processus et phénomènes. Mais sans recherche visant à créer des outils de recherche, tout cela aurait été impossible.


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