Harm for Good: le système immunitaire de la lamproie dans la lutte contre le cancer du cerveau humain

Notre cerveau est notre tout. La violation du travail de cet organe important entraîne des conséquences terribles et parfois fatales. La complexité du cerveau et de son organisation neuronale est colossale, ce qui complique grandement le processus de traitement d'une maladie particulière. En règle générale, lorsque nous traitons quelque chose, nous essayons de nous débarrasser des défauts causés par la maladie. Mais que faire si ces défauts sont utilisés pour combattre ce qui les crée? C'est exactement ce que les auteurs de l'étude que nous envisageons aujourd'hui ont décidé de faire. Comment les scientifiques ont-ils appliqué la perturbation de la barrière hémato-encéphalique, pourquoi l'accès à la matrice extracellulaire du cerveau est nécessaire, et quel rôle a joué le parasite de la lamproie sur les poissons? Le rapport du groupe de recherche nous en parlera. Allons-y.

Un peu de théorie

Tout d'abord, il convient de trier les personnages de cette pièce de laboratoire.


Barrière hémato-encéphalique

L'un des rôles principaux est joué par la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​- une barrière physiologique entre le système nerveux central (SNC) et le système circulatoire. Cette barrière empêche le contact des tissus nerveux avec divers composants du sang en circulation, parmi lesquels il peut y avoir des toxines, des micro-organismes, des facteurs cellulaires / humoraux du système immunitaire qui peuvent répondre aux cellules cérébrales comme étrangères. Le BBB peut être comparé à un videur dans un club très cher, laissant au système nerveux central exclusivement des nutriments. Mais ce videur n'est pas très pointilleux, il ne manque souvent pas les médicaments nécessaires pour traiter le système nerveux central. Il s'avère qu'un système visant au bénéfice de notre santé peut être un obstacle à son traitement. Voici l'ironie de la physiologie.

Cependant, la barrière hémato-encéphalique ne fonctionne pas toujours comme une montre suisse. En cas d'accident vasculaire cérébral, de tumeurs, de traumatismes crâniens divers, de maladies chroniques, le BBB commence à échouer, c'est-à-dire à laisser au système nerveux central ce qu'il aurait précédemment éliminé. En plus des causes naturelles de l'échec, il existe également des agents anthropogéniques: ultrasons focalisés de haute intensité et agents osmotiques qui perturbent le BBB. Pourquoi casser quelque chose qui assure le fonctionnement normal du cerveau, demandez-vous. Ensuite, pour délivrer des médicaments qu'un BBB à part entière filtrera. Quoi qu'il en soit, le videur ne laissera pas entrer le médecin dans le club pour un visiteur qui s'est évanoui, car il n'a pas de carte de club.

Le principal et commun à tous les cas, le résultat de la perturbation du BBB est une exposition pathologique de la matrice extracellulaire (ECM) du cerveau, qui est isolée dans des conditions normales.

La matrice extracellulaire est la base du tissu conjonctif qui fournit un support mécanique aux cellules et au transport des produits chimiques.

Par conséquent, les scientifiques pensent qu'en ciblant certaines parties du cerveau avec un BBB pathologiquement perturbé, il est possible de délivrer des médicaments aux parties du système nerveux central endommagées qui étaient auparavant inaccessibles précisément à cause du BBB.

Ainsi, il est possible de créer un ligand destiné à l'ECM, qui sera efficace dans la lutte contre diverses maladies du système nerveux central, et non avec une seule, comme les méthodes développées précédemment.

Pour tester la théorie dans la pratique, les scientifiques ont décidé d'appliquer leur méthode d'administration de médicaments au glioblastome incurable (cancer du cerveau). Ce type de maladie est assez rare, mais il est extrêmement difficile à vaincre. Même après la chimiothérapie, la radiothérapie et la chirurgie, la survie est d'environ 1 à 2 ans.

Des études récentes ont montré que l'utilisation de l'immunothérapie par le biais de récepteurs d' antigène chimérique à base d' interleukine 13 * est un traitement prometteur pour le glioblastome.

Les interleukines * sont des molécules d'informations peptidiques produites par les leucocytes, dans une moindre mesure par les phagocytes et d'autres tissus. Les interleukines font partie du système immunitaire.

L'interleukine-13 * (IL13) est le principal médiateur des changements physiologiques provoqués par une inflammation allergique dans de nombreux tissus.

Le récepteur d'antigène chimérique * est une protéine de fusion recombinante qui relie un fragment d'anticorps qui peut se lier sélectivement à des antigènes spécifiques et à des domaines de signalisation qui activent les cellules T.

L'utilisation de récepteurs antigéniques chimériques ciblant la protéine CSPG4 peut également être une méthode plutôt efficace de lutte contre le glioblastome.

De plus, l'analyse IRM a montré une violation de la barrière hémato-encéphalique à l'intérieur du glioblastome. Par conséquent, les traitements liés à la matrice extracellulaire doivent être efficaces.

Et ici, l'immense imagination et créativité des scientifiques entre en scène. Le fait est que vous pouvez utiliser des peptides et des anticorps standard comme réactifs ciblés par ECM, mais ce n'est pas si amusant. Par conséquent, les scientifiques ont décidé d'utiliser des récepteurs lymphocytaires variables (VLR), c'est-à-dire des récepteurs d'antigène de lamproie.


La classe de lamproie comprend environ 40 espèces, dont la plupart sont des parasites qui se nourrissent du sang des poissons, auxquels ils sucent.

Les VLR sont des protéines riches en faucille, riches en leucine qui reconnaissent les cibles antigéniques avec une spécificité et une affinité * comparables aux anticorps à base d'immunoglobulines.

L'affinité * est la caractéristique thermodynamique de la force de l'interaction de substances telles que l'antigène et l'anticorps.

Pourquoi précisément les lamproies et leur VLR? Le fait est qu'entre les mammifères et les lamproies, il y a un abîme évolutif de 500 millions d'années. Ainsi, les VLR de lamproie sont plus susceptibles de reconnaître les protéines et les glycanes conservés dans l'ECM que les anticorps de mammifères.

Pour identifier les VLR qui se lient à l'ECM du cerveau, les scientifiques ont effectué un panoramique, une méthode pour sélectionner des bio-éléments spécifiques (protéines, petites, etc.) à partir des bibliothèques VLR de biomolécules. Le résultat a été un pool de clones se liant à l'ECM * .

Clone * - un groupe de cellules identiques qui partagent un ancêtre commun (source principale), c'est-à-dire proviennent de la même cellule.

Le clone résultant a démontré une accumulation préférentielle à la fois dans les zones détruites de la barrière hémato-encéphalique chez les animaux présentant un trouble osmotique du BBB ou avec un glioblastome. De plus, le clone était bien ciblé sur les liposomes * chargés de doxorubicine (un antibiotique).

Liposomes * - organites sphériques intracellulaires utilisés pour administrer des médicaments à certains tissus.

Préparation de l'étude

Comme nous l'avons déjà appris plus tôt, les VLR se liant à l'ECM ont été identifiés en déplaçant les bibliothèques de VLR. La bibliothèque elle-même a été obtenue à partir d'une collection de VLR de lamproie immunisés avec des préparations mécaniquement isolées de la membrane plasmique de la microvascularisation du cerveau de souris, qui contenait l'ECM associée du cerveau.

La bibliothèque a d'abord été enrichie de liants ECM en utilisant deux cycles de panoramique sur un ECM décellularisé * généré par des cellules endothéliales de souris en culture (lignée cellulaire bEnd.3).

La décellularisation * est une méthode de purification des allogreffes du composant cellulaire pour obtenir une construction non immunogène, efficace et sûre basée sur une matrice extracellulaire naturelle.

En outre, il était nécessaire d'identifier précisément les clones de liaison à l'ECM qui plient principalement l'ECM de bEnd.3, et non avec le groupe témoin d'ECM de fibroblastes de souris (lignée cellulaire 3T3).

Ensuite, des clones individuels ont été placés dans des plaques à 96 puits, après quoi ils ont été étendus et induits pour afficher VLR. Après avoir retiré des clones supplémentaires (afin qu'il n'y ait pas de sous-clonage), les scientifiques ont pu effectuer une évaluation comparative de la liaison de VLR à bEnd.3 et 3T3 ECM en utilisant le dépistage ELISA ( 1a ).


Image n ° 1

Au total, 285 clones ont été analysés. En conséquence, on peut voir que les signaux de communication avec bEnd.3 ECM sont environ 5 fois plus forts que les signaux de communication avec 3T3 ECM ( 1b ).

Ensuite, les résultats ELISA ont été vérifiés en comparant des images de microscopie en champ clair de clones associés à bEnd.3 et 3T3 ECM ( 1C ).

Comme on peut le voir sur l'image 1c , les clones P1C10 et P2C7 se lient exclusivement à l'ECM bEnd.3, et le clone non contraignant P1E9 ne montre pratiquement aucune connexion avec aucun type d'ECM.

Ensuite, les scientifiques ont effectué une analyse comparative d'une méthode plus pratique - sur une section du cerveau de la souris. Huit des 10 clones VLR qui ont montré le meilleur résultat de liaison dans les observations précédentes ont également montré une liaison ( 1d ) dans ce test.

Tous les clones de liaison présentaient un schéma CEM parenchymateux diffus sans aucun enrichissement supplémentaire (vasculaire ou cellulaire).

Les scientifiques ont identifié 2 leaders selon les résultats de toutes les observations ci-dessus - P1C10 et P3A8. Ce sont ces clones qui seront envisagés à l'avenir.

Résultats de recherche

P1C10 et P3A8 ont été fonctionnalisés avec un colorant fluorescent Cy5. L'immunocoloration directe des tissus murins à l'aide de conjugués VLR-Cy5 a montré que P1C10-Cy5 a une sélectivité significative vers l'ECM du cerveau par rapport aux tissus des reins, du cœur et du foie ( 2a ).


Image n ° 2a

Immunomarquage * - un processus qui vous permet d'identifier et de localiser un antigène dans une zone spécifique d'une cellule, d'un tissu ou d'un organe.

Mais P3A8-Cy5 se lie aux ECM du cerveau et du foie avec la même intensité, mais comme P1C10-Cy5 ne montre pas d'intérêt pour les ECM rénaux et cardiaques.

Ensuite, les scientifiques ont testé la réactivité croisée de P1C10 et de l'ECM du cerveau humain (des cryosections ont été utilisées). La liaison de P1C10-Cy5 à l'ECM du cerveau humain ressemble à une image du même processus, mais impliquant le cerveau de la souris ( 2b ). P1C10-Cy5 s'est également lié avec succès à l'ECM dans les cryosections d'un échantillon de glioblastome humain ( 2c ).


Image n ° 2b-e

Compte tenu de ces observations, les scientifiques ont mesuré l' affinité de * P1C10.

Affinité * - la capacité d'une cellule à capturer et à lier certains produits chimiques.

En conséquence, la constante de dissociation (Kd) pour la liaison à bEnd.3 ECM était de 48,38 ± 6,05 nM ( 2d ).

Suite à cela, les scientifiques ont décidé de vérifier si le P1C10 s'accumulerait dans les endroits de destruction du BBB dans le cerveau de la souris.

Modifiés par un colorant proche infrarouge IR800, les clones P1C10 ou RBC36 ont été introduits chez des souris de laboratoire saines dans un volume de 1 mg / kg Le RBC36 est un VLR qui reconnaît le trisaccharide de l'antigène H humain, c'est pourquoi il a été utilisé comme contrôle d'isotype.

Ensuite, des souris ont reçu une injection intraveineuse de mannitol (alcool hexahydrique) pour ouvrir temporairement le BBB. Après cela, des images cérébrales ont été prises de souris pour identifier les signaux IR800 (image ci-dessous).


Image n ° 3

Une analyse comparative a montré que l'accumulation de fluorescence dans le cerveau (concentration de la substance d'essai marquée avec un colorant IR800) lors de l'utilisation de P1C10-IR800 est 3,3 fois plus élevée qu'avec RBC36-IR800 et 7,6 fois plus élevée qu'avec une solution saline. Par conséquent, P1C10 s'accumule sélectivement dans le cerveau après un dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique.

Ensuite, les scientifiques ont décidé de vérifier si le VLR ciblerait la matrice extracellulaire nue. Pour cela, deux modèles ont été créés à partir de cellules murines GL261 et de glioblastome humain U87, qui ont été introduites dans le cerveau de souris expérimentales. En conséquence, des tumeurs se sont formées avec un système vasculaire chaotique et des troubles ponctuels de la barrière hémato-encéphalique.

Du P1C10 ou du RBC36 dans un volume de 1 mg / kg a été administré par voie intraveineuse à des souris atteintes d'un glioblastome GB261 intégré. Après 30 minutes, des échantillons de cerveau ont été prélevés pour analyser et visualiser le signal IR800 (colorant pour P1C10 ou RBC36).


Image n ° 4

L'intensité de fluorescence moyenne dans la région tumorale de GL261 chez les souris injectées avec P1C10-IR800 était 112 fois plus élevée que dans la région controlatérale (opposée) du cerveau ( 4a ). Mais lors de l'utilisation du RBC36-IR800, l'intensité de fluorescence de la région tumorale n'était que 9 fois supérieure à l'intensité de la région opposée.

De plus, il a été constaté que l'accumulation de P1C10-IR800 dans la tumeur elle-même est 13 fois plus élevée que l'accumulation de RBC36-IR800.

Ces observations ont confirmé la capacité de P1C10 à cibler sélectivement l'ECM dans les tumeurs de souris. Il fallait maintenant tester ce talent sur des tumeurs cérébrales humaines.

VLR a été administré à des souris atteintes de U87 (tumeur cérébrale humaine). Les scientifiques ont testé non seulement P1C10, mais également 192, qui ont montré une liaison sélective au côté basolatéral du système vasculaire du cerveau en plus des vaisseaux des reins et du foie, ainsi qu'à l'ECM.

P1C10, 192 ou RBC36 dans un volume de 3 mg / kg a été administré par voie intraveineuse et laissé circuler librement pendant 30 minutes. Après cela, des échantillons d'organes d'intérêt ont été prélevés pour visualiser les résultats.

Les deux clones VLR (P1C10 et 192) ont montré une accumulation aux frontières de la tumeur, P1C10 étant distribué à travers l'ECM de la tumeur ( 4b ). Mais 192 pour la plupart était concentré à l'extérieur des gros vaisseaux tumoraux.

Aucun des clones VLR ne s'est accumulé dans l'hémisphère controlatéral sain du cerveau de la souris. Et le RBC36 était complètement absent à la fois dans les parties saines et dans les parties du cerveau contenant des tumeurs.

Une analyse quantitative a montré que P1C10 s'accumule dans la tumeur U87 21,2 fois plus que dans la région controlatérale du cerveau, 21,2 fois les reins, 15,9 fois le foie et 29,6 fois le cœur.

L'accumulation de P1C10 et 192 dans les régions tumorales était 25,4 et 11,9 fois supérieure à l'accumulation de RBC36. Dans le même temps, les deux clones VLR se sont principalement accumulés dans les zones de défauts vasculaires de la tumeur.

Ces observations confirment l'efficacité de P1C10 et sa concentration sélective sur l'ECM cérébrale. Il reste à voir si le P1C10 peut délivrer efficacement les médicaments là où ils en ont besoin.

Les scientifiques ont utilisé le VLR en conjonction avec des liposomes chargés de doxorubicine, qui est hautement visualisé grâce à leur propre fluorescence, ce qui simplifie considérablement le processus d'analyse de l'efficacité du VLR. Les liposomes ont été obtenus avec un diamètre moyen de 94,2 nm et une teneur en doxorubicine de 1 à 2 mg / ml. Ensuite, des clones VLR ont été attachés aux liposomes, qui ont conservé leur activité de liaison après combinaison (image n ° 5).


Image n ° 5

Pour démontrer la faisabilité du traitement des liposomes chargés de doxorubicine ciblant les VLR, les cellules tumorales U87 (cultivées sur bEnd.3 ECM) ont été incubées avec des liposomes chargés de doxorubicine ciblant P1C10 ou RBC36.

Les observations ont montré une croissance significative des cellules détruites par des liposomes ciblant P1C10. La concentration efficace demi-maximale était de 199,0 ± 1,7 nM pour P1C10 et 3312,0 ± - 2,6 pour RBC36.


Image n ° 6

Et enfin, les scientifiques ont testé l'utilité thérapeutique potentielle de cibler une matrice extracellulaire du cerveau pathologiquement endommagée. Pour cela, des liposomes chargés de doxorubicine en combinaison avec P1C10, 192 ou RBC36 ont été utilisés chez des souris expérimentales avec des cellules cancéreuses U87.

Comme on peut le voir sur les images 6a et 6b , le signal de la doxorubicine est beaucoup plus fort lors de l'utilisation de P1C10. On peut voir que ce signal est suffisamment localisé dans la tumeur et n'affecte pas la région controlatérale (saine) du cerveau.

Les images 6c et 6d montrent que l'accumulation de P1C10 dans la région tumorale est 7,6 fois plus élevée que dans la région saine. Si nous comparons le degré d'accumulation de P1C10 avec RBC36, alors la différence est de 7,9 fois en faveur de P1C10.

Pendant 4 semaines (aux jours 7, 14, 21 et 28), 12 mg / kg de doxorubicine ont été administrés à des souris expérimentales avec U87 en utilisant P1C10, 192 ou RBC36.

Après l'introduction de la tumeur, la survie médiane était de: 43 jours pour P1C10, 30 jours pour 192 et 28 jours pour RBC36.

Un groupe de sujets atteints de P1C10 a montré une augmentation significative de la survie par rapport aux deux autres groupes. Dans le même temps, les indicateurs 192 et RBC36 ne diffèrent pas significativement des indicateurs des groupes témoins qui n'ont pas du tout été traités.

Pour une connaissance plus détaillée des nuances de l'étude, je vous recommande de consulter le rapport des scientifiques .

Épilogue

Il n'y aurait pas de bonheur, mais le malheur a aidé. Avec cette phrase, vous pouvez décrire assez précisément cette étude. Les scientifiques ont utilisé les troubles pathologiques de la barrière hémato-encéphalique comme un outil pour administrer des médicaments à certaines zones du cerveau touchées par une tumeur, tout en évitant les zones saines. Et les scientifiques ont reçu de l'aide dans cette entreprise complexe et noble, comme ils disent, d'où ils n'ont pas attendu. Les lamproies des lymphocytes à récepteurs variables (VLR) sont devenues la base de ce travail. Maintenant, il est sûr de dire que même les parasites peuvent être utiles.

Le traitement des tumeurs cérébrales est semé d'une énorme liste de difficultés, et le succès de ce processus n'est pas aussi grand que nous le souhaiterions. La création de nouvelles méthodes et de nouveaux moyens pour lutter contre des maladies aussi graves est vraiment la raison d'être de la science. Connaissant le monde autour et à l'intérieur de nous-mêmes, nous n'allons pas à l'encontre de la volonté de la nature, nous commençons seulement à mieux le comprendre, à trouver de nouvelles connaissances et à les appliquer pour de bon.


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