Lauréat du prix Nobel Carey Mullis - inventeur de la réaction en chaîne de l'ADN polymérase

En Californie, à l'âge de 74 ans, le prix Nobel américain de chimie Carey Mullis est décédé. Selon sa femme, le décès est survenu le 7 août. La raison en est une insuffisance cardiaque et respiratoire due à une pneumonie.

James Watson, le découvreur de la molécule d'ADN, nous parlera de sa contribution à la biochimie et de ce qu'il a reçu le prix Nobel.

Extrait du livre de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis

ADN L'histoire de la révolution génétique

Chapitre 7. Le génome humain. Script de vie

...
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été inventée en 1983 par le biochimiste Cary Mullis, qui travaillait chez Cetus. La découverte de cette réaction a été assez remarquable. Mullis se souvient plus tard: «Une fois un vendredi soir d'avril 1983, il m'a semblé s'illuminer. Je conduisais, roulant sur une route de montagne sinueuse au clair de lune vers le nord de la Californie, à la lisière des forêts de séquoias. » Il est impressionnant que ce soit dans une telle situation qu'il ait été visité par inspiration. Et ce n'est pas du tout que dans le nord de la Californie, il existe des routes spéciales qui favorisent la perspicacité; c'était juste que son ami avait vu Mullis se précipiter imprudemment le long d'une route à deux voies glacée et cela ne le dérangeait pas du tout. Un ami a déclaré au New York Times ce qui suit: «Mullis rêvait qu'il mourrait en s'écrasant sur le séquoia. Par conséquent, il n'a pas peur de conduire quoi que ce soit si les séquoias ne poussent pas le long de la route. » La présence de séquoia le long de la route a permis à Mullis de se concentrer et ... la voici, un aperçu. Pour son invention en 1993, Mullis a reçu le prix Nobel de chimie et est depuis devenu encore plus étranger dans ses actions. Par exemple, il est partisan de la théorie révisionniste selon laquelle le sida n'est pas lié au VIH, ce qui a considérablement sapé sa propre réputation et empêché les médecins.

La PCR est une réaction assez simple. Pour le réaliser, nous avons besoin de deux amorces synthétisées chimiquement complémentaires aux extrémités opposées des différentes chaînes du fragment d'ADN souhaité. Les amorces sont de courtes sections d'ADN simple brin, chacune d'environ 20 paires de bases de long. La particularité des amorces est qu'elles correspondent aux régions d'ADN que vous souhaitez amplifier, c'est-à-dire la matrice d'ADN.


(Image cliquable) Cary Mullis, inventeur de la PCR

La spécificité de la PCR repose sur la formation de complexes complémentaires entre la matrice et les amorces, des oligonucléotides synthétiques courts. Chacune des amorces est complémentaire de l'une des chaînes de la matrice double brin et limite le début et la fin de la région amplifiée. En fait, la «matrice» résultante représente un génome entier, et notre objectif est d'en isoler des fragments qui nous intéressent. Pour cela, la matrice d'ADN double brin est chauffée à 95 ° C pendant plusieurs minutes afin que les chaînes d'ADN soient dispersées. Cette étape est appelée dénaturation, car les liaisons hydrogène entre les deux chaînes d'ADN sont détruites. Lorsque les chaînes sont ouvertes, la température est abaissée afin que les amorces puissent entrer en contact avec le modèle à chaîne unique. L'ADN polymérase commence la réplication de l'ADN en se liant à une longueur d'une chaîne nucléotidique. L'enzyme ADN polymérase réplique la chaîne matrice en utilisant une amorce comme exemple de graine ou de copie. À la suite du premier cycle, nous obtenons un doublement séquentiel multiple d'une région d'ADN spécifique. Ensuite, nous répétons cette procédure. Après chaque cycle, nous obtenons la zone cible en double quantité. Après vingt-cinq cycles de PCR (c'est-à-dire en moins de deux heures), nous avons une région d'ADN d'intérêt en quantité 225 fois plus grande que l'original (c'est-à-dire que nous l'avons amplifiée environ 34 millions de fois). En fait, à l'entrée, nous avons obtenu un mélange d'amorces, d'ADN matrice, d'enzyme ADN polymérase et de bases libres A, C, G et T, la quantité de produit de réaction spécifique (limitée par les amorces) augmente de façon exponentielle, et le nombre de copies d'ADN "longues" est linéaire, donc les produits de réaction dominent.


Amplification d'un site d'ADN souhaité: amplification en chaîne par polymérase

A l'aube de la PCR, le problème principal était le suivant: après chaque cycle de chauffage-refroidissement, de l'ADN polymérase devait être ajoutée au mélange réactionnel, car il était inactivé à 95 ° C. Il a donc fallu le rajouter avant chacun des 25 cycles. La procédure de réaction a été relativement inefficace, elle a nécessité beaucoup de temps et l'enzyme polymérase, et le matériau est très coûteux. Heureusement, Mère Nature est venue à la rescousse. De nombreux animaux se sentent à l'aise à des températures bien supérieures à 37 ° C. Et pourquoi le chiffre de 37 ° C est-il devenu important pour nous? Cela est dû au fait que cette température est optimale pour E. coli, à partir de laquelle l'enzyme polymérase pour la PCR a été initialement obtenue. Dans la nature, il existe des micro-organismes dont les protéines sont devenues plus résistantes aux températures élevées au cours de millions d'années de sélection naturelle. Il a été proposé d'utiliser des ADN polymérases de bactéries thermophiles. Ces enzymes étaient thermostables et pouvaient résister à de nombreux cycles de réaction. Leur utilisation a permis de simplifier et d'automatiser la PCR. L'une des premières ADN polymérases thermostables a été isolée de la bactérie Thermus aquaticus qui vit dans les sources chaudes du parc national de Yellowstone et s'appelle Taq polymérase.

La PCR est rapidement devenue le cheval de bataille principal du projet du génome humain. En général, le processus ne diffère pas de celui développé par Mullis, il vient d'être automatisé. Nous ne dépendions plus de la foule d'étudiants diplômés aux yeux aveugles versant minutieusement des gouttelettes de liquide dans des tubes en plastique. Dans les laboratoires modernes effectuant des recherches en génétique moléculaire, ces travaux sont effectués sur des convoyeurs robotisés. Les robots de PCR impliqués dans un projet de séquençage à grande échelle tel que le génome humain travaillent sans relâche avec d'énormes volumes de polymérase résistant à la chaleur. Certains scientifiques travaillant dans le projet du génome humain ont été scandalisés par les contributions excessivement élevées que le titulaire du brevet de PCR, le géant industriel et pharmaceutique européen Hoffmann-LaRoche, ajoute au coût des consommables.

Une autre «force motrice» était la méthode de séquençage de l'ADN elle-même. La base chimique de cette méthode à cette époque n'était plus une nouveauté: le Génome Humain du Projet Interstate (HGP) a adopté la même méthode ingénieuse que Fred Senger a développée au milieu des années 1970. L'innovation réside dans l'ampleur et le degré d'automatisation obtenus lors du séquençage.

Le séquençage automatique a été initialement développé au laboratoire de Lee Hood au California Institute of Technology. Il est diplômé du lycée du Montana et a joué au football américain comme attaquant; grâce à Hood, l'équipe a remporté le championnat d'État plus d'une fois. Les compétences en travail d'équipe lui ont été utiles dans sa carrière scientifique. Le laboratoire de Hood employait une entreprise hétéroclite de chimistes, de biologistes et d'ingénieurs, et bientôt son laboratoire est devenu un chef de file de l'innovation technologique.

En fait, la méthode de séquençage automatique a été inventée par Lloyd Smith et Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, qui a ensuite travaillé dans le laboratoire de Hood, s'est tourné vers Lloyd Smith, lui offrant une méthode de séquençage améliorée dans laquelle les bases de chaque type seraient peintes chacune dans sa propre couleur. Une telle idée pourrait quadrupler l'efficacité du processus Senger. Sanger, lors du séquençage dans chacun des quatre tubes (selon le nombre de bases) avec la participation de l'ADN polymérase, forme un ensemble unique d'oligonucléotides de différentes longueurs, y compris une séquence d'amorce. Ensuite, du formamide a été ajouté aux tubes pour séparer les chaînes et une électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été effectuée sur quatre pistes. Dans la variante Smith et Hunkapiller, les didésoxynucléotides sont marqués avec quatre colorants différents et la PCR est effectuée dans un tube. Ensuite, pendant l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, un faisceau laser à un emplacement spécifique dans le gel excite l'activité des colorants et le détecteur détermine quel nucléotide migre actuellement à travers le gel. Au début, Smith était pessimiste - il avait peur que l'utilisation de doses ultra-faibles du colorant conduise au fait que les régions nucléotidiques seraient indiscernables. Cependant, étant bien familiarisé avec les technologies laser, il a rapidement trouvé une issue en utilisant des colorants fluorochromes spéciaux qui fluorescent sous l'influence du rayonnement laser.


(Version complète par clic - 4,08 Mo) Petits caractères: séquence d'ADN décodée à l'aide d'un séquenceur automatique obtenu à partir d'une machine de séquençage automatique. Chaque couleur a l'une des quatre bases.

Dans la version classique de la méthode Sanger, l'un des brins de l'ADN analysé agit comme une matrice pour la synthèse d'un brin complémentaire par l'enzyme ADN polymérase, puis la séquence des fragments d'ADN est triée par taille de gel. Chaque fragment qui est inclus dans l'ADN pendant la synthèse et permet ensuite la visualisation des produits de la réaction est marqué avec un colorant fluorescent correspondant à la base terminale (cela a été discuté à la page 124); par conséquent, la fluorescence de ce fragment sera un identifiant pour une base donnée. Il ne reste alors plus qu'à effectuer la détection et à visualiser les produits de la réaction. Les résultats sont analysés à l'aide d'un ordinateur et présentés comme une séquence de pics multicolores correspondant à quatre nucléotides. En outre, les informations sont transmises directement au système informatique, ce qui élimine le processus de saisie de données long et parfois pénible, ce qui complique considérablement le séquençage.

»Plus d'informations sur le livre sont disponibles sur le site Web de l'éditeur
» Contenu
» Extrait

Pour Khabrozhiteley 25% de réduction sur le coupon - PCR