John Lewis à la conférence Undoing Aging 2018

Oisin Biotechnologies est l'une des nombreuses entreprises qui sont apparues dans notre communauté de sympathisants et de chercheurs liés à la Fondation Methuselah et à la Fondation de recherche SENS .

Les représentants de l'Oisine travaillent sur une plateforme qui peut détruire sélectivement les cellules en fonction de l' expression de protéines spécifiques par ces cellules. Leurs objectifs initiaux sont les cellules sénescentes et les cellules cancéreuses. Premièrement, ils vont apporter une thérapie anticancéreuse aux essais cliniques, car les traitements efficaces contre le cancer sont plus faciles à réguler que de nombreuses autres thérapies.

Cela leur permettra de réutiliser la technologie, en se préparant pour des essais ultérieurs de thérapie sénolytique , capables de nettoyer de nombreuses cellules sénescentes de différents tissus. Lors de la conférence Undoing Aging organisée par la SENS Research Foundation et Forever Healthy Foundation au début de 2018, Oisin Biotechnologies CSO John Lewis parle de leur technologie et de leurs nouveaux résultats.

Performances

Bonsoir à tous! C'est très agréable d'être à cette réunion. Je remercie sincèrement Aubrey de Gray et Michael Greve pour l'invitation. Je ne pourrais même pas demander une meilleure séquence, car l'orateur précédent a fait un travail fantastique en soulignant les raisons pour lesquelles les cellules sénescentes sont importantes et pourquoi elles sont un tel problème. Je suis un scientifique universitaire en oncologie et un débutant dans le domaine du vieillissement, même si j'ai beaucoup d'expérience dans la destruction des cellules, et j'aimerais en parler maintenant: comment Oisin Biotechnologies développe une thérapie très sélective pour la destruction des cellules sénescentes et du cancer.

Je ne parlerai pas beaucoup de ce que sont les cellules sénescentes, ni de ce qu'elles font. En quelques mots, ce sont des cellules qui apparaissent dans le corps, en réaction aux stress externes - stress oxydatif, stress génotoxique , et elles inhibent principalement le développement du cancer. Il est également important de noter que lorsque les cellules deviennent sénescentes, elles envoient également des signaux qui se propagent dans le corps . Je répète que nous n'avons pas de marqueurs universels des cellules sénescentes. Il existe des caractéristiques communes que nous pouvons utiliser dans leur reconnaissance.

Par exemple, l'accumulation d' enzymes actives dans les lysosomes . Nous pouvons colorer la β-galactosidase active. Mais en fait, c'est une population très hétérogène, et ils se présentent de différentes manières. Je ne veux pas m'attarder sur les connexions, je souligne simplement que le déclenchement de l' achèvement du cycle cellulaire est régi par plusieurs facteurs: p16 , p21 , p53 . Nous y avons réfléchi et demandé: quelles sont les voies communes que nous pourrions chercher à créer une thérapie ciblée qui élimine ces cellules? Je n'ai pas besoin de répéter que si les cellules sénescentes sont impliquées dans le processus de vieillissement, il existe également des maladies très spécifiques qui sont des symptômes du vieillissement et qui peuvent être traitées cliniquement avec les mêmes techniques.

C'était un point important dans la dernière conversation que p16 peut ne pas être toute l'histoire. Mais vous devez regarder les données qui ont été étudiées au cours des dernières années - et cela m'a vraiment convaincu - que, bien sûr, toutes les cellules sénescentes peuvent ne pas exprimer p16, mais dans le modèle de souris, il est très clair que si vous le concevez de telle manière que vous pourriez détruire sélectivement toutes les cellules exprimant p16, vous obtiendrez des changements phénoménaux dans le phénotype. Pour moi, c'était très impressionnant.

Par exemple, le travail de John van Deyrsen , dans lequel il y avait des souris génétiquement modifiées exprimant un gène suicidaire entraîné par le promoteur p16, en utilisant le système dit INK-ATTAC caspase-9 , qui leur permet d'utiliser un dimériseur qui active l'apoptose dans les cellules qui expriment p16. Et ces souris ont montré des changements phénoménaux dans leur phénotype. Améliorations significatives de la santé, augmentation de 25% de l'espérance de vie moyenne, 50% de cancer en moins, ainsi que des changements fonctionnels: une diminution de la formation de cataracte , une diminution de la faiblesse et une diminution de la perte de cheveux.

Je vais montrer, en guise d'introduction à ma conférence, quelques données récemment publiées. Ils m'ont fait penser que cela valait la peine en tant que thérapie - c'est le travail de Peter de Keyser , publié l'année dernière, utilisant les mécanismes p53 et FOXO4 . Il a pu utiliser un modèle de vieillissement accéléré, les souris qui perdent leurs cheveux deviennent faibles et a montré que l'élimination des cellules sénescentes après que ces changements se soient déjà produits peut les changer. Pour moi, cela a vraiment confirmé le fait que la destruction des cellules sénescentes est la bonne voie de développement.

C'est donc le fondement de la technologie Oisin. En tant que groupe d'ingénierie, nous avons pensé, même pendant le développement de la thérapie que nous pouvons utiliser dans le traitement d'une maladie spécifique, nous avons pensé au vieillissement en général et à la façon dont cela pourrait être utilisé à l'avenir après avoir vérifié l'efficacité clinique. Ainsi, nous avons voulu utiliser une stratégie similaire, en utilisant des modèles animaux modernes développés à notre époque. Nous voulions développer quelque chose qui a un faible profil de toxicité qui est bien toléré, et quelque chose qui peut être répété cycliquement. Quelque chose qui n'est pas immunogène et qui n'a aucun effet secondaire. De toute évidence, de nombreux phénotypes vieillissants sont spécifiques aux tissus, et la capacité de cibler la thérapie sur différents tissus serait un avantage.

Ce que je vais vous dire aujourd'hui, c'est la technologie Oisin que nous avons développée. Il s'agit de la plateforme SENSOlytic . Il s'agit d'une plateforme de nanoparticules lipidiques (LNP) qui contient un plasmide d'ADN non intégrable. Il est conçu pour être activé par un dimériseur chimique qui déclenche une réponse apoptotique très rapide et irréversible. Peut-être la partie la plus importante de cela est le système d'administration de médicaments - la capacité de livrer l'ADN plasmidique par voie systémique à différents tissus sans toxicité significative. Oisin a développé une technologie à base de plasmides polyvalente et, contrairement à l'ARN d'interférence ou à l'ARN messager , les plasmides peuvent être élégamment conçus pour ne s'activer que lorsqu'une voie spécifique, telle que p16, p21 ou p53, est activée. Mais ils peuvent également être conçus avec des amplificateurs ou des répresseurs et cibler des tissus ou des maladies spécifiques. Nous avons créé un système et une bibliothèque de conceptions qui sont actives dans diverses conditions. Deux d'entre eux, que je vais vous montrer aujourd'hui, sont des versions des promoteurs p16 et p53, y compris des gènes suicidaires.

Nous avons créé une bibliothèque de plasmides, qui sont essentiellement un promoteur sélectif spécifique associé au gène suicidaire induit par iCas9, qui est ensuite incorporé ou dimérisé à l'aide d'un dimériseur chimique. Beaucoup d'entre vous l'ont peut-être déjà vu, mais iCas9 est une caspase modifiée, elle a donc été tronquée, le domaine d'inclusion a été supprimé et remplacé par le domaine de dimérisation FKBP . Ces zones interagissent très fortement avec le dimériseur chimique AP20187 ou son analogue clinique AP1903, qui est sûr, comme cela a été démontré lors des essais cliniques de phase II. Ce qui est vraiment bien dans ce système, c'est que vous n'exprimez que temporairement les gènes de votre plasmide dans des cellules avec une expression active de p16 ou p53 dans notre cas. Et rien ne se passe jusqu'à ce que vous ajoutiez un dimériseur. Le dimériseur de faible poids moléculaire est très bien toléré, sature tous les tissus en quelques minutes et provoque une réponse apoptotique irréversible. iCas9 se dimérise dans ces conditions, s'auto-clive, active la formation d' apoptosomes et provoque une mort cellulaire très rapide en 2 à 3 heures. Les cellules ne peuvent pas résister à cela. Ils ne peuvent pas évoluer ou autrement y résister.

Certaines de nos études in vitro ont utilisé la lignée cellulaire myofibroblastique placentaire IMR-90. Dans ce cas, nous avons induit la sénescence en utilisant 10 degrés d' irradiation et les cellules transfectées en utilisant iCas9. iCas9 est légèrement inférieur à la caspase-9 et peut être détecté avec des anticorps anti -caspase-9. Dans les cellules qui n'ont pas été irradiées, il n'y avait aucune expression d'iCas9. Dans les cas où les cellules deviennent sénescentes en exprimant p16, l'induction iCas9 commence et lorsque nous ajoutons un petit dimériseur à ces cellules, il disparaît. La culture est très rapidement débarrassée de ces cellules. Ensuite, lorsque nous examinons la capacité de tuer ces cellules, nous voyons dans les tests de viabilité que chaque cellule qui est transfectée avec succès avec un plasmide meurt. Nous avons mené d'autres expériences. Je montre juste un exemple dans lequel nous utilisons la cytométrie en flux , et nous confirmons que nous provoquons l'apoptose dans ces cellules.

Ainsi, nous avons un plasmide très sélectif pour les cellules exprimant p16. On peut les tuer très rapidement en ajoutant un dimériseur. La question est de savoir comment transformer cela en une thérapie qui fonctionne chez l'homme. Besoin d'un mécanisme de livraison, très efficace et sûr. Nous avons décidé d'utiliser des nanoparticules lipidiques. Les nanoparticules lipidiques sont utilisées depuis de nombreuses années, et je dirais qu'il y a eu beaucoup de promesses et d'investissements, et très peu de succès. Alnylam Pharmaceuticals à Boston a récemment mené avec succès un essai de phase III avec une préparation d'ARNm, et le problème est que les nanoparticules lipidiques s'accumulent généralement dans le foie et leur mécanisme de livraison d' acide nucléique aux cellules utilise une charge positive. Il s'agit d'une technologie très simple. Ils ont créé des lipides avec une charge positive. Si vous utilisez une charge positive, ils perforent très facilement les trous dans les membranes et vous pouvez déposer efficacement le matériau dans les cellules, sauf qu'ils sont très toxiques. Ainsi, ils ont une dose sûre très faible.

En réponse à cela, plusieurs sociétés ont développé ce que l'on appelle le lipide cationique conditionnel . Ce lipide , généralement neutre dans la circulation sanguine, pénètre dans les endosomes et devient cationique dans un environnement acide. Ils font l'objet de programmes en cours qui passent par des essais cliniques de nanoparticules lipidiques. Ils fonctionnent, mais ils sont toujours très toxiques. Un système de livraison idéal est un système qui peut utiliser des lipides neutres avec un mécanisme alternatif pour la livraison cellulaire d'acides nucléiques. Je vais vous dire un peu comment nous en sommes venus à lui. Si vous avez une nanoparticule lipidique et qu'elle doit pénétrer à l'intérieur de la cellule, elle doit traverser la membrane plasmique avec toute sa protection. Les virus ont évolué au cours de millions d'années, résolvant ce problème, et ont développé de nombreuses protéines fusogènes . Ces protéines sont belles, gigantesques et élégantes, et la façon dont elles connectent les membranes ensemble, créent des pores et mélangent les lipides est vraiment fantastique, mais vous ne pouvez pas les attacher à une nanoparticule lipidique, car ce sont de grosses protéines avec des centres actifs géants et une immunogénicité élevée.

Heureusement, un scientifique canadien a étudié ces orthorevirus fusogéniques toute sa vie et a découvert qu'ils n'utilisent pas la protéine fusogénique pour pénétrer dans les cellules, mais dès qu'ils pénètrent dans les cellules, ils provoquent une fusion rapide de toutes les cellules qui les entourent. Il a passé sa carrière à caractériser cette classe de protéines transmembranaires liées à la fusion, qui sont deux ordres de grandeur plus petites que la plus petite protéine fusogène exprimée par d'autres virus, mais suffisantes pour initier la fusion des cellules et, surtout, des nanoparticules et cellules lipidiques.

Lorsque ces protéines sont incluses dans une plate-forme basée sur des nanoparticules lipidiques neutres, vous constaterez que les lipides neutres seuls sont extrêmement pauvres pour délivrer la charge. Dans notre exemple, nous utilisons le plasmide mCherry contre les cellules cancéreuses, et donc sans protéines fusogènes, il n'y a pas de livraison du tout, et avec elles, nous obtenons une livraison fantastique. Ainsi, ils augmentent la livraison d'une particule lipidique neutre de 80 à 350 fois, et ils sont bien tolérés in vivo . Dans une expérience avec la luciférase, nous injectons de l'ARNm exprimant la luciférase dans la veine caudale. Nous obtenons l'expression de la luciférase dans tout le corps. Nous remarquons une accumulation dans les poumons et le foie, mais nous obtenons une bonne expression dans de nombreux tissus, y compris la peau et les tissus mous dans tout le corps.

Nous utilisons notre plateforme pour fournir une charge utile contre les cellules sénescentes. La plateforme s'appelle Fusogenix . Il utilise une nanoparticule lipidique neutre, non toxique et bien tolérée. Et elle utilise ces protéines fusogènes pour entrer dans la cellule. Je ne veux pas entrer dans toutes les petites choses. Il nous a fallu trois ans pour créer des anticorps contre ces protéines, elles sont vraiment non immunogènes. La raison en est que la plupart d'entre eux sont des domaines transmembranaires. Ils sont lipophiles , ils emballent donc les lipides autour d'eux et ne sont pas immunogènes. Nous avons passé beaucoup de temps à améliorer ces protéines fusogènes pour les améliorer. Je ne vais pas me plonger dans toutes les petites choses, mais maintenant nous avons une plate-forme pour leur production industrielle en grande quantité et lyophilisation , et nous pouvons les envoyer sur demande pour utilisation.

Permettez-moi de vous montrer les données obtenues dans une expérience - dans laquelle ils ont pris la caspase-9 p16 activée et l'ont introduite chez la souris. Dans ce cas, nous avons mené une expérience avec 16 souris, un groupe de souris âgées de 80 semaines. Nous les avons divisés en trois groupes, nous leur avons présenté le LNP témoin, sans dimériseur, ou deux doses, 5 et 10 mg / kg - et 10 mg / kg - c'est une grande dose. Nous avons traité ces animaux une fois par injection dans la veine caudale. Nous avons attendu 96 heures, puis introduit un dimériseur, également par voie intraveineuse. Ensuite, nous avons attendu deux jours de plus, collecté des tissus, du sang, effectué une RT-PCR sensible et l'avons contrôlée avec plusieurs gènes. Nous avons reçu une diminution convaincante, dépendante de la dose, de l'expression de p16 dans divers tissus.

Je vais vous montrer quelques images où nous passons beaucoup de temps à optimiser la coloration β-gal chez la souris. Ce sont les meilleures images que nous avons, mais dans plusieurs tissus, nous avons reçu une diminution dose-dépendante de l'expression de la β-galactosidase. Information très encourageante. Bien sûr, travailler en laboratoire est bien, mais si nous voulons le traduire en personnes, il y a beaucoup de choses à clarifier. La toxicologie est extrêmement importante. Ceci est important pour un médicament que vous êtes sur le point d'effectuer de manière cyclique pour vous assurer que votre corps ne forme pas d'anticorps neutralisants. Ainsi, nous avons mené de nombreuses études sur les doses répétées, et nous n'avons enregistré aucun anticorps, nous pouvons donc le donner à doses répétées sans aucune diminution de l'efficacité. CARPA est quelque chose que j'ai récemment appris, une pseudo-allergie activée de manière complémentaire , une réponse immunitaire que de nombreux patients recevant une thérapie par nanoparticules comme le doxil peuvent avoir . Nous avons effectué toutes les analyses et elles ont un profil plus bas que le doxil, elles sont donc très bien tolérées.

Je suis heureux de dire que nous avons mené plusieurs études pilotes sur des primates, que nous leur avons administré une dose humaine maximale dix fois supérieure et qu'elle a été très bien tolérée. Ces singes ont en fait reçu un traitement, à la fois p53 et p16, séparément et en combinaison, et un dimériseur, donc nous comptons sur de bonnes données. Maintenant, nous y travaillons.

La tolérance de ces particules est très importante. Je montre cette diapositive car elle montre tous les efforts déployés dans les essais cliniques des nanoparticules lipidiques et pourquoi elles ont échoué. Si vous regardez les trois premiers programmes, ils étaient prometteurs il y a dix ans en utilisant des liposomes cationiques et des nanoparticules lipidiques. Vous pouvez voir que leur dose maximale tolérée est inférieure à 1 mg / kg, et ces programmes ont tous échoué en raison de la toxicité hépatique. La deuxième génération, les lipides conditionnellement cationiques, ils ont été transférés dans une plus ou moins grande mesure, et certains de ces programmes ont été couronnés de succès et vont conduire à l'approbation de médicaments, mais tous les objectifs sont le foie. À mesure que les nanoparticules lipidiques s'accumulent dans le foie, vous constaterez une toxicité limitant la dose si vous n'utilisez pas une composition lipidique neutre. Ensuite, vous pouvez voir le travail en utilisant une composition lipidique neutre comme la nôtre, et ils n'ont pas pu trouver la dose maximale tolérée dans une étude. Sur la base de nos études sur les primates non humains, nous nous attendons à ce que nos particules soient également tolérables.

Nous évaluons actuellement diverses constructions pour trouver celle qui est la mieux utilisée sur les humains, et nous en avons évidemment parlé lors de cette conférence - la création de biomarqueurs qui sont de bons indicateurs d'essais cliniques, ainsi que dans des modèles animaux pour évaluer l'efficacité. Nous voulons vraiment parler avec tous les scientifiques qui ont un bon biomarqueur. Nous avons des groupes de souris dans lesquels nous examinons la durée de vie et la santé de ces souris. Nous envisageons de passer à la phase clinique lorsque nous aurons l' analyse de toxicité GMP et GLP .

Par conséquent, je vais passer au cancer, car c'est notre principal moyen d'aller à la clinique. Mon travail principal est d'étudier le cancer de la prostate . Une chose qui m'a vraiment intrigué avec le lien entre le vieillissement et le cancer est l'activation de la voie p53. Le gène p53 est le gène le plus muté dans le cancer, et il existe de nombreux types de cancer qui ont une charge mutationnelle élevée dans p53. Je prends la prostate car elle a des taux bas, ils représentent en moyenne 10%, la plupart des cancers de la prostate sont à faible mobilité.Dès que vous obtenez une maladie métastatique , ce taux de mutation est supérieur à 50%. C'est donc un bon objectif dans le traitement du cancer. Bien que la protéine p53 elle-même n'ait pas encore été ciblée dans les thérapies contre le cancer, je pense qu'elles sont très prometteuses. En p53, vous pouvez obtenir deux types de mutations. Au cours de la réplication ou des mutations cellulaires, ils activent p53 pour réparer les dommages ou subir une apoptose. Par conséquent, les cellules mutent ou se débarrassent de p53 pour le contourner. En conséquence, les chemins d'activation réels sont très réglementés. Cette activation peut-elle donc être utilisée pour tuer les cellules cancéreuses?

in vitro , , in vivo , . , . p53, iCas9, . . NOD/SCID . 500 ³ . , , . , 90-95% 48 – , , , , .

La vraie preuve est la capacité de faire des injections systémiques, et nous avons mené ces études. Ceci est juste un exemple de quatre souris dans ce groupe. Nous avons fait croître ces très grosses tumeurs, en les faisant atteindre une taille de 500 mm ³ . Dans ce cas, nous faisons quatre injections quotidiennes de LNP dans la veine caudale et le cinquième jour, nous leur administrons systématiquement une dose de dimériseur. Encore une fois, nous avons vu des résultats remarquables: une réduction de la tumeur de 50 à 98% en seulement deux jours. Cela a conduit à une augmentation significative de la survie après une seule injection chez ces animaux. En moyenne, chez six souris par groupe, les volumes tumoraux sont réduits de près de 70%.

Une chose qui est très importante: les tumeurs primaires ne tuent pas les patients dans la plupart des cas. Il s'agit d'une maladie métastatique, nous sommes donc très intéressés de savoir si nous pouvons guérir le cancer métastatique. De toute évidence, nous prendrons de tels cas dans les premiers essais cliniques. Ainsi, nous avons fait un certain nombre de modèles qui étudient la capacité de la LNP à contrôler les maladies métastatiques, dans ce cas, nous avons un modèle de métastases systémiques du cancer de la prostate et un modèle de mélanome immunocompétent . Dans les deux cas, en mode réutilisable, nous avons pu contrôler efficacement cette maladie.

Nous sommes sur la bonne voie. Il est clair que l’objectif prometteur d’Oisin est de développer des agents qui tuent les cellules sénescentes. Mais je suis sûr qu'à court terme, il est très important, non seulement pour la technologie des nanoparticules, mais pour l'ensemble de la plateforme, de montrer sa sécurité et son efficacité en clinique. Ainsi, nous avons déjà développé un essai clinique de phase I / phase IIb pour le traitement du cancer, et maintenant nous nous préparons à tester la toxicologie des BPL, ce qui facilitera ces études. Nous espérons un IC par personne début 2019. Nous sommes heureux d'accélérer l'utilisation de cette technologie. Je mentionnerai également une chose importante: il existe de nombreux types de cancer dans lesquels il peut fonctionner. Au Canada, nous pouvons mener des essais de phase I avec tous les types de cancer, principalement le colorectal, la prostate, le poumon et autres. Nous rechercherons le plus grand succès dans le traitement et le cancer le plus important,pour être en mesure d'élargir ce groupe et de terminer la phase II.