Les virus résistants aux CRISPR construisent des abris pour protéger les génomes des enzymes pénétrant l'ADN

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Les bactéries et virus qui les infectent participent à leur propre course aux armements: aussi ancienne que la vie elle-même. L'évolution a donné aux bactéries un arsenal entier d'enzymes immunitaires, y compris des systèmes CRISPR-Cas qui peuvent détruire l'ADN viral. Mais les virus qui tuent les bactéries (phages) ont développé leurs propres outils avec lesquels vous pouvez surmonter les défenses bactériennes les plus redoutables.

Des scientifiques de l'Université de Californie ont découvert une merveilleuse nouvelle stratégie que certains phages utilisent pour se protéger contre les enzymes qui pénètrent dans leur ADN. Une fois les bactéries infectées, ces phages créent un abri impénétrable, une sorte de «salle de sécurité» dans le corps qui protège l'ADN phagique vulnérable des enzymes antivirales. Ce compartiment , très similaire au noyau cellulaire, peut être appelé le bouclier CRISPR le plus efficace jamais trouvé chez les virus.

Dans des expériences menées dans le laboratoire du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de Californie à San Francisco (UCSF), ces phages n'ont cédé à aucun des systèmes CRISPR. "C'était la première fois que quelqu'un découvrait des phages qui démontrent un tel niveau de résistance au CRISPR", a déclaré Joseph Bondi-Denomi, professeur agrégé de l'UCSF. Il a décrit sa découverte dans un article publié le 9 décembre 2019 dans la revue Nature .

Une chasse à l'ADN que CRISPR ne peut pas pénétrer

Joseph Bondi-Denomi a dirigé l'équipe de recherche qui a ouvert le «refuge» des phages

Pour trouver des phages résistants à CRISPR, les chercheurs ont sélectionné des virus de cinq familles différentes de phages et les ont utilisés pour infecter des bactéries communes qui ont été génétiquement modifiées pour déployer quatre enzymes Cas différentes, le composant pénétrant l'ADN des systèmes CRISPR.


L'enzyme de restriction HsdR (rouge), une protéine qui coupe normalement l'ADN du phage (bleu), ne peut pas pénétrer l'ADN. L'enveloppe nucléée assemblée par le phage entoure l'ADN du phage, créant une barrière qui rend le génome du phage inaccessible à l'HsdR et aux autres enzymes qui pénètrent dans l'ADN.

Ces bactéries améliorées par CRISPR ont émergé victorieuses contre la plupart des phages qu'elles ont rencontrés. Mais deux phages géants (ils ont obtenu leur nom parce que leurs génomes étaient 5 à 10 fois plus grands que les génomes des phages les plus étudiés) se sont avérés impénétrables pour les quatre systèmes CRISPR.

Les scientifiques ont décidé de mener des tests supplémentaires sur ces phages géants pour explorer les limites de leur résistance au CRISPR. Ils les ont exposés à des bactéries équipées d'un type complètement différent de CRISPR, ainsi qu'à des bactéries équipées de systèmes de restriction-modification . C'est-à-dire, une enzyme clivant l'ADN qui est plus courante que CRISPR (des systèmes de restriction se trouvent dans environ 90% des espèces bactériennes, alors que CRISPR n'est présent que dans environ 40%)%), mais ne peut cibler qu'un nombre limité de séquences d'ADN.

Les résultats étaient les mêmes qu'auparavant: les boîtes de Pétri étaient jonchées de restes détruits de bactéries infectées par un phage. Ces phages étaient résistants aux six systèmes immunitaires bactériens testés. Aucun autre phage n'en était capable.

Les phages géants semblaient presque indestructibles. Mais les expériences in vitro ont montré le contraire - l'ADN de phage géant était tout aussi vulnérable aux enzymes CRISPR et de restriction que tout autre ADN. La résistance au CRISPR, qui a été observée dans les cellules infectées par le phage, aurait dû résulter de quelque chose qui a produit des virus qui ont interféré avec le CRISPR. Mais qu'est-ce que ça pourrait être?


Modèle d'infection à Pseudomonas aeruginosa par le phage φKZ. Illustration: Mendoza et al., 2019.

L'anti-CRISPR semble être à blâmer. Ces protéines, découvertes pour la première fois par Bondi-Denomi en 2013, étaient de puissants inactivateurs CRISPR codés dans certains génomes de phages. Mais lorsque les chercheurs ont analysé les séquences du génome du phage géant, ils n'ont pas vu de trace d'anti-CRISPR. De plus, chaque anti-CRISPR connu ne peut désactiver que certains systèmes CRISPR, tandis que les phages géants étaient résistants à toutes les enzymes antivirales sécrétées en eux. Tout ce qui protégeait l'ADN du phage géant aurait dû être basé sur un autre mécanisme.

Bouclier imperméable de CRISPR

Les scientifiques étaient à perte et ont construit des modèles. Quelqu'un dans le cloud , certains sur papier. Après un grand nombre d'expériences, j'ai réussi à comprendre ce qui se passait. Lorsque les phages géants infectent les bactéries, ils créent un compartiment sphérique au milieu de la cellule hôte, qui inhibe les enzymes antivirales et fournit un "refuge" pour la réplication du génome viral.

Une découverte similaire a été faite en 2017 par deux autres scientifiques, Joe Polyano et David Agard. Ces chercheurs ont démontré que le génome du phage se réplique dans la membrane de type noyau. Mais jusqu'à présent, personne ne savait que l'obus sert également de bouclier impénétrable contre CRISPR.

Fait intéressant, la compartimentation est extrêmement rare chez les bactéries. Chez les virus, ce n'est pas supposé en principe. Et d'autant plus que le compartiment ressemblait tellement au noyau eucaryote. Cependant, vous y allez - c’est tout, le pseudo-cœur!


La bactérie Pseudomonas chlororaphis infectée par le phage 201φ2-1: photo (a) et reconstruction (b). Le pseudo-noyau est bleu, la capside collectée des particules virales est verte, les ribosomes sont jaunes.

Cependant, de nombreuses questions sur l'enveloppe et les virus qui la créent restent sans réponse, y compris les informations de base sur la protéine à partir de laquelle l'enveloppe de la "salle de sécurité" est fabriquée. Selon Joseph Bondi-Denomi, lors du séquençage de ces phages, son équipe a réussi à trouver l'une des protéines hypothétiques. Mais dans certains phages étroitement apparentés, une telle protéine n'a pas pu être détectée. De plus, on ne sait pas encore à quoi ressemble la structure de la protéine au niveau atomique.

Mais la protéine de l'enveloppe du bâtiment n'est pas le seul mystère que Bondi-Denomi et ses collègues doivent résoudre. En observant les bactéries infectées par le phage, ils ont réussi à remarquer autre chose d'intéressant: lors de la construction de «l'abri» du phage (cela prend environ 30 minutes), son génome reste à l'endroit où il a été introduit dans la cellule hôte. Pendant ce temps, le génome du phage semble être vulnérable aux enzymes antivirales flottant autour de la cellule hôte. Mais d'une manière ou d'une autre, le génome reste inchangé pendant la construction de sa «salle».

Peut-être qu'une sorte de membrane temporaire protège l'ADN introduit du virus à un stade précoce. Comme un boîtier de protection qui est réinitialisé lorsque le pistolet est prêt pour la bataille. C'est juste que les scientifiques n'ont pas encore pu comprendre quel type de protection.



Mais les scientifiques ont réussi à découvrir que la coque n'est pas aussi impénétrable que les premières expériences l'ont montré. À l'aide d'un développement délicat, l'auteur principal de l'étude, Senen Mendoza, un étudiant diplômé du laboratoire Bondi-Denomi, a trouvé un moyen de contourner un bouclier nucléé en attachant une enzyme de restriction à l'une des protéines de l'enveloppe virale. Cette stratégie du cheval de Troie a permis à l'enzyme d'entrer dans l'abri lors de son assemblage et de détruire le génome du phage à l'intérieur de la zone exempte d'immunité, grâce à laquelle les bactéries ont réussi à survivre.

Cette expérience est particulièrement intéressante pour les chercheurs, car elle montre qu'en fait, il existe des moyens de pénétrer le cocon «imperméable» de protection du génome du virus. Et étant donné que les bactéries et les phages trouvent toujours de nouvelles façons de casser les défenses les uns des autres, Bondi-Denomi pense que très bientôt les scientifiques découvriront que les bactéries sont déjà armées des outils nécessaires pour percer ou contourner cette méthode de protection. La guerre va continuer.

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