बैक्टीरिया की जेनेटिक इंजीनियरिंग: यह सब कैसे शुरू हुआ और आज यह प्रयोगशाला में कैसे काम करता है

स्पष्ट बाधाओं और कठिनाइयों के अस्तित्व के बावजूद जो कभी-कभी आनुवंशिक इंजीनियरिंग (जीआई) उत्पादों के विकास और कार्यान्वयन के रास्ते में आते हैं, आधुनिक जीवविज्ञानी के शस्त्रागार में इस महत्वपूर्ण और विविध प्रौद्योगिकी के फल के बिना 21 वीं शताब्दी की कल्पना नहीं की जा सकती है। जीआई में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला जीव बैक्टीरिया है।

जीआई क्या है और हमें इसकी आवश्यकता क्यों है? जेनेटिक इंजीनियरों के साथ बैक्टीरिया इतने लोकप्रिय क्यों हैं? जीवाणु में वांछित जीन को पेश करने का सबसे आसान तरीका किस रूप में है? इन जीवों के साथ काम करते समय किन कठिनाइयों का सामना किया जा सकता है? पहले क्या हुआ था: पहले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीवाणु का निर्माण या डीएनए और जीनोम की संरचना की खोज? इसके बारे में और बिल्ली के नीचे बहुत कुछ पढ़ें।

0. जीव विज्ञान में संक्षिप्त शैक्षिक कार्यक्रम

यह पैराग्राफ आणविक जीव विज्ञान के तथाकथित केंद्रीय डोगमा का संक्षिप्त विवरण प्रदान करता है। यदि आपके पास आणविक जीव विज्ञान में बुनियादी ज्ञान है, तो चरण 1 पर जाने के लिए स्वतंत्र महसूस करें।


एक तस्वीर में आणविक जीव विज्ञान की केंद्रीय हठधर्मिता

तो चलिए शुरू करते हैं। विकास के सभी चरणों और किसी भी जीव के गुणों के बारे में सभी जानकारी, चाहे प्रोकैरियोट्स (बैक्टीरिया), आर्किया या यूकेरियोट्स (बाकी सभी एकल और बहुकोशिकीय हैं), जीनोमिक डीएनए में एन्कोडेड है, जो एक दूसरे का पूरक दो पॉली न्यूक्लियोटाइड चेन का एक जटिल है, जिससे एक डबल हेलिक्स बनता है () पूरक डीएनए न्यूक्लियोटाइड्स: एटी और जीसी)। यूकेरियोटिक गुणसूत्र रैखिक दोहरे-फंसे डीएनए अणु होते हैं, और प्रोकैरियोटिक गुणसूत्र लूप होते हैं। अक्सर, जीन पूरे जीनोम का एक छोटा सा हिस्सा बनाते हैं (मनुष्यों में - लगभग 1.5%)।


डीएनए और आरएनए मोनोमर्स के उदाहरण। डीएनए नाम में "डीऑक्सी" का अर्थ है स्थिति 2 में ऑक्सीजन परमाणु की अनुपस्थिति (चित्र में, स्थिति 2 'लाल रंग में परिचालित है)।


दो पूरक डीएनए किस्में। धराशायी लाइनें आधारों के बीच हाइड्रोजन बांड दिखाती हैं। जैसा कि देखा जा सकता है, एडेनिन और थाइमिन एक दूसरे के बीच दो हाइड्रोजन बॉन्ड बनाते हैं, और गुआनिन और साइटोसिन तीन रूप में बनते हैं। इसलिए, जीसी बंधन अधिक मजबूत है और डबल-फंसे डीएनए के जीसी-समृद्ध वर्गों को दो श्रृंखलाओं में अलग करना अधिक कठिन है।

ध्यान दें कि प्रत्येक चेन में 5'-एंड और 3'-एंड है। यह देखा जा सकता है कि बाईं श्रृंखला के 5'-अंत के पास दाहिने और इसके विपरीत का 3'-अंत है, इसलिए श्रृंखलाओं को "एंटीपैरल" कहा जाता है। आरएनए का 5'- और 3'-अंत भी है। 5 'और 3' पदों को शुरुआत और अंत को इंगित करने के लिए खुद चुना गया था क्योंकि यह उनके माध्यम से है कि डीएनए और आरएनए की श्रृंखलाओं में सहसंयोजक बंधन बनते हैं।


डीएनए और आरएनए चेन।

डीएनए और आरएनए अनुक्रम हमेशा 5'-end से 3'-end तक दर्ज किए जाते हैं। इसके कई कारण हैं:

• नए डीएनए और आरएनए श्रृंखलाओं का संश्लेषण 5'-अंत ( डीएनए पोलीमरेज़ (डीएनए या आरएनए मैट्रिक्स पर एक पूरक डीएनए श्रृंखला का संश्लेषण करने वाले एंजाइम) और आरएनए पोलीमरेज़ (डीएनए या आरएनए मैट्रिक्स पर एक पूरक आरएनए श्रृंखला का संश्लेषण करने वाले एंजाइम) से शुरू होता है। दिशा 3 '-> 5', इसलिए दिशा 5 '-> 3' में एक नई श्रृंखला संश्लेषित होती है;
• राइबोसोम कोडों को पढ़ता है, mRNA के साथ 5 '-> 3' की दिशा में आगे बढ़ता है;
• एमिनो एसिड अनुक्रम डीएनए कोडिंग श्रृंखला में दिशा 5 '-> 3' में लिखा गया है (एमआरएनए का एक महत्वपूर्ण हिस्सा डीएनए के साथ कोडिंग क्षेत्र की एक सटीक प्रतिलिपि है, जिसे यूरेशिल द्वारा प्रतिस्थापित थाइमिन के साथ और हाइड्रॉक्सिल समूह (-OH) के बजाय हाइड्रोजन की स्थिति में 2 ', निश्चित रूप से);
  
  
  
• अंत में, आमतौर पर स्वीकृत रिकॉर्डिंग नियम का होना सुविधाजनक है।

जीन जीनोमिक डीएनए का एक हिस्सा है जो एक आरएनए अणु के न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम को परिभाषित करता है:

• एनकोडिंग आरएनए: मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए), जिसमें संबंधित प्रोटीन के एमिनो एसिड अनुक्रम को कोडन के रूप में एन्कोड किया गया है। आप "सूचना आरएनए" नाम भी पा सकते हैं, फिर संक्षिप्त नाम "एमआरएनए" जैसा दिखता है;
• गैर-कोडिंग आरएनए: ट्रांसपोर्ट आरएनए, राइबोसोमल आरएनए और अन्य।

टीआरएनए की भूमिका एमआरएनए-राइबोसोम कॉम्प्लेक्स में अमीनो एसिड पहुंचाने की है। इसके अलावा, यह tRNA है जो mRNA कोडों की मान्यता के लिए जिम्मेदार है; इसके लिए, प्रत्येक tRNA में तथाकथित "एंटिकोडन" शामिल है - mRNA कोडन के लिए एक ट्रिपल पूरक।


अनुवाद प्रक्रिया राइबोसोम द्वारा उत्प्रेरित होती है। चित्र में, mRNA में निहित UUU और UCG कोडों को tRNA अणुओं में निहित AAA और AGC एंटिकोडनों द्वारा मान्यता प्राप्त है। एंटिकोडन सीसीसी के साथ ट्रांसपोर्ट आरएनए ने पहले से ही बढ़ती प्रोटीन श्रृंखला को अपना एमिनो एसिड दिया है, और एंटीकोडन कैग के साथ टीआरएनए लाइन में इंतजार कर रहा है। चित्रा में दिखाए गए mRNA अणु के कथानक में चार कोडन होते हैं: GGGUUUUCGGUC। कोडन जीजीजी अमीनो एसिड ग्लाइसिन, यूयूयू से फेनिलएलनिन, यूसीजी से सेरीन, जीयूसी से वेलिन से मेल खाती है। तो यह mRNA क्षेत्र अमीनो एसिड अनुक्रम ग्लाइसिन-फेनिलएलनिन-सेरीन-वेलिन के साथ एक प्रोटीन टुकड़े को एन्कोड करता है।

राइबोसोमल RNAs राइबोसोम के अपरिहार्य घटक हैं। आरआरएनए का मुख्य कार्य अनुवाद प्रक्रिया को सुनिश्चित करना है: यह टीआरएनए के एडाप्टर अणुओं का उपयोग करके एमआरएनए से जानकारी पढ़ने और टीआरएनए से जुड़े अमीनो एसिड और बढ़ते प्रोटीन श्रृंखला के बीच पेप्टाइड बांड के गठन को उत्प्रेरित करने में शामिल है।


मुख्य प्रकार के आरएनए अणु (वास्तव में, बहुत अधिक हैं)।

दूसरी ओर, एक प्रोटीन, अमीनो एसिड की एक श्रृंखला है, जिसे एक पेप्टाइड बॉन्ड के माध्यम से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जाता है (आप देख सकते हैं कि यह स्पॉइलर में थोड़ा आगे क्या है)। संश्लेषण के बाद, अमीनो एसिड की श्रृंखला को एक निश्चित स्थानिक संरचना पर ले जाना चाहिए - " रचना " ( उन्होंने पहले ही मुझे Geektimes पर प्रोटीन की स्थानिक संरचना के बारे में बताया था )। इसके अलावा, कई बड़े प्रोटीन वास्तव में एक ही स्थिर संरचना में हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन और हाइड्रोजन बांड द्वारा संयुक्त कई प्रोटीन से मिलकर होते हैं। इस मामले में, प्रत्येक "प्रोटीन निर्माण" को "सबयूनिट" कहा जाता है, और परिणामस्वरूप बड़े प्रोटीन को "मल्टीसुबुनिट" कहा जाता है।





राइबोसोमल कॉम्प्लेक्स। तस्वीर ओलेगकोवलेव्स्की प्रकाशन "प्रोटीन अणु मॉडल के 3 डी-प्रिंटिंग" से ली गई थी।

एक प्रोटीन को जीन करने वाले जीन के मामले में, आनुवंशिक जानकारी को डिकोड करने की प्रक्रिया इस तरह दिखाई देती है:

1. आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर को पहचानता है और इसे बांधता है (यदि यह "खुला" है, तो हम प्रमोटर की गतिविधि के विनियमन के बारे में आगे चर्चा करेंगे);
2. डीएनए मैट्रिक्स पर, आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम, संपूरकता के सिद्धांत के अनुसार, मैट्रिक्स आरएनए (प्री-एमआरएनए, यूकेरियोट्स में) के "रिक्त" या तैयार किए गए कार्यात्मक एमआरएनए (प्रोजेरिया में) को संश्लेषित करता है। इस प्रक्रिया को "प्रतिलेखन" कहा जाता है;
3. (केवल यूकेरियोट्स में) प्री-एमआरएनए अणु संशोधनों ("परिपक्वता") से गुजरता है और कार्यात्मक एमआरएनए बन जाता है;
4. mRNA राइबोसोम द्वारा पहचाना जाता है, एक एंजाइम जो mRNA के ट्रिपल कोड को डीकोड करता है और, इसके आधार पर, एक पेप्टाइड / प्रोटीन को संश्लेषित करता है। अमीनो एसिड जिसमें से राइबोसोम प्रोटीन बनाता है, परिवहन में आरएनए ( टीआरएनए ) के साथ जटिल में वितरित किया जाता है। इस प्रक्रिया को "प्रसारण" कहा जाता है;
5. पेप्टाइड / प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों ("mRNA के साथ सादृश्य द्वारा" परिपक्वता) से गुजर सकता है और कार्यात्मक बन जाता है। एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि यूकेरियोट्स के बाद के अनुवाद-संशोधन की प्रणाली प्रोकैरियोट्स की तुलना में बहुत अधिक जटिल और विविध है, इसलिए प्रत्येक यूकेरियोटिक प्रोटीन को एक जीवाणु द्वारा सही ढंग से संश्लेषित नहीं किया जा सकता है।

कोडिंग क्षेत्रों के अलावा, जीनोम में कई टुकड़े होते हैं जो एक तरह से या किसी अन्य में प्रतिलेखन में भाग लेते हैं। जीन के करीब स्थित भूखंड और जिन्हें प्रमोटर कहा जाता है, उन्हें आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा मान्यता प्राप्त है (वे कहते हैं कि जीन इस प्रमोटर के नियंत्रण में है)। विभिन्न प्रमोटरों को विभिन्न आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा मान्यता प्राप्त है। उदाहरण के लिए, एक बैक्टीरियोफेज प्रमोटर के नियंत्रण में एक जीन को बैक्टीरिया में स्थानांतरित नहीं किया जाएगा यदि संबंधित बैक्टीरियोफेज के आरएनए पोलीमरेज़ को इसमें संश्लेषित नहीं किया जाता है। आम तौर पर ।

प्रत्येक जीन में कई नियामक अनुक्रम भी हो सकते हैं, जो या तो सीधे प्रमोटर के पास स्थित हो सकते हैं (या इसके साथ ओवरलैप भी हो सकते हैं), या इससे दसियों हज़ार न्यूक्लियोटाइड जोड़े की दूरी पर। प्रतिलेखन बढ़ाने वाले तत्वों को "एन्हांसर" कहा जाता है , प्रतिलेखन दबाने वाले तत्वों को साइलेंसर कहा जाता है, और उनके साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन को प्रतिलेखन कारक कहा जाता है । यद्यपि यह प्रतिलेखन कारकों को प्रतिलेखन दीक्षा परिसर के आवश्यक घटक भी कहने के लिए प्रथागत है, जिसके बिना प्रतिलेखन सिद्धांत रूप में असंभव है। तथ्य यह है कि केवल यूकेरियोट्स और आर्किया में डीएनए मैट्रिक्स पर आरएनए अणु के संश्लेषण को शुरू करने के लिए, पूरे सुपरमॉलेक्युलर कॉम्प्लेक्स की विधानसभा आवश्यक है। इस तरह के सबसे सरल कॉम्प्लेक्स में आरएनए पोलीमरेज़ होलोनीजाइम और छह तथाकथित "सामान्य प्रतिलेखन कारक" (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF और TFIIH) शामिल हैं। कॉम्प्लेक्स को ही "ट्रांसक्रिप्शन प्रीइनिशिएशन कॉम्प्लेक्स" कहा जाता है।

प्रोकैरियोटिक ट्रांसक्रिप्शन कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से अलग है, इसलिए जीवाणु में यूकेरियोटिक प्रमोटर के साथ यूकेरियोटिक जीन को एम्बेड करने का कोई मतलब नहीं है। यूकेरियोट्स और आर्किया के सामान्य प्रतिलेखन कारकों के एक प्रोकैरियोटिक एनालॉग को "सिग्मा कारक" नामक प्रोटीन कहा जा सकता है।


प्रोकैरियोटिक ट्रांसक्रिप्शनल कॉम्प्लेक्स। आकृति में दिखाए गए अक्षर आमतौर पर संबंधित उपनिवेशों के स्वीकृत पदनाम होते हैं। σ70 - ई। कोलाई घरेलू जीन का सिग्मा कारक

प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स के जीनोम में कई विशेषताएं हैं, और पहले उल्लेखित आणविक जीवविज्ञान के केंद्रीय डोगमा, दोनों राज्यों के लिए सही है। हालाँकि, कई महत्वपूर्ण अंतर भी हैं। उदाहरण के लिए, एक जीवाणु को ऑपेरॉन की एक प्रणाली की विशेषता होती है - एक साथ समूहित जीन जो एक ही प्रक्रिया में भाग लेते हैं और अलग-अलग स्थानांतरित नहीं होते हैं, लेकिन एक लंबे mRNA के भाग के रूप में। यूकेरियोट्स में, सब कुछ पूरी तरह से अलग है: एक प्रक्रिया में शामिल जीन अलग-अलग गुणसूत्रों में बिखरे हुए होते हैं, और जीनों को स्वयं इंट्रोन्स के गैर-कोडिंग क्षेत्रों द्वारा एक्सॉन के कोडिंग टुकड़ों में विभाजित किया जाता है । इस मामले में, पहले जीन पूरी तरह से प्रत्यारोपित होता है, और फिर, पहले से ही आरएनए चरण में, इंट्रोन्स एक्साइज़ होते हैं, और एक्सॉन क्रॉस-लिंक को कोडिंग एमआरएनए बनाने के लिए। इस प्रक्रिया को स्पाइसलिंग कहा जाता है। इसी समय, सभी उपलब्ध एक्सॉन को समाप्त mRNA में सिले नहीं किया जा सकता है, लेकिन उनमें से केवल एक हिस्सा इस मामले में, "वैकल्पिक स्पाइसिंग" की बात करता है। इस प्रकार, एक यूकेरियोटिक कोशिका एक ही जीन को स्थानांतरित करते हुए, कई प्रोटीनों को संश्लेषित कर सकती है। अन्य बातों के अलावा, यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण परिणाम देता है: यह अक्सर यूकेरियोटिक जीन को जीवाणु में "जैसा कि गुणसूत्र में होता है" में सम्मिलित करने का कोई मतलब नहीं है, क्योंकि जीवाणु बस splicing करने में सक्षम नहीं है।

एक और महत्वपूर्ण अंतर है। प्रोकैरियोट्स की विशेषता अंगूठी "गुणसूत्र" के बाहर डीएनए-आधारित आनुवंशिक सामग्री की उपस्थिति से होती है, तथाकथित "प्लास्मिड्स" - छोटे गोलाकार डबल-फंसे डीएनए अणु। इसके अलावा, प्रोकैरियोट में ऑर्गेनल्स की कमी होती है, जिसमें नाभिक भी शामिल है: एक बैक्टीरियल सेल के सभी घटक इंट्रासेल्युलर अंतरिक्ष में यात्रा करने के लिए स्वतंत्र हैं। यूकेरियोट्स, हालांकि, प्लास्मिड नहीं होते हैं, लेकिन जीनोम में प्लास्टिड्स और माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं, जिसमें प्लास्मिड शामिल होते हैं (सबसे पुष्ट परिकल्पना के अनुसार, प्लास्टिड्स और माइटोकॉन्ड्रिया सिनाओबैक्टीरिया और बैक्टीरिया और बैक्टीरिया और बैक्टीरिया और बैक्टीरिया और बैक्टीरिया) के जीवाणुओं के "वंशज" हैं। इसके अलावा, एक नाभिक और अन्य इंट्रासेल्युलर डिब्बों की अपनी झिल्ली से घिरी हुई उपस्थिति यूकेरियोट्स के लिए पहले से ही विशिष्ट है। इसलिए, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग को बैक्टीरिया की आनुवंशिक इंजीनियरिंग की तुलना में अलग-अलग तरीकों की आवश्यकता होती है।

आनुवांशिक कोड स्वयं इस प्रकार संरचित है। प्रत्येक जीन / एक्सॉन में ट्रिपलेट्स / कोडोन का एक सेट होता है - तीन न्यूक्लियोटाइड्स के अनुक्रम जिनके बीच कोई अंतराल नहीं होता है। ट्रिपलेट संगठन डीएनए में जीन के लिए और mRNA के कोडिंग भाग के लिए दोनों मान्य है। अनुवाद की प्रक्रिया में, एक विशिष्ट एमिनो एसिड "पहचान" ले जाने वाले आरएनए (टीआरएनए) को उनके संबंधित तीन-अक्षर ट्रिपल ले जाता है। राइबोसोम टीआरएनए से अमीनो एसिड को काट देता है और इसे बढ़ते हुए एमिनो एसिड श्रृंखला से जोड़ देता है, जो अनुवाद के अंत में या तो तुरंत एक परिपक्व, पूरी तरह कार्यात्मक प्रोटीन बन जाएगा, या इससे पहले कि यह संशोधनों की एक श्रृंखला से गुजरता है। इस मामले में, केवल एक अमीनो एसिड प्रत्येक ट्रिपल से मेल खाती है, लेकिन कई अलग-अलग कोडन एक एमिनो एसिड के अनुरूप हो सकते हैं। यह समझ में आता है, क्योंकि मानक आनुवंशिक कोड में 61 कोडिंग कोडन होते हैं, और केवल 20 प्रोटीनोजेनिक अमीनो एसिड होते हैं (कुल कोडन, बेशक, 4 * 4 * 4 = 64, लेकिन उनमें से तीन गैर-कोडिंग हैं, बजाय अनुवाद को रोकने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करते हैं और "कहा जाता है" बंद करो कोडन ”)।


मानक आनुवंशिक कोड में कोडन। तस्वीर के लिए विकिपीडिया का धन्यवाद।

तो, प्रोटीन ठीक वही तत्व हैं जो जीनोमिक डीएनए और शरीर के गुणों के बीच श्रृंखला में अंतिम कड़ी हैं, तथाकथित "फेनोटाइप" । इसलिए, किसी तरह जीव की विशेषताओं को बदलने के लिए जो हमारे लिए महत्वपूर्ण है, हमें इसके डीएनए को इस तरह से बदलने की आवश्यकता है, जिसके परिणामस्वरूप, इसकी कोशिकाओं में कुछ प्रोटीन दिखाई देते हैं, जो हमें लक्ष्य परिणाम प्रदान करेगा। यह सभी जेनेटिक इंजीनियरिंग का मूल विचार है।

1) जेनेटिक इंजीनियरिंग में बैक्टीरिया किस उद्देश्य से उपयोग किए जाते हैं और वे क्यों होते हैं

इसलिए, हमने पता लगाया कि जीनोमिक डीएनए के अनुक्रम शरीर के गुणों और विशेषताओं को कैसे और क्यों प्रभावित करते हैं। बेशक, यह बहुत अच्छा होगा यदि लक्षण पूरी तरह से सिर्फ एक जीन द्वारा निर्धारित किया जाता है - एक छोटा सा टुकड़ा सम्मिलित करना अब गंभीर समस्या नहीं है। उदाहरण के लिए, अक्सर एक हर्बिसाइड या कीट के लिए एक पौधे का प्रतिरोध एक एकल जीन द्वारा निर्धारित किया जाता है, इसलिए ऐसे मामलों में वांछित प्रतिरोध के साथ किस्में बनाना मुश्किल नहीं है (जैसा कि इस तरह के पौधे को बाजार में लाने का विरोध किया गया है)। बैक्टीरिया के कई एंटीबायोटिक प्रतिरोधों के लिए भी यही सच है (वास्तव में, बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ कई सुरक्षात्मक तंत्र हैं, लेकिन वे एक स्वतंत्र तरीके से काम करते हैं)। उदाहरण के लिए, उदाहरण के लिए, वैज्ञानिकों ने पौधों को वातावरण से नाइट्रोजन को अवशोषित करने के लिए सिखाने का प्रयास किया है। तथ्य यह है कि पौधों के लिए नाइट्रोजन का एकमात्र स्रोत मिट्टी है जिसमें पौधे द्वारा आत्मसात करने के लिए उपयुक्त नाइट्रोजन युक्त यौगिकों को सूक्ष्मजीवों द्वारा संश्लेषित किया जाता है (या एक देखभाल माली या एक कुत्ते द्वारा पारित उर्वरकों के रूप में पेश किया जाता है)। जाहिर है, कृषि के लिए एक वैकल्पिक पोषण तंत्र वाला पौधा बनाना बहुत फायदेमंद होगा। लेकिन, दुर्भाग्य से, यह प्रक्रिया इतनी जटिल है कि सूक्ष्मजीवों से संयंत्र में इसके "हस्तांतरण" की समस्या अब तक हल नहीं हुई है।

अंत में, यदि हमारा लक्ष्य किसी विशिष्ट उद्देश्य के लिए प्रोटीन प्राप्त करना है (प्रोटीन की संरचना और कार्यों का अध्ययन करना, उस पर आधारित चिकित्सा तैयारी या प्रयोगशाला अभिकर्मकों का निर्माण करना, आदि), तो, जाहिर है, हम सेल में एक एकल जीन के एकीकरण से काफी खुश हैं, जो इस मामले में, इसे "निर्माता जीव" कहने की प्रथा है।

आनुवंशिक इंजीनियरिंग में एक जीवाणु बनाने के लिए एक संभावित स्रोत सामग्री है:

1. प्रोटीन का एक उत्पादक जिसे हमें प्रयोगशाला या औद्योगिक पैमाने पर चाहिए;
2. एक यौगिक के एक निश्चित रासायनिक परिवर्तन में एक सक्रिय एजेंट, चाहे वह खाद्य उद्योग में एक किण्वन प्रक्रिया हो, मिट्टी में "जीवाणु उर्वरक उत्पादक" शुरू करने या स्टील स्क्रैप का उपयोग करके पौधे के विकास के लिए अधिक अनुकूल परिस्थितियों का निर्माण;
3. जीन का klonotek (एक विषय, जिसका एक अच्छा विवरण लेख के आकार को अशोभनीय बढ़ा देगा);
4. उदाहरण के लिए, जठरांत्र संबंधी मार्ग के माइक्रोफ्लोरा को बहाल करने के लिए एक चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण दवा;
   
5. पौधों के बाद के आनुवंशिक संशोधन के लिए एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमफैसिंस के जीवाणु उपभेद।
   

* मैं कुछ भूल सकता हूं, इसलिए टिप्पणियों में परिवर्धन का स्वागत है।

एक दिलचस्प तथ्य यह है कि बैक्टीरिया के जेनेटिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में पहला सफल प्रयोग वाटसन और क्रिक के ऐतिहासिक कार्य से बहुत पहले हुआ। इसके अलावा, इन प्रयोगों के आधार पर, यह तथ्य कि सूचना डीएनए में निहित है, सिद्ध हुई, जिसके बाद वैज्ञानिक आरएनए और प्रोटीन के बारे में परिकल्पनाओं पर अपना समय नहीं बिता पाए।

1944 में किए गए इस कार्य को फ्रेडरिक ग्रिफिथ के काम के आधार पर एवरी, मैकलॉड और मैकार्थी प्रयोग के रूप में जाना जाता है, जिसके दौरान यह पाया गया कि मारे गए रोगजनक और जीवित गैर-रोगजनक क्रॉफोकस उपभेदों के संक्रमण के कारण बीमारी का विकास होता है, जबकि व्यक्तिगत रूप से वे महत्वपूर्ण लक्षण पैदा नहीं करते हैं। इस प्रयोग से, यह निष्कर्ष निकाला गया कि एक मारा गया जीवाणु एक गैर-रोगजनक "सहकर्मी" को कुछ प्रसारित करने में सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप यह खतरनाक हो जाता है। लेकिन वे एक-दूसरे के लिए क्या करते हैं? 1944 तक, तीन मुख्य उम्मीदवार थे: डीएनए, आरएनए और प्रोटीन। ट्रांसपोर्टर को स्थापित करने के लिए, एक सुरुचिपूर्ण प्रयोग किया गया था: उस समय, अलग-अलग डीएनए (DNase), अलग-अलग RNA (RNase) और अलग-अलग प्रोटीन (प्रोटीन) को नष्ट करने में सक्षम एंजाइम पहले से ही उपलब्ध थे। यह दिखाया गया था कि रोगजनक गुणों का हस्तांतरण केवल उन मामलों में नहीं हुआ था जब एक मृत रोगजनक तनाव की तैयारी को DNase के साथ इलाज किया गया था और यह RNase और proteinase के साथ दवा के उपचार पर निर्भर नहीं था।

इस प्रकार, यह साबित हो गया कि डीएनए संकेतों के बारे में जानकारी का वाहक है। इसके अलावा, यह स्पष्ट रूप से दिखाया गया था कि एक जीवाणु कोशिका में एक विदेशी डीएनए अणु के सहज प्रवेश संभव है।

बैक्टीरिया स्पष्ट दोषों के साथ इतने लोकप्रिय क्यों हैं (उदाहरण के लिए, यूकेरियोटिक पोस्ट-ट्रांसलेशन संशोधनों की कमी)? सब कुछ सरल है। , .

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जीन असेंबली का एक अन्य महत्वपूर्ण कारक यह तथ्य है कि एक या दूसरे कोडोन की आवृत्तियां अलग-अलग जीवों के लिए अलग-अलग होती हैं, जबकि कोशिकाओं में आमतौर पर उन tRNA के अधिक होते हैं जो अधिक "लोकप्रिय" कोडन के अनुरूप होते हैं। चूंकि कई अमीनो एसिड कई कोडन द्वारा एन्कोड किए गए हैं, इसलिए यह अत्यधिक संभावना है कि एक जीव से दूसरे जीव में जीन की नकल करने से अनुवाद प्रक्रिया में एक मजबूत देरी होने का खतरा होता है। वास्तव में, यदि इस जीन के कई कोडन नए जीव में दुर्लभ हैं, तो वांछित टीआरएनए अंत में आने पर राइबोसोम अधिक समय तक इंतजार करेगा।


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अब प्रमोटर के बारे में कुछ शब्द। एक उपयुक्त प्रमोटर का चयन बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया काफी हद तक इस पर निर्भर करती है। प्रमोटरों को सशर्त रूप से मजबूत, मध्यम और कमजोर में विभाजित किया जाता है। प्रमोटर की "ताकत" इस बात से निर्धारित होती है कि जीन को उसके नियंत्रण में कैसे सक्रिय किया जाता है, अन्य सभी चीजें बराबर होती हैं: प्रतिलेखन जितना अधिक सक्रिय होता है, प्रमोटर उतना ही मजबूत होता है। जाहिर है, जब हम प्रोटीन उत्पादक बनाना चाहते हैं, तो हमें मजबूत प्रमोटरों के साथ शुरू करना चाहिए। कुछ मामलों में, अत्यधिक तेजी से ट्रांसक्रिप्शन (इसलिए, सक्रिय अनुवाद) सेल को नुकसान पहुंचाता है, जिस स्थिति में आप एक कमजोर प्रमोटर का उपयोग करने की कोशिश कर सकते हैं। हालांकि वास्तव में एक नया निर्माण करने की तुलना में मौजूदा निर्माता की प्रतिलेखन गतिविधि को प्रभावित करना बहुत आसान है।

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1. लैक्टोज ऑपेरॉन ई। कोलाई (लैपेरॉन) और एक मजबूत प्रमोटर के नियामक तत्वों पर आधारित प्रणाली।
   
   तथ्य यह है कि ई। कोलाई के अपने पोषण नियम हैं। सबसे पहले, लैपेरॉन की गतिविधि को दबाने के लिए एक तंत्र है, जो केवल तभी सक्रिय होता है जब लैक्टोज सेल में प्रवेश नहीं करता है। यह तार्किक है: जो उपयोगी नहीं है, उसके संश्लेषण पर ऊर्जा क्यों बर्बाद करें? लेकिन जैसे ही लैक्टोज पर्याप्त मात्रा में कोशिका में प्रवेश करना शुरू करता है, यह तंत्र बंद हो जाता है।
   
   हालांकि, लाख- एपेरॉन की गतिविधि को दबाने के लिए एक दूसरा तंत्र है। यदि माध्यम में ग्लूकोज होता है, तो सेल विशेष रूप से ग्लूकोज पर फ़ीड करता है, क्योंकि यह लाख- शंकु के प्रतिलेखन के निषेध के दूसरे तंत्र को सक्रिय करता है। इस प्रकार, लाख- एपेरॉन तभी सक्रिय होता है जब कोशिका के आसपास के स्थान में केवल लैक्टोज होता है। लैक्टोज ऑपेरोन का माइनस एक बेहद कमजोर प्रमोटर है, इसलिए, उत्पादक उपभेदों में इसे एक मजबूत से बदल दिया जाता है। मजबूत प्रमोटर अक्सर रोगजनकों से प्राप्त होते हैं। प्रोकैरियोट्स के आनुवंशिक इंजीनियरिंग में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सबसे मजबूत प्रमोटरों को बैक्टीरिया के वायरस - बैक्टीरियोफेज से अलग किया जाता है। उदाहरण के लिए, T7 फेज प्रमोटर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
   
   वैसे, पौधों के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए कुछ मजबूत प्रमोटर भी वायरस से अलग-थलग हैं, उदाहरण के लिए, यह फूलगोभी मोज़ेक वायरस का प्रमोटर है।
   
   
   
   जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ई। कोलाई में एक आरएनए पोलीमरेज़ नहीं है जो बैक्टीरियोफेज प्रमोटरों को पहचानता है, इसलिए, इसी बैक्टीरियोफेज के आरएनए पोलीमरेज़ जीन को पहले निर्माता में डाला जाता है।
   
   लोकप्रिय ई। कोलाई आधारित प्रोटीन सिंथेसिस प्रणाली लाख-पेरोन तंत्र द्वारा विनियमित बैक्टीरियल आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर के नियंत्रण में T7 फेज आरएनए पोलीमरेज़ जीन को वहन करती है। यदि यह तनाव "T7 फेज प्रमोटर + प्रमोटर प्रकार लाख- पेरोन " के नियमन के तहत लक्ष्य जीन को ले जाने वाले वेक्टर से बदल जाता है, तो लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए दो-स्तरीय तंत्र उत्पन्न होगा।
   
   इस डिजाइन का उपयोग करते समय, ग्लूकोज और लैक्टोज को एक साथ पोषक माध्यम में जोड़ा जाता है। कुछ समय के लिए, कोशिकाएं ग्लूकोज पर फ़ीड करेंगी और चुपचाप विभाजित करेंगी, क्योंकि एक विदेशी प्रोटीन का संश्लेषण पूरी तरह से दबा हुआ है। जब तक ग्लूकोज खत्म हो जाता है और कोशिकाएं लैक्टोज चयापचय में बदल जाती हैं, तब तक संस्कृति में पहले से ही पर्याप्त बायोमास हो जाएगा, यह प्रोटीन के संश्लेषण को शुरू करने का समय है। इस प्रक्रिया को "ऑटो-इंडक्शन" कहा जाता है।
   
   आप इसे दूसरे तरीके से कर सकते हैं: ग्लूकोज और लैक्टोज को पोषक तत्व माध्यम में बिल्कुल भी न जोड़ें, और फिर, जब संस्कृति वांछित घनत्व तक बढ़ती है, तो सेल लैक्टोज के लिए क्या लेगा, लेकिन चयापचय या नष्ट नहीं कर सकता। अब, IPTG को इस तरह के प्रारंभ करनेवाला के रूप में उपयोग किया जाता है।
   
   
2. बैक्टीरियोफेज λ के पीएल प्रमोटर के नियामक तंत्र पर आधारित एक प्रणाली।
   
   इस प्रमोटर को cI रिप्रेसेंट प्रोटीन द्वारा निष्क्रिय किया जाता है। इस मामले में, cI857 नामक इस प्रोटीन के एक थर्मोसेंसिव रूप की खोज की गई थी: यह प्रतिलेखन कारक लगभग 30 ° C के तापमान पर कार्यक्षमता बनाए रखता है और इसे 42 ° C पर खो देता है। इसलिए, ऐसी प्रणाली का उपयोग करते समय, जीवाणु संस्कृति को पहले 30 डिग्री सेल्सियस पर वांछित घनत्व तक उगाया जाता है, और फिर तापमान 42 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जाता है, जिससे लक्ष्य प्रोटीन का संश्लेषण शुरू होता है।

खैर, वेक्टर डिजाइन किया गया है। फिर छोटी बात यह है कि जीवाणु कोशिका में इसकी शुरूआत के लिए एक उपयुक्त विधि ढूंढनी है। लेकिन यह पूरी तरह से अलग कहानी है।