जीवाणुओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग: जीवाश्म वेक्टर में हमें जिन जीनों की आवश्यकता होती है, उन्हें कैसे पेश किया जाए

मेरे पिछले प्रकाशन में , दो प्रश्नों पर विचार किया गया था: आणविक जीव विज्ञान की बुनियादी बातों और प्लास्मिड वैक्टर के आधार पर हमें जिन निर्माणों की आवश्यकता होती है, उनके निर्माण के तरीके। अब आपको यह पता लगाने की आवश्यकता है कि एक प्लास्मिड वेक्टर को एक जीवाणु कोशिका में कैसे पेश किया जाए, अर्थात "परिवर्तन" करना। उसी समय, हम जीवाणु झिल्ली की संरचना के बारे में कुछ सीखेंगे और इसे कैसे दूर किया जा सकता है, साथ ही साथ कुछ बैक्टीरिया को सक्षम क्यों कहा जाता है, यह सब कैसे बैक्टीरिया विषाक्त पदार्थों और जीवाणुरोधी से एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध से संबंधित है, और कई दिलचस्प तथ्य हैं।


तो, हमारे हाथों पर एक प्लास्मिड वेक्टर है और इस वेक्टर के लिए उपयुक्त एक जीवाणु तनाव है, यह वेक्टर को जीवाणु में पेश करता है।

पिछले लेख में , फ्रेडरिक ग्रिफिथ के काम का उल्लेख किया गया था, जो स्पष्ट रूप से इस तथ्य को दर्शाता है कि डीएनए अनायास बैक्टीरिया की कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है। एक पर्यावरणीय डीएनए अणु को अवशोषित करने के लिए एक जीवाणु कोशिका की क्षमता को "सक्षमता" कहा जाता है (जो इस तथ्य के बारे में बहुत सारे चुटकुले देता है कि इन विट्रो में एककोशिकीय भी सक्षम हैं, और आपकी प्रयोगशाला सहयोगी नहीं है)। यदि अवशोषण कुछ कृत्रिम रूप से निर्मित स्थितियों के प्रभाव में नहीं होता है, तो हम "प्राकृतिक क्षमता" के बारे में बात कर रहे हैं। एक जीवाणु के अंदर यह डीएनए परिवहन कैसे होता है?

1) बैक्टीरिया की कोशिका झिल्ली की संरचना

शुरुआत करने के लिए, हम संक्षेप में ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया की झिल्ली की संरचना पर विचार करते हैं।
एक ग्राम-नकारात्मक जीवाणु के खोल में दो लिपिड बिलयर्स होते हैं: बाहरी झिल्ली और आंतरिक झिल्ली (आंतरिक को प्लाज्मा भी कहा जाता है)। उनके बीच प्रोटीन और पेप्टिडोग्लाइकन से भरे पेरिप्लासिमिक स्थान महत्वपूर्ण कार्य करते हैं।


बाईं ओर ग्राम-नकारात्मक जीवाणु की झिल्ली की संरचना है। झिल्लियों के अंदर रंगीन गिज़्मो झिल्लीदार प्रोटीन होते हैं, और बाहर चिपके हुए चेन लिपोपॉलेसेकेराइड होते हैं। दाईं ओर ग्राम-निगेटिव जीवाणु की संरचना है।

पेप्टिडोग्लाइकन एक विषमलैंगिक है जिसमें सहसंयोजक एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन (एनएजी) और एन-एसिटाइलमुरैमिक एसिड (एनएएम) शामिल हैं। यह सिलसिला निकलता है ....- NAG-NAM-NAG-NAM-NAG- .... "हेटेरोपोलिमर" शब्द में "हेटेरो" का अर्थ है कि बहुलक में एक ही तत्व (जैसे पॉलीथीन) नहीं है, लेकिन दो अलग-अलग हैं। पेप्टिडोग्लाइकन सिंथेसाइजिंग एंजाइम, ट्रांसपेप्टिडेज़, β-लैक्टम एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन एंटीबायोटिक्स और सेफलोस्पोरिन) के लिए एक लक्ष्य है: वे इसकी गतिविधि को रोकते हैं, जीवाणु विभाजन की प्रक्रिया के परिणामस्वरूप, दोनों बेटी कोशिकाओं के लिए पर्याप्त पेप्टिडोग्लाइकेन नहीं है। पेप्टिडोग्लाइकेन परत भी लाइसोजाइम एंजाइम के लिए एक लक्ष्य है: यह एनएजी और एनएएम के बीच सहसंयोजक बंधन को नष्ट कर देता है। दवा में, लाइसोजाइम का उपयोग एंटीसेप्टिक के रूप में किया जाता है, उदाहरण के लिए, यह गले में खराश के इलाज के लिए कुछ दवाओं का एक सक्रिय घटक है, और खाद्य उद्योग में इसे संरक्षक (खाद्य पूरक E1105 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है - यह लाइसोजाइम है)।


पेप्टिडोग्लाइकन। आंकड़ा एक एनएजी (यह बाईं तरफ) और एक एनएएम (यह दाईं ओर) के अनुरूप भाग को दर्शाता है, जो ऑक्सीजन परमाणु के माध्यम से परस्पर जुड़े हुए हैं। (उन लोगों के लिए जो रसायन विज्ञान में इस तरह की स्वतंत्रता को पसंद नहीं करते हैं: इस "ऑक्सीजन परमाणु के माध्यम से बंधन" को )- (1,4) -glycoside कहा जाता है।

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के लिफ़ाफ़े में केवल एक आंतरिक (प्लाज्मा) झिल्ली होती है, जो कि ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया की तुलना में बहुत पतली पेरिप्लासमिक स्पेस और बाहरी, मोटी पेप्टिडोग्लाइकन परत होती है।

इस तरह की बाधाएं जो जीवाणु साइटोप्लाज्म में किसी भी यौगिक के रास्ते में खड़ी होती हैं, पानी को छोड़कर हर चीज के लिए अकल्पनीय होती हैं, साथ ही छोटे गैर-ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक अणु (आणविक ऑक्सीजन और नाइट्रोजन, कार्बन डाइऑक्साइड और अन्य)। खोल के माध्यम से इन यौगिकों के प्रवेश को "निष्क्रिय परिवहन" ("सरल प्रसार") कहा जाता है, यह हमेशा एकाग्रता ढाल के साथ होता है। गैर-ध्रुवीय अणु झिल्ली के माध्यम से स्वतंत्र रूप से गुजरने में सक्षम होते हैं क्योंकि झिल्ली की आंतरिक मात्रा भी गैर-ध्रुवीय होती है (झिल्ली के अंदर वे फैटी एसिड के हाइड्रोफोबिक अवशेषों से बने होते हैं), और गैर-ध्रुवीय यौगिक गैर-ध्रुवीय सॉल्वैंट्स (शराब, एसीटोन, फैटी एसिड) में अत्यधिक घुलनशील होते हैं।


एक कॉमिक तस्वीर जिसमें दो-परत झिल्ली के अंदर फैटी एसिड के अवशेषों के हाइड्रोफोबिसिटी (हाइड्रोफोबिया) को खेला जाता है।

बदले में, बड़े ध्रुवीय अणु (अमीनो एसिड, मोनोसैकराइड, न्यूक्लियोटाइड्स), आवेशित कण (आयन) और मैक्रोमोलेक्यूल्स (डीएनए, प्रोटीन) कोशिका झिल्ली के माध्यम से उस तरह से प्रवेश नहीं कर सकते हैं, क्योंकि वे केवल ध्रुवीय सॉल्वैंट्स में घुलनशील हैं (उदाहरण के लिए, पानी में) । फिर एक बैक्टीरिया कोशिका के अंदर डीएनए अणु कैसे मिलते हैं?

2) पर्यावरण से कोशिकाओं में यौगिकों के प्रेरित परिवहन के तंत्र

सबसे पहले, हमारे हाथ में स्पष्ट तथ्य है कि जीवाणु केवल पानी, ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड पर नहीं रह सकता है, जीवन के लिए इसे कई अन्य यौगिकों की आवश्यकता होती है। इसलिए इन यौगिकों को कोशिका में पहुंचाने के तरीके हैं। इस तरह के तरीके "सुगम प्रसार" और "सक्रिय परिवहन" हैं।

२.१) प्रकाश प्रसार

सुविधाजनक प्रसार का एक उदाहरण (हालांकि यह विशेष मामला, इसके विपरीत, बैक्टीरिया के लिए हानिकारक है) वैलिनोमाइसिन के साथ एक जीवाणु कोशिका के झिल्ली के माध्यम से पोटेशियम आयनों का परिवहन है, एक एंटीबायोटिक जो कुछ कवक के साथ संश्लेषित होता है। मुक्त वेलिनोमाइसिन कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकता, क्योंकि ध्रुवीय समूह बाहरी रूप से उजागर होते हैं। पोटेशियम आयन भी एक "बंद रास्ता है।"


वैलिनोमाइसिन और पोटेशियम आयन (आयन को केंद्र में एक गेंद के रूप में दर्शाया गया है) के एक परिसर की त्रि-आयामी संरचना को दर्शाती एक मूर्ति। यह एम। एम। शेम्याकिन और यू के प्रवेश द्वार के सामने स्थापित किया गया था। ए। ओचिननिकोव इंस्टीट्यूट ऑफ बायोऑर्गेनिक केमिस्ट्री, रशियन एकेडमी ऑफ साइंसेज (मॉस्को), जिसमें वेलिनोमाइसिन की जीवाणुरोधी गतिविधि का तंत्र और पोटेशियम आयन के साथ इसके परिसर की त्रि-आयामी संरचना स्थापित की गई थी।

लेकिन पोटेशियम आयन के साथ वैलिनोमाइसिन के एक परिसर के गठन के बाद, यह अपनी तीन आयामी संरचना को बदलता है ताकि इसकी पूरी बाहरी सतह हाइड्रोफोबिक (गैर-ध्रुवीय) हो जाए, और सभी हाइड्रोफिलिक समूह अंदर छिपे हुए हैं। इस मामले में, पोटेशियम आयन वेलिनोमाइसिन अणु के अंदर छिपा हुआ है; इसलिए, वेलिनोमाइसिन + पोटेशियम आयन कॉम्प्लेक्स झिल्ली के माध्यम से प्रवेश कर सकता है। जटिल किसी भी समय सेल और बाहर दोनों के भीतर मुक्त वैलिनोमाइसिन और आयन में विघटित हो सकता है, लेकिन आम तौर पर आयनों के प्रसार में सुविधा इंट्रासेल्युलर और बाह्य दोनों स्थानों में उनकी एकाग्रता के बराबर होती है, और सेल एक कारण के लिए आयनों के परिवहन को नियंत्रित करता है: उनकी उच्च एकाग्रता विनाशकारी। यह इस पर है कि वैलिनोमाइसिन का जीवाणुरोधी प्रभाव आधारित है।


पोटेशियम आयन के साथ जटिल फंगल एंटीबायोटिक वैलिनोमाइसिन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।

एक और उदाहरण अनियंत्रित छिद्र है, जो बड़े ट्रांसमेंबर प्रोटीन होते हैं जो कुछ पदार्थों को स्वतंत्र रूप से झिल्ली के माध्यम से झिल्ली से गुजरने की अनुमति देते हैं। इस तरह के एक transmembrane ताकना का एक उदाहरण Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus α-toxin है (विष का दूसरा नाम α-hemolysin है। इसमें "hemo" और "lysine" भाग होते हैं। लाल रक्त कोशिकाओं का अर्थ है; "लाइसिन") शब्द "lysis" से, "सेल डेथ" है)


Α-hemolysin oligomer की त्रि-आयामी संरचना - जीवाणु Staphylococcus aureus का विष। बाईं ओर की तस्वीर में, समय स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है।

रोगजनक प्रक्रिया में α-hemolysin का मुख्य कार्य कोशिका झिल्ली में अनियंत्रित चैनलों का निर्माण है, जो पर्यावरणीय स्थितियों पर निर्भर करते हुए, मोनोवलेंट आयनों, कैल्शियम आयनों या एटीपी को पारित कर सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, आयनिक असंतुलन अत्यंत विषाक्त है, और सेल से एटीपी का परिवहन हानिकारक है, क्योंकि एटीपी किसी भी सेल के लगभग सभी रासायनिक प्रक्रियाओं में एक अनिवार्य लिंक है।

२.२) सक्रिय परिवहन

जैसा कि उपरोक्त उदाहरणों से देखा जा सकता है, सुगम प्रसार में ऊर्जा की आवश्यकता नहीं होती है। इसके विपरीत, सक्रिय परिवहन हस्तांतरण के प्रत्येक कार्य के लिए ऊर्जा के व्यय के साथ एक सेल द्वारा किसी चीज का अवशोषण या विमोचन है। यह बड़े ध्रुवीय अणुओं या आयनों का परिवहन हो सकता है, और आयनों का परिवहन एकाग्रता ढाल के साथ और इसके खिलाफ दोनों को किया जा सकता है। बेशक, सक्रिय परिवहन एक नियंत्रित प्रक्रिया है जिसमें इंट्रासेल्युलर और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का एक पूरा सेट शामिल होता है। इस प्रकार, पहले सेल को इन सभी प्रोटीनों को संश्लेषित करने पर संसाधनों को खर्च करने की आवश्यकता होती है, और फिर इस परिवहन प्रणाली के उपयोग पर फिर से ऊर्जा खर्च होती है।

सक्रिय परिवहन का एक उदाहरण हाइड्रोफोबिक और एम्फीफिलिक यौगिकों के ऊर्जा-निर्भर परिवहन की प्रणाली है जो एक कोशिका से वापस पर्यावरण (इफ्लक्स) तक पहुंचता है।


एक जीवाणु कोशिका से बाहर तक एक एंटीबायोटिक के सक्रिय परिवहन की प्रणाली, जिसमें तीन प्रोटीन होते हैं, जो एक एकल ट्रांसमेम्ब्रेन कॉम्प्लेक्स बनाते हैं। यह आंकड़ा इस तथ्य को दर्शाता है कि फ्लोटक्स ट्रांसपोर्टर प्रोटीन (वायलेट) दवा के अणुओं को सीधे साइटोप्लाज्म और झिल्ली में "पकड़" सकता है।

यह प्रणाली विशेष रुचि की है क्योंकि यह एंटीबायोटिक दवाओं के लिए कुछ बैक्टीरिया के बहु-प्रतिरोध का कारण बनती है: इससे पहले कि वे इसे गंभीरता से ले सकें, सेल को उनसे छुटकारा मिल जाता है। इसके अलावा, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा स्यूडोमोनस एरुगिनोसा के मल्टीड्रग प्रतिरोध के आधे से अधिक मामले एंटीबायोटिक दवाओं के सक्रिय परिवहन से जुड़े हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, "नई" एंटीबायोटिक दवाओं के सक्रिय प्रवाह प्रणाली पहले ही पता चला है कि बैक्टीरिया के खिलाफ उपयोग किया जाता है जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले जीवाणुरोधी दवाओं के लिए प्रतिरोधी होते हैं। उदाहरण के लिए, शास्त्रीय एंटीबायोटिक दवाओं की अप्रभावीता के मामले में इस्तेमाल की जाने वाली दवा लाइनज़ोलिड को एक्राब और टोलसी प्रोटीन पर आधारित इफ्लक्स प्रणाली द्वारा वापस फेंक दिया जाता है। एक और दिलचस्प तथ्य यह है कि एक स्मार्ट जीवाणु उन स्थितियों में एफ्लक्स सिस्टम के प्रोटीन के बड़े पैमाने पर संश्लेषण पर ऊर्जा बर्बाद नहीं करता है जब उन्हें ज़रूरत नहीं होती है। लेकिन जैसे ही कोशिका के लिए हानिकारक पदार्थ दिखाई देते हैं, संश्लेषण तेजी से सक्रिय होता है और जीवाणु सक्रिय रूप से विरोध करना शुरू कर देता है। वैसे, एंटीबायोटिक दवाओं से बैक्टीरिया की रक्षा के लिए एफ्लॉक्स एकमात्र तंत्र नहीं है, मैं अन्य तरीकों के बारे में भी एक लेख लिखूंगा।


लाइनज़ोलिड की संरचना एक एंटीबायोटिक है जिसका उपयोग ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के प्रतिरोधी उपभेदों के खिलाफ किया जाता है।

3) बैक्टीरिया कोशिकाओं की क्षमता

इसलिए, हमने यौगिकों के ट्रांसमेम्ब्रेन परिवहन के तंत्र की जांच की, जो बाहरी सहायता के बिना इस बाधा को घुसना नहीं कर सकता है। प्राकृतिक परिस्थितियों में, जीवाणु में डीएनए का परिवहन केवल इंट्रासेल्युलर और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन दोनों के एक पूरे स्पेक्ट्रम के सहयोग के कारण सक्रिय परिवहन के माध्यम से किया जाता है। किसी कोशिका की बाहर से डीएनए को अवशोषित करने की असंबंधित क्षमता को "प्राकृतिक क्षमता" कहा जाता है।

3.1) जीवाणु कोशिकाओं की प्राकृतिक क्षमता

बैक्टीरिया की प्राकृतिक क्षमता के उद्भव की सबसे प्रबल परिकल्पना यह धारणा है कि यह तंत्र बैक्टीरिया को उनके लिए चरम स्थितियों में जीवित रहने की अनुमति देता है (सेल के लिए चरम स्थिति "तनाव" कहा जाता है)। तथ्य यह है कि तनाव अक्सर जीवाणु के "गुणसूत्र" डीएनए को नुकसान पहुंचाता है और यदि कोशिका जीवित रहना चाहती है, तो उसे किसी तरह "मरम्मत" करने की आवश्यकता है "क्रोमोसोम" (इस तरह के "मरम्मत" को "मरम्मत" कहा जाता है)। इसके अलावा, यह ज्ञात है कि यदि डीएनए अनुक्रम को उस सेल में पेश किया जाता है जो सेल के स्वयं के डीएनए के कुछ भाग के समान है, तो यह इस "नए" टुकड़े को अपने जीनोम में एकीकृत करने की अत्यधिक संभावना है। तनावपूर्ण परिस्थितियों में क्या होता है? कुछ कोशिकाएं मर जाती हैं, अपने भाइयों के लिए डीएनए दाता बन जाती हैं जो अभी भी जीवन के लिए लड़ रहे हैं। वास्तव में, एक ही जीवाणु संस्कृति के भीतर, यह बहुत संभावना है कि प्रतिनिधियों के जीनोम बहुत समान हैं, इसलिए जीवित बैक्टीरिया मृत रिश्तेदारों के डीएनए का उपयोग उनके जीनोम की मरम्मत के लिए कर सकते हैं।

इसके अलावा, सेल संस्कृति में आरामदायक परिस्थितियों में, उनमें से केवल एक अंश में प्राकृतिक क्षमता है, और उनकी कुल संख्या के सक्षम कोशिकाओं का अनुपात सबसे बड़ा है, फिर संस्कृति एक निश्चित वृद्धि चरण में है - लॉग चरण।


समय के साथ संस्कृति में बैक्टीरिया का एक विशिष्ट भूखंड। लॉग चरण वृद्धि चरण है, इसके बाद एक पठार और विलुप्त होने का चरण होता है, जिसमें कोशिकाओं में पहले से ही पोषक तत्वों की कमी होती है और विषाक्त पदार्थ जमा होते हैं।

बेशक, शोधकर्ता प्लास्मिड वेक्टर को सेल में स्थानांतरित करने की प्रक्रिया को यथासंभव प्रभावी बनाना चाहेगा: अच्छे परिणाम की गारंटी देने के लिए परिवर्तन प्रक्रिया जितनी अधिक कुशल होगी, उतनी ही कम प्लाज्मिड वेक्टर की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रयोगशाला स्थितियों में, वे आमतौर पर सेल पर ही भरोसा नहीं करते हैं, बल्कि कृत्रिम क्षमता के साथ कोशिकाओं का निर्माण करते हैं।

3.2) जीवाणु कोशिकाओं की कृत्रिम क्षमता

बैक्टीरिया की कृत्रिम क्षमता बनाने के लिए दो मुख्य विधियाँ हैं: अल्पकालिक ताप और उसके बाद के विद्युतीकरण के बाद शिथिल आयनों के साथ एक सेल संस्कृति का उपचार।

3.2.1) शिरापरक आयनों के साथ कोशिका संवर्धन का उपचार, इसके बाद अल्पकालिक तापन।

आमतौर पर, एक प्रयोगशाला में लगभग -80 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक रेफ्रिजरेटर होता है (कभी-कभी उन्हें हमारे देश में निर्माण कंपनियों में से एक के सम्मान में "केल्विनेटर" कहा जाता है), जो लॉग चरण में कोशिकाओं के साथ परीक्षण ट्यूबों से भरा होता है। ऐसा इसलिए किया जाता है ताकि जरूरत पड़ने पर हर बार उन्हें समय बर्बाद न करना पड़े (और इसमें बहुत समय लगता है, यह एक दिन में तेजी से काम नहीं करेगा)। और इसलिए कि भंडारण के दौरान कोशिकाएं ठंड के कारण नहीं मरती हैं, क्रायोप्रोटेक्टेंट्स को मध्यम में जोड़ा जाता है: ग्लिसरॉल, प्रोपलीन ग्लाइकोल या डाइमिथाइल सल्फॉक्साइड।


चित्र के लेखक की दृष्टि में प्रयोगशाला रेफ्रिजरेटर।

जब एक शोधकर्ता को एक विशिष्ट तनाव को बदलने की आवश्यकता होती है, तो वह केल्विनेटर से कोशिकाओं को निकालता है और ट्यूब को बर्फ में रखता है। फिर, समतुल्य उद्धरण और प्लास्मिड वेक्टर की जरूरत है जिसे हम वृद्धि के लॉग चरण में कोशिकाओं में जोड़ते हैं। टेस्ट ट्यूब को बर्फ नहीं छोड़ना चाहिए। इस तरह के उद्धरणों का एक विशिष्ट दाता कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) है, इस मामले में, हमारा शिष्टाचार Ca2 + है। Ca2 + जीवाणुओं को घुसने में डीएनए की मदद कैसे करता है, इसकी कोई स्पष्ट व्याख्या नहीं है:

1. कुछ स्रोतों का दावा है कि Ca2 + की उच्च सांद्रता कोशिका झिल्ली और डीएनए क्षति में अंतराल का कारण बनती है, और पहले हमने पाया था कि डीएनए क्षति कोशिका के सक्षम होने का संकेत है;
2. अन्य स्रोतों के अनुसार, ये आयन एक "पुल" के रूप में काम करते हैं जो सेल को प्लाज्मिड वेक्टर संलग्न करता है। तथ्य यह है कि सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आयन एक साथ बैक्टीरिया के बाहरी झिल्ली पर पॉलीसेकेराइड के नकारात्मक चार्ज किए गए समूहों से जुड़े होते हैं और प्लास्मिड डीएनए के नकारात्मक चार्ज किए गए समूहों से जुड़े होते हैं। यदि माध्यम में कोई आयन नहीं थे, तो डीएनए को सेल से निरस्त कर दिया जाएगा, और यह शोधकर्ता के लिए पूरी तरह से बेकार है।

यह संभव है कि दोनों परिकल्पनाएं सच हों।


परिवर्तन में सीए 2 + आयनों की भागीदारी का माना तंत्र। सबसे पहले, आयन डीएनए (पीले घेरे) और पॉलीसैकराइड के झिल्ली (पीले घेरे) में लंगर डाले नकारात्मक चार्ज किए गए समूहों से जुड़ते हैं। फिर, आयन के कारण, एक प्रकार का पुल बनता है: "पॉलीसेकेराइड (-)" - "सीए आयन (2+)" - "डीएनए (-)", जो कोशिका की सतह पर डीएनए को ठीक करता है।

लगभग शून्य तापमान पर बैक्टीरिया के ऊष्मायन के बाद, तथाकथित गर्मी आघात का उत्पादन किया जाता है - संस्कृति का अल्पकालिक ताप 42 डिग्री। आमतौर पर, गर्मी उपचार की अवधि 30-45 सेकंड होती है, जिसके बाद बैक्टीरिया के साथ टेस्ट ट्यूब बर्फ के स्नान पर लौट आती है (अधिक गर्मी के झटके से कोशिकाएं मर सकती हैं)। हीट शॉक की प्रभावशीलता के संभावित कारण समान तंत्र हैं: उच्च तापमान डीएनए और प्रोटीन (यह क्षमता को प्रेरित करता है) को नुकसान पहुंचा सकता है, और सेल झिल्ली में "छेद" भी बना सकता है जिसके माध्यम से कैल्शियम आयनों के माध्यम से झिल्ली से जुड़े प्लास्मिड वैक्टर घुसना करते हैं।

तब कोशिकाओं को पेट्री डिश पर चयनात्मक माध्यम के साथ चढ़ाया जाता है और उन पर कालोनियां बढ़ती हैं।

३.२.२) विद्युतीकरण

विद्युतीकरण विधि का आधार तथ्य यह है कि विद्युत क्षेत्र कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है। यही है, वस्तुतः, विद्युतीकरण विद्युत क्षेत्र द्वारा छिद्रों का निर्माण है।

सबसे पहले, बैक्टीरिया और एक प्लास्मिड वेक्टर को एक विशेष ट्यूब (क्युवेट) में रखा जाता है। फिर क्युवेट को एक विशेष उपकरण में रखा जाता है, जो एक दूसरे विभाजन के लिए 0.1-10 kV का संभावित अंतर पैदा करता है, जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली और प्रतिवर्ती क्षति हो सकती है और वैक्टर स्वतंत्र रूप से कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। कुछ समय बाद, जीवाणु संस्कृति को पेट्री व्यंजन पर चयनात्मक माध्यम से बीज दिया जाता है।

तरल माध्यम के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता जिसमें विद्युतीकरण के समय कोशिकाएं और वेक्टर स्थित होते हैं, आयनों की कम सांद्रता होती है: अन्यथा, एक शॉर्ट सर्किट हो सकता है।

अंतभाषण

एक प्लेट पर प्रत्येक कॉलोनी एक एकल जीवाणु के प्रसारकर्ता वंशज हैं (अर्थात, यदि हम एक प्लेट पर 100 कॉलोनियों को देखते हैं, तो इसका मतलब है कि शुरू में 100 व्यवहार्य बैक्टीरिया थे, जो तब विभाजित होने लगे थे)।कॉलोनियों के व्यंजन पर दिखाई देने के बाद, शोधकर्ता कॉलोनियों में से एक का चयन करता है और कॉलोनी से कोशिकाओं को एक नए चयनात्मक तरल पोषक माध्यम में स्थानांतरित करता है। एक नए सेल कल्चर के "बढ़ने" के बाद इसे फिर से उसी समान पोषक तत्व वाले नए कप पर लगाया जाता है। नतीजतन, हमें एक कप मिलता है जिस पर केवल एक ही कॉलोनी से बैक्टीरिया के वंशज बढ़ते हैं (वास्तव में, वे सभी एक ही जीवाणु के क्लोन हैं)। और इन कोशिकाओं का उपयोग भविष्य में केवल उन प्रोटीनों को प्राप्त करने के लिए किया जाएगा जिनकी हमें तरल चयनात्मक पोषक तत्व माध्यम की बड़ी मात्रा में आवश्यकता है।

खैर, इंटरमीडिएट के परिणामों का सारांश दें:

1. हमने उस जीन को संश्लेषित किया जिसकी हमें आवश्यकता है;
2. इसे एक उपयुक्त प्लास्मिड वेक्टर में डालें;
3. एक उपयुक्त उत्पादक तनाव का चयन और रूपांतरण किया गया;
4. एक क्लोन संस्कृति मिली;
5. अंत में, हम एक बड़ी मात्रा में प्रोटीन प्राप्त करने के लिए पोषक तत्वों के माध्यम की एक बड़ी मात्रा में इन क्लोनों का हिस्सा स्थानांतरित कर देते हैं।

अगला कदम: परिणामस्वरूप बायोमास से प्रोटीन को शुद्ध रूप में अलग करना। लेकिन यह पूरी तरह से अलग कहानी है।