बैक्टीरिया की जेनेटिक इंजीनियरिंग: बैक्टीरिया से हमें जो प्रोटीन चाहिए, उसे कैसे प्राप्त किया जाए

इसलिए, जीवाणुओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग पर दो पिछले लेखों में ( एक बार और दो बार ) हमें पता चला कि हमें जिन जीनों की आवश्यकता है, उन्हें किस रूप में जीवाणु में पेश किया जा सकता है, और वास्तव में उन्हें वहां कैसे पेश किया जा सकता है। मान लीजिए कि हमने प्रोटीन के उत्पादन के लिए जैव-रासायनिक बनाने के लिए इन सभी जोड़तोड़ों को किया। फिर अब यह एक छोटा सा व्यवसाय है - हमारे प्रोटीन को इसके शुद्ध रूप में जीवाणु से प्राप्त करना।
इस समस्या को हल करने के लिए कई तरीके हैं, उनमें से ज्यादातर क्रोमैटोग्राफी से संबंधित हैं। पढ़ें कि ये तरीके बिल्ली के नीचे कैसे काम करते हैं।

स्थिर चरण उनके (-OH) -ग्रुप से गुजरने वाले अणुओं को "पकड़ता" है।

इसलिए, हमें उस स्ट्रेन की ज़रूरत थी जो बायोमास को बढ़ाए। अब हमें किसी तरह इसके प्रोटीन को निकालने की जरूरत है।

सबसे पहले, हम अपनी संस्कृति लेते हैं और इसे अपकेंद्रित्र की बोतलों में डालते हैं। बैक्टीरिया बल्कि बड़ी और भारी वस्तुएं हैं, इसलिए, उन्हें अवक्षेपित करने के लिए, अपकेंद्रित्र के दौरान राक्षसी अधिभार मूल्यों की आवश्यकता नहीं होती है: 10000 ग्राम 20 मिनट के लिए पर्याप्त से अधिक होगा। नतीजतन, हम बोतलों और एक तरल के तल पर तलछट प्राप्त करते हैं (इसे सुपरनैटेंट कहा जाता है)। हम तरल बाहर निकालते हैं, क्योंकि हमारा प्रोटीन बैक्टीरिया में होता है जो तलछट में होता है। आप परिस्थितियों के अनुसार आगे बढ़ सकते हैं: या तो तुरंत प्राप्त वेग के साथ काम करें, या जब तक जरूरत न हो तब फ्रीज और स्टोर करें। इसे बहुत लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। कीचड़ के साथ काम करने की आगे की प्रक्रिया इस बात पर निर्भर नहीं करती है कि हमने इसे फ्रीजर में संग्रहीत किया है या नहीं।

मान लीजिए कि यह तलछट के साथ काम करने का समय है। आगे क्या है?

सबसे पहले, हमें कोशिकाओं को नष्ट करने की आवश्यकता है ताकि प्रोटीन बाहर निकल सके। ऐसा करने के लिए, निम्नलिखित विधियों का उपयोग करें:

• अनुक्रमिक फ्रीज-पिघलना। सेल झिल्ली के विनाश के लिए सबसे प्रभावी उपकरण नहीं है, लेकिन यह प्रोटीन के लिए सुरक्षित है, इसलिए अक्सर ऐसे कई चक्रों से शुरू होता है, और फिर अधिक प्रभावी तरीकों पर आगे बढ़ता है;
  
• अल्ट्रासाउंड उपचार (sonication)। विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, यह सरल और प्रभावी है। अल्ट्रासाउंड को आमतौर पर एक लम्बी "स्पीकर" का उपयोग करके सीधे पानी की मात्रा तक पहुंचाया जाता है जो कोशिकाओं के साथ द्रव में डाला जाता है ताकि "स्पीकर" का अंत लगभग नीचे तक पहुंच जाए। यह एक बहुत कठिन विधि है। एक नरम विकल्प भी है - अल्ट्रासाउंड को पानी के स्नान में खिलाया जाता है जिसमें ट्यूब तैर रहे हैं।
  
  
  
  
  एमआईटी का एक स्नातक चेतावनी देता है - अपने बेटों को ध्यान से देखें।
  
  कोशिकाओं के अल्ट्रासोनिक विनाश का संचालन करते समय, तापमान की निगरानी करना महत्वपूर्ण होता है: पानी अल्ट्रासाउंड के प्रभाव में जल्दी से गर्म होता है, और हमें अपने प्रोटीन को बिल्कुल भी नकारने की आवश्यकता नहीं है, और इससे भी अधिक हम इसे उबालना नहीं चाहेंगे। इसलिए, पहले मामले में ("लम्बी कॉलम" के साथ), कोशिकाओं के साथ परीक्षण ट्यूब को बर्फ और पानी के साथ एक कप में डाला जाता है, और बहुत सारी बर्फ होनी चाहिए। इस मामले में पानी बर्फ के बीच एक थर्मल इंटरफेस के रूप में कार्य करता है और इसके द्वारा ठंडा किया गया टेस्ट ट्यूब। "नरम विकल्प" के मामले में, बर्फ को सीधे पानी के स्नान में जोड़ा जाता है।
  
  
  "हार्ड" अल्ट्रासोनिक प्रसंस्करण का प्रदर्शन। स्थापना के पास खड़े भयानक शोर पर ध्यान दें, यह विशेष रूप से इस वीडियो के 2:06 बजे सुना जाता है। किसी को सबसे अच्छा वे के रूप में बचाया जाता है: कोई सोनिकेशन की अवधि के लिए कमरे से बाहर जाने की कोशिश करता है, कोई विशेष शोर-अवशोषित हेडफ़ोन पहनता है।
  
  
  "नरम" अल्ट्रासोनिक उपचार का प्रदर्शन।
  
• माध्यम में lysing एजेंटों को जोड़ना। ये मुख्य रूप से डिटर्जेंट हैं, यानी "साबुन" (सामान्य तौर पर, अंग्रेजी में "डिटर्जेंट" शब्द का अर्थ "डिटर्जेंट") है। डिटर्जेंट अनिवार्य रूप से कोशिका झिल्ली में लिपिड से संबंधित होते हैं। एक बार कोशिकाओं के साथ वातावरण में, डिटर्जेंट झिल्ली में एकीकृत होने लगते हैं, जिससे उनका विनाश होता है। और हमें बस इसकी जरूरत है। कभी-कभी लाइसोजाइम भी जोड़ा जाता है - एक एंजाइम जो बैक्टीरिया कोशिका की दीवार को नष्ट कर देता है।
  
• फ्रेंच प्रेस। सेल निलंबन को इनलेट वाल्व के माध्यम से काम कर रहे सिलेंडर में चूसा जाता है, जहां से इसे एक संकीर्ण स्लॉट के माध्यम से एक प्रेस द्वारा निचोड़ा जाता है। जब कोशिका कोशिका दीवार और झिल्ली के विनाश की ओर ले जाती है, तो वायुमंडलीय दबाव के दबाव में एक बूंद से उत्पन्न होने वाली अनुप्रस्थ शक्तियां।

अपने अनुभव से, मैं कह सकता हूं कि डिटर्जेंट के साथ संयोजन में sonication आमतौर पर पर्याप्त से अधिक है।

तो, हमें एक सेल लाइसेट - "सूप" मिला, जिसमें हमें प्रोटीन की आवश्यकता होती है और "कचरा" (क्रोमोसोमल और प्लास्मिड डीएनए, सेल की दीवार के टुकड़े, विभिन्न प्रोटीन, आदि) की एक बड़ी मात्रा होती है। इन सब से कैसे छुटकारा पाया जाए?

पहला सवाल जिसका उत्तर दिया जाना चाहिए: "कोशिका में हमारा प्रोटीन किस रूप में मौजूद था?" दो मुख्य विकल्प हैं:

• प्रोटीन लसीका से पहले घुलनशील था और बहुत अधिक संभावना के साथ, इसके बाद भी बना रहा, जिसका अर्थ है कि हम इसे अपकेंद्रित्र द्वारा तलछट नहीं कर सकते। लेकिन हम लसीक के बाद छोड़े गए बड़े "कचरा" को हटा सकते हैं: इस तरह हम सेल की दीवार, गुणसूत्र डीएनए और अन्य बड़े टुकड़ों से छुटकारा पा लेंगे। अवक्षेप को छोड़ दिया जाता है, और सतह पर तैरनेवाला क्रोमैटोग्राफी के लिए भेजा जाता है;
  
• बैक्टीरिया साइटोप्लाज्म की स्थिति में प्रोटीन अघुलनशील था और इसने तथाकथित गठन किया "समावेश निकायों" lysis के बाद संरक्षित। समावेशन निकाय प्रोटीन के मोदक होते हैं जो अगर संश्लेषण के दौरान प्रोटीन को मोड़ने का समय नहीं देते (यानी, इसका सामान्य घुलनशील रूप लेते हैं) इससे पहले कि यह इसी तरह के गैर-मुड़े हुए प्रोटीन से टकरा जाए। अनफोल्डेड प्रोटीन लगभग हमेशा हाइड्रोफोबिक पैच बाहर चिपके रहते हैं, जिसकी मदद से वे एक दूसरे से चिपके रहते हैं। दो गिलहरियों के "एक साथ फंस जाने" के बाद उन्हें अपनी तह को पूरा करने के लिए पर्याप्त स्वतंत्रता नहीं है। फिर एक तीसरा, चौथा, पांचवा उनके लिए तैर गया ...। नतीजतन, एक प्रोटीन ग्रेन्युल बनता है। आमतौर पर यह तब होता है जब हम बैक्टीरिया में यूकेरियोटिक प्रोटीन को संश्लेषित करते हैं (जैसा कि मैंने पहले लिखा था, जीवाणु उन्हें मोड़ नहीं सकता है)। नतीजतन, हमारे पास "खराब" स्थानिक संरचना के साथ प्रोटीन का एक द्रव्यमान है। लेकिन हर बादल में एक चांदी का अस्तर होता है, क्योंकि अंत में दाने बनते हैं, लगभग पूरी तरह से प्रोटीन से युक्त होता है जिसकी हमें आवश्यकता होती है!
  
  चूंकि इस मामले में हमारा प्रोटीन अघुलनशील है, तो जब सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, तो यह "कचरा" के साथ तलछट में होता है। हम सतह पर तैरनेवाला त्याग देते हैं, और फिर तलछट में शव सब कुछ अनावश्यक से धोया जाता है:
  
  1. वॉश बफर नंबर 1 डाला गया था, जिसमें "तलछट नंबर 1 का कचरा घटक" भंग हो गया था;
  2. चिकनी होने तक उपजी को हिलाओ और इसे शेकर (एक उपकरण जो हिलाता है) पर रखें;
  3. सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित और डाला गया था। परिणामस्वरूप, बफर नंबर 1 धोने में जो भंग किया गया था, उसे वेग से अलग किया गया था;
  4. वॉश बफर नंबर 2 डाला गया था, जिसमें "तलछट नंबर 2 का कचरा घटक" भंग हो गया था;
  5. अच्छी तरह से और इतने पर। आम तौर पर लगभग 5 washes की आवश्यकता होती है।
  
  मैं आपको एक बार फिर याद दिलाता हूं कि अगर हम समावेश निकायों के साथ काम कर रहे हैं, तो हम एक अनकहे प्रोटीन के साथ काम कर रहे हैं, जिसका अर्थ है कि यह इसमें निर्धारित कार्यों को पूरा करने में सक्षम नहीं है। इसलिए, बाद की सफाई से पहले, यह refolding है, अर्थात, इसे सक्रिय रूप में लाया जाता है। सबसे सामान्य रीफॉल्डिंग विधि में निम्नलिखित चरण होते हैं:
  
  1. "गैर-शारीरिक" स्थितियों में निकायों को भंग करें। आमतौर पर, शरीर द्विध्रुवीय यूरिया की उपस्थिति में उच्च पीएच (लगभग 12) में अच्छी तरह से भंग कर देते हैं। इस पद्धति का विचार यह है कि मध्यम में उच्च पीएच में बहुत कम प्रोटॉन होते हैं और हर कोई जो उनसे छुटकारा पा सकता है वह आसानी से कर सकता है। प्रोटॉन को सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है, जिसका अर्थ है कि सभी प्रोटॉन दाताओं को एक नकारात्मक चार्ज प्राप्त होता है, और फिर कूलम्ब का नियम सब कुछ करता है - एक बड़े नकारात्मक चार्ज वाले प्रोटीन एक दूसरे को पीछे हटाना शुरू करते हैं;
     
  2. ड्रॉप बाय ड्रॉप "प्रोटीन समाधान" की पूरी मात्रा को पहले पैराग्राफ से बफर की एक बहुत बड़ी सक्रिय रूप से मिश्रित मात्रा के साथ जोड़ते हैं जो कि प्रोटीन के लिए आरामदायक हैं। इस चरण का विचार यह है कि, कम प्रोटीन सांद्रता में, वह अपने अनपेक्षित समकक्ष से मिलने से पहले गुना की अधिक संभावना रखता है। आमतौर पर, प्रोटीन समाधान की छोटी बूंद को बफर वॉल्यूम में कम से कम 10 बार समाधान की मात्रा से अधिक किया जाता है।

तो, हम एक तह राज्य में प्रोटीन समाधान के कुछ संस्करणों के लिए तैयार हैं। आगे की प्रक्रिया किसी भी "प्रारंभिक स्थितियों" के लिए समान है - हम 100-450 एनएम (ताकि क्रोमैटोग्राफिक कॉलम और स्वयं क्रोमैटोग्राफ को रोकना नहीं है) के एक ताकना आकार के साथ फिल्टर के माध्यम से हमारे समाधानों को फ़िल्टर करते हैं, और फिर क्रोमैटोग्राफी करते हैं।

क्रोमैटोग्राफी के प्रकार

किसी भी क्रोमैटोग्राफी का सिद्धांत यह है कि समाधान के विभिन्न घटक अलग-अलग गति से कॉलम से गुजरते हैं, परिणामस्वरूप, जो घटक "स्तंभ के प्रवेश द्वार पर" गए थे वे अलग-अलग समय पर निकलते हैं।

लेकिन पहले, चलो एक अन्य विधि को याद करते हैं - एक जेल में प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन।

यह विधि उनके द्रव्यमान के अनुसार प्रोटीन को अलग करने की अनुमति देती है। ऐसा करने के लिए, एक बफर जिसमें एसडीएस और एक डाई (आमतौर पर ब्रोमेनॉल ब्लू) होता है, को नमूने में जोड़ा जाता है। इसी समय, बफर का घनत्व पानी के घनत्व से अधिक है, यह इसलिए किया जाता है ताकि नमूना और बफर के मिश्रण को जेल पर कुओं में जोड़ना आसान हो। डाई को कुएं में नमूना पेश करने की प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए जोड़ा जाता है, और यह एक संकेतक के रूप में भी कार्य करता है कि यह फॉरेसिस को समाप्त करने का समय है: पेंट प्रोटीन की तुलना में तेजी से आगे बढ़ता है, इसलिए जब यह जेल के अंत तक पहुंचता है, तो फॉरेसिस बंद हो जाता है। यह बहुत सुविधाजनक है, क्योंकि हम जेल के साथ प्रोटीन की गति को नहीं देखते हैं।


एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन। सौ बार पढ़ने के बजाय एक बार पढ़ना और देखना बेहतर है। एक आणविक भार मार्कर को वीडियो में फ़ॉरेसिक पर पहले कुएं पर लागू किया जाता है, और अध्ययन किए गए नमूनों को शेष कुओं पर लागू किया जाता है।

एसडीएस एक प्रमुख घटक है: यह नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया डिटर्जेंट (सर्फेक्टेंट) प्रोटीन को निरूपित करता है, जिसके बाद यह उन्हें "घेरता है", और यह पता चलता है कि प्रोटीन का पालन करने वाले एसडीएस अणुओं की संख्या सीधे उसके द्रव्यमान के आनुपातिक है। फिर यह कॉम्बॉम्ब कानून से चलता है कि, आंदोलन के किसी भी प्रतिरोध की अनुपस्थिति में, एसडीएस अणुओं से घिरे सभी प्रोटीनों का विद्युत क्षेत्र में समान त्वरण होगा (बल बढ़ते हुए चार्ज के साथ रैखिक रूप से बढ़ता है, लेकिन द्रव्यमान चार्ज के साथ रैखिक रूप से बढ़ता है)।


प्रोटीन पर नकारात्मक चार्ज डिटर्जेंट एसडीएस की कार्रवाई की योजना। सबसे पहले, वह इसे निंदा करता है, और फिर इसे "लिफाफे" करता है। नतीजतन, प्रोटीन में एसडीएस से मिलकर एक नकारात्मक रूप से आवेशित शेल होता है, जिसका प्रभारी प्रोटीन के द्रव्यमान के सीधे आनुपातिक होता है।

और यहाँ PAAG (PAAG - polyacrylamide gel) हमारी सहायता के लिए आता है। पोलीमराइजेशन के दौरान, यह लगभग एक ही व्यास के चैनलों का एक नेटवर्क बनाता है, जिसके माध्यम से, क्रेटरिस परिबस, छोटी वस्तुएं बड़े लोगों के साथ तेजी से चलती हैं। जाहिर है, भारी प्रोटीन प्रकाश से बड़ा है, इसलिए हल्के प्रोटीन तेजी से चलते हैं।

वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, जेल को दाग दिया जाता है। अधिक सटीक रूप से, वे स्थान जहां प्रोटीन जेल में स्थित होता है, वे दागदार होते हैं - नीली धारियां (या काला, क्या रंग पर निर्भर करता है) प्राप्त किया जाता है। यह समझने के लिए कि कौन सा द्रव्यमान एक या दूसरे बैंड से मेल खाता है, आपको इसकी तुलना किसी चीज से करने की आवश्यकता है, इसलिए प्रत्येक जेल पर तथाकथित जेल लागू किया जाता है। "आणविक भार मार्कर" ज्ञात द्रव्यमान वाले घटकों का मिश्रण है।


आणविक भार मार्कर स्ट्रिप्स का एक उदाहरण। यह मार्कर इस लिहाज से भी सुविधाजनक है कि इसकी दो धारियों को एक व्यक्तिगत रंग में चित्रित किया गया है: लाल (70 किलोडालटन) और हरा (10 किलोडालटन)। यह एक्सपेरिमेंट को मार्कर में ही नेविगेट करने में मदद करता है। 1 डाल्टन, यह द्रव्यमान की एक परमाणु इकाई है, इसे एक मुक्त विश्राम कार्बन परमाणु -12 के द्रव्यमान के 1 of12 के रूप में परिभाषित किया गया है, जो जमीनी अवस्था में है।

ऐसा लगता है कि एक चमत्कार, एक विधि नहीं है - स्ट्रिप्स ओवरलैप नहीं करते हैं, जिसका अर्थ है कि प्रोटीन पूरी तरह से विभाजित हैं! लेकिन वास्तव में, वैज्ञानिकों ने औद्योगिक पैमाने पर प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन का संचालन करने का तरीका नहीं सीखा है और इसलिए हम अभी भी कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करते हैं।


किसी भी क्रोमैटोग्राफी की अनुमानित योजना। स्तंभ एक सिलेंडर है जिसमें कुछ भरा हुआ है। इस "कुछ" को "स्थिर चरण" कहा जाता है, और "मोबाइल चरण" वह समाधान है जिसके घटकों को हमें अलग करने की आवश्यकता है। घटक अलग-अलग गति से चलते हैं और इसलिए अलग से स्तंभ से बाहर निकलते हैं।

अधिकांश क्रोमैटोग्राफिक तकनीकें इस तथ्य पर आधारित होती हैं कि एक स्थिर स्तंभ भराव से चिपके हुए गिलहरी गुजरती है "अलग उत्साह के साथ": जो लोग अक्सर "चिपके" रहते हैं और सभी की तुलना में बहुत धीमी गति से चलते हैं, और जो लोग "चिपटना" नहीं करते हैं वे स्तंभ को जल्दी छोड़ देते हैं। नतीजतन, मिश्रण का एक बड़ा हिस्सा अक्सर स्तंभ को "पकड़ने" के बिना छोड़ देता है - वे क्रोमैटोग्राफी की शुरुआत में एक साथ बाहर निकलते हैं (इस अंश को "पर्ची" कहा जाता है, क्योंकि वे उस पर "पकड़ने" के बिना कॉलम के माध्यम से फिसल गए थे)। लेकिन उन लोगों के साथ क्या करना है जो "झुके हुए" हैं?

सबसे पहले, आइए जानें कि "क्लिंग्स" वाले कॉलम में क्या होता है। "हुक" स्वयं ही होता है क्योंकि स्थिर चरण की सतह पर कुछ होता है जो एक गुजरने वाले प्रोटीन को "कैप्चर" करने में सक्षम होता है (थोड़ी देर के लिए) कि यह कैसे होता है। यही है, "क्लिंगिंग" प्रोटीन ठोस अवस्था से जुड़ी अवस्था में कुछ समय बिताता है, फिर इससे टूट जाता है (अपने स्वयं के थर्मल गति, टकराव आदि के कारण), पर तैरता है, फिर से ठोस चरण में बांधता है, फिर से टूट जाता है और इसी तरह जब तक वह कॉलम छोड़ नहीं देता। यह स्पष्ट है कि अधिक बार और जितना अधिक यह स्थिर चरण में बांधता है, उतना ही धीमा यह स्तंभ के साथ चलता है।


क्रोमैटोग्राफी का सिद्धांत। मोबाइल चरण की गति (आकार के लिए समायोजित) के साथ कॉलम (स्लिप) पर नहीं जाता है। बाइंडिंग घटकों में अलग-अलग गति होती है, जो आउटपुट पर उनके पृथक्करण की ओर ले जाती है।

आम तौर पर, केवल मिश्रण में बहुत सारे खराब होने की स्थिति में, अलग-अलग घटक होंगे जो एक ही गति से चलते हैं, इसलिए हम केवल तब तक इंतजार कर सकते हैं जब तक वे स्तंभ से बाहर नहीं निकल जाते हैं। लेकिन अक्सर यह बहुत लंबे समय तक "बस इंतजार" होता है, क्योंकि घटक धीरे-धीरे चलते हैं। इस मामले में, उन्हें "अनुकूलित" होने की आवश्यकता है, और जिस तरह से वे "अनुकूलित" हैं, कॉलम के प्रकार पर निर्भर करता है।

अंत में, हम क्रोमैटोग्राफिक विधियों की स्वयं जांच करें, जो कि गोरों के औद्योगिक उत्पादन के लिए उपयुक्त हैं।

1. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी। विधि का विचार यह है कि स्थिर चरण में क्रोमैटोग्राफी की शर्तों के तहत एक चार्ज है। यदि चार्ज सकारात्मक है, तो वे "अनियन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी" के बारे में बात करते हैं, यदि नकारात्मक है, तो "उद्धरण-विनिमय" के बारे में।
   
   नाम का तर्क सरल है, आइए इसे एक उदाहरण के रूप में आयनों एक्सचेंजर का उपयोग करके विचार करें: मिश्रण के नकारात्मक चार्ज किए गए घटक "स्टिक" स्तंभ के सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए ठोस चरण में। इसके अलावा, अगर हम ठोस चरण की सतह पर कुछ विशिष्ट धनात्मक आवेशित समूह का अनुसरण करते हैं, तो एक या अन्य नकारात्मक रूप से आवेशित घटक इसे "छड़ी" करेंगे और उतरेंगे। इस प्रकार, स्टेशनरी और मोबाइल चरणों के बीच एक प्रकार का आयनों का आदान-प्रदान होता है, इसलिए नाम - "आयनों-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी"।
   
   जाहिर है, अगर हम अनियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करना चाहते हैं, तो हमें मिश्रण के पृथक्करण को ऐसी परिस्थितियों में करना चाहिए, जिसके तहत ठोस चरण को सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है। इसी समय, हमारे पास घटनाओं के आगे विकास के लिए दो विकल्प हैं, इन शर्तों के तहत प्रोटीन का क्या प्रभार है, इस पर निर्भर करता है: यदि "-" है, तो यह कॉलम पर "बैठ जाएगा" और अगर "+", तो यह पर्ची में होगा।
   
   संबंधित घटकों के उत्पादन में तेजी लाने के लिए, अर्थात् "क्षालन" कैसे किया जाए? आप दो तरीकों से कार्य कर सकते हैं:
   
   • आप मोबाइल चरण के पीएच को बदलकर स्थिर चरण और बाध्य घटकों के प्रभारी को बदल सकते हैं। धीरे-धीरे पीएच को बदलने की प्रक्रिया को अंजाम देना महत्वपूर्ण है, फिर घटक अपने आंदोलन को तेज करेंगे, लेकिन वे एक ही समय में "बाहर गिरना" नहीं करेंगे;
     
   • कॉलम में अन्य आयनों को जोड़ें। दरअसल, कॉलम में उन स्थानों की एक सीमित संख्या होती है जिनके लिए आयनों को जकड़ सकते हैं और यदि हम इन सभी स्थानों पर किसी चीज से कब्जा कर लेते हैं, तो मिश्रण के घटक तेजी से आगे बढ़ेंगे। आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी के लिए, क्लोरीन आयनों का जोड़ विशिष्ट है। प्रतिस्पर्धी आयनों की शुरूआत भी धीरे-धीरे की जानी चाहिए।
   
   कटियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए प्रक्रिया आम तौर पर एक ही है, केवल विपरीत।
   
   
   
   
   मोबाइल चरण के पीएच में परिवर्तन के कारण सावधानी के साथ कटियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी।
   1 - पीएच = 2 पर मोबाइल चरण में बहुत सारे प्रोटॉन होते हैं, इसलिए, सकारात्मक चार्ज प्राप्त करते समय, मिश्रण के सभी घटकों को तरल से उठाया गया था;
   2 - पीएच = 5 पर, मोबाइल चरण में प्रोटॉन की संख्या कम हो गई और "बैंगनी" घटक अब एक स्वीकर्ता के रूप में कार्य नहीं करता है, लेकिन प्रोटॉन दाता के रूप में; इसलिए, इस पीएच मान पर, चार्ज नकारात्मक है और यह स्तंभ छोड़ देता है। "ग्रीन" घटक अभी भी एक प्रोटॉन स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है और यह किसी दिए गए pH मान पर धनात्मक आवेश को बनाए रखता है, जिसका अर्थ है कि यह अभी भी स्तंभ पर टिका हुआ है;
   3 - पीएच = 9 पर मोबाइल चरण में बहुत कम प्रोटॉन होते हैं, "ग्रीन" घटक भी एक प्रोटॉन दाता बन जाता है, एक नकारात्मक चार्ज प्राप्त करता है और कॉलम को अंतिम छोड़ देता है।
   
   सामान्य तौर पर, आयन एक्सचेंजर के प्रकार की पसंद और अलगाव के लिए शर्तें इस बात पर निर्भर करती हैं कि हम क्या अलग करना चाहते हैं और हमारे मिश्रण में और क्या है।
   
2. एक अन्य पृथक्करण विधि कुछ पदार्थों के हाइड्रोफोबिसिटी (~ गैर-ध्रुवीयता) और हाइड्रोफिलिसिटी (~ ध्रुवीयता) पर आधारित है। यहाँ विचार बिल्कुल आयन एक्सचेंजर के मामले में जैसा है: उनके भौतिक गुणों के अनुसार, घटक हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक मीडिया के बीच "जल्दी", कुछ अधिक, कुछ कम।
   
   सबसे पहले, मैं आपको याद दिलाता हूं कि गैर-ध्रुवीय गैर-ध्रुवीय, और ध्रुवीय में ध्रुवीय में घुल जाता है। अक्सर "हाइड्रोफोबिक" और "गैर-ध्रुवीय" एक और "हाइड्रोफिलिक" और "ध्रुवीय" के समान होते हैं, हालांकि सामान्य मामले में ऐसा नहीं है। इथेनॉल एक गैर-ध्रुवीय विलायक का एक उदाहरण है, और पानी एक ध्रुवीय का एक उदाहरण है।
   
   
   
   
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