जेनेटिक्स और मुर्गियां: अंडा प्रोटीन में मानव CSF1-Fc प्रोटीन

एक बार की बात है एक दादा और एक महिला रहते थे। और उनके पास एक रायबा चिकन था। मुर्गे ने एक अंडकोष रखा, लेकिन एक साधारण नहीं, बल्कि एक आनुवंशिक रूप से संशोधित। एक अप्रत्याशित मोड़, सही? लेकिन आज इस पर चर्चा की जाएगी। पिछले दसियों या सैकड़ों वर्षों में फार्मास्यूटिकल्स बहुत बदल गए हैं। हम अब लीची का उपयोग नहीं करते हैं और लोबोटॉमी को माइग्रेन का एक उत्कृष्ट उपाय नहीं मानते हैं। अब एक महान कई दवाएं हैं जो कई प्रकार की बीमारियों का इलाज कर सकती हैं। इन दवाओं का आधार स्वाभाविक रूप से कुछ रासायनिक यौगिक हैं, जिनका उत्पादन कभी-कभी बड़ी कठिनाइयों से भरा होता है। और फिर वैज्ञानिक एक शानदार विचार के साथ आए - हमें इन सभी जटिल जैव-जनरेटर की आवश्यकता क्यों है, अगर आप मुर्गियों का उपयोग कर सकते हैं। जी हां, आपने सही सुना, यह मुर्गियां हैं जो अंडे को आवश्यक रासायनिक यौगिकों जैसे प्रोटीन के साथ ले जाएंगी। वैज्ञानिकों ने इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए मुर्गियों को कैसे बदल दिया है, इसके बारे में क्या आया है और क्या हमें दो मीटर मांसाहारी आनुवंशिक रूप से संशोधित मुर्गियों के साथ ग्रह पर कब्जा करने से डरना नहीं चाहिए, हम अनुसंधान समूह की रिपोर्ट से सीखते हैं। चलो चलते हैं।

अध्ययन का आधार

यह इस तथ्य से शुरू होने योग्य है कि जानवरों के बायोरिएक्टर के रूप में उपयोग कुछ क्रांतिकारी नया नहीं है। उदाहरण के लिए, एंटीथ्रॉम्बिन III - आनुवंशिक रूप से संशोधित (जीएम) बकरियों के दूध से प्राप्त एक दवा को 2006 में उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया था। दूसरे शब्दों में, बकरियों ने दूध बनाने वाली "प्रयोगशाला" के रूप में काम किया, जिसमें तैयारी में प्रयुक्त रासायनिक यौगिक शामिल था।

हालांकि, वैज्ञानिकों के अनुसार, इस तरह के उद्देश्यों के लिए बड़े जानवरों का उपयोग काफी महंगा है, छोटी संख्या में संतान, गर्भधारण की लंबी अवधि और फिर बड़े होने आदि को देखते हुए। यही कारण है कि उन्होंने अपना ध्यान मुर्गियों की ओर लगाया, और इस तथ्य के कारण भी कि चिकन अंडे में पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन होता है। औसत 60 ग्राम चिकन अंडे में लगभग 3.5 ग्राम प्रोटीन होता है। एक वर्ष में, एक मुर्गी लगभग 300 अंडे दे सकती है। हम यहां मुर्गियों के सस्ते रखने और सामान्य परिस्थितियों में संख्या में तेजी से वृद्धि को जोड़ते हैं।

इसके अलावा, आर्थिक लाभ के अलावा, वैज्ञानिक अधिक वैज्ञानिक नोट करते हैं। तो, मुर्गियों और मनुष्यों में, ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न, कार्बनिक अणुओं के लिए शर्करा के अतिरिक्त की प्रक्रिया बहुत करीब हैं। और इसका मतलब यह है कि अंडे की प्रोटीन की तैयारी की कम इम्युनोजेनेसिटी होगी जिसे सक्रिय करने के लिए ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता होती है।

यह सब बहुत ही रोचक लगता है, लेकिन हम जानते हैं कि अब तक चिकन अंडे का उपयोग औषधीय आधारों के स्रोत के बजाय आमलेट के लिए अधिक किया जाता है। यही है, इस अध्ययन में मुर्गियां सरल नहीं हैं, (नहीं, सोना नहीं, हालांकि वित्तीय दृष्टिकोण से यह हो सकता है) और आनुवंशिक रूप से संशोधित।

वैज्ञानिकों ने ध्यान दिया कि पहले, लेंटिवायरस का उपयोग चिकन जीन के संशोधनों को करने के लिए किया जाता था, क्योंकि वे आनुवंशिक जानकारी को पूरी तरह से मेजबान सेल में स्थानांतरित करते हैं। ओवलब्यूमिन (एग एल्ब्यूमिन एल्ब्यूमिन) जीन अनुक्रम का उपयोग करके डिंबवाहिनी में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को सीमित किया जा सकता है। इस पद्धति ने अंडे के प्रोटीन में दो जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन के निर्माण की अनुमति दी, हालांकि, अभिव्यक्ति का स्तर 1 जी / एल से काफी कम था। और यह ऐसी तकनीक के लिए वाणिज्यिक और औद्योगिक दृष्टिकोण से आकर्षक होने के लिए पर्याप्त नहीं है।

इस अध्ययन में, वैज्ञानिकों ने साइटोकाइन डाइमर सहित दो नए प्रोटीन के उत्पादन के एक और अधिक उन्नत तरीके को लागू करने का फैसला किया, साथ ही साथ एक बेहतर शुद्धि विधि भी। इंटरफेरॉन α2a, कैंसर और हेपेटाइटिस (पहले से ही अप्रचलित) के कुछ रूपों के उपचार के लिए एक पेटेंट जैविक तैयारी, एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

अध्ययन में मुख्य भागीदार मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (CSF1) था, जो 4-पेचदार बंडल है, अर्थात् यह संरचनात्मक रूप से कई साइटोकिन्स के समान है, जिसमें इंसुलिन, विकास हार्मोन, प्लेसेंटल लैक्टोजेन, आदि शामिल हैं। खैर, अध्ययन में मुख्य "निर्माता" मुर्गियाँ हैं। प्रयोगों द्वारा क्या परिणाम दिखाए गए और हम आगे विचार करेंगे।

अनुसंधान के परिणाम


चित्र संख्या 1

इंटरफेरॉन α2a कोडिंग अनुक्रम के 0.5 केबी (न्यूक्लियोटाइड्स / हज़ार जोड़ी जोड़े) को संश्लेषित किया गया और EREOVA प्रमोटर के साथ घोड़ों के प्रतिकृति-दोषपूर्ण विषुव संक्रामक एनीमिया वायरस के लेंटिवायरल वेक्टर में क्लोन किया गया।

अभिव्यक्ति की डिग्री बढ़ाने के लिए, एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व और स्टेरॉयड-निर्भर नियामक तत्व ( 1 ए ) के बीच ओवलब्यूमिन प्रमोटर अनुक्रम के 0.9 टीपीएन को जोड़ा गया था। यह यह लेंटिवायरल वेक्टर था जिसने ट्रांसजेनिक पक्षियों को प्राप्त करना संभव बना दिया था, जिसके बीच एक नर (जी 1) का पता चला था, जो एक अक्षुण्ण (पूरे / बरकरार) ट्रांसजेन का वाहक है। तदनुसार, यह इस नर से था कि ट्रांसजेनिक पक्षियों (वंश) की रेखा चली गई।

मानव इंटरफेरॉन α पर प्रतिक्रिया करने वाले एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से, प्रोटीन इम्युनोब्लॉट का उपयोग करके परीक्षण मुर्गियों ( 1 बी ) के अंडा प्रोटीन में इंटरफेरॉन α2a की उपस्थिति का पता लगाया गया था।

प्रोटीन इम्यूनोब्लोट * एक नमूने में प्रोटीन की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक विश्लेषणात्मक विधि है।

मात्रात्मक रूप से, α2a को एक एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख का उपयोग करके वर्णित किया गया था, जब एंटीबॉडी विशिष्ट एंटीजन से बंधते हैं, जिससे उनकी मात्रा निर्धारित करना संभव हो जाता है।

जैविक गतिविधि की पुष्टि करने के लिए, सफाई की प्रक्रिया से पहले, वैज्ञानिकों ने इंटरफेरॉन-उत्तेजित प्रतिक्रिया तत्व के रिपोर्टर जीन के साथ एक सेल ट्रांजिस्टर पर पतला अंडे का सफेद रखा, जो ल्यूसिफरेज अभिव्यक्ति ( 1 सी ) को नियंत्रित करता है।

रिपोर्टर जीन * - सेल संस्कृतियों में जीन की अभिव्यक्तियों का अध्ययन करने के लिए अन्य जीनों के नियामक अनुक्रमों में शामिल होता है।

लूसिफ़ेरस * - ऑक्सीडेटिव एंजाइम जो एक प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं, जिनमें से एक विशेषता bioluminescence है।

सभी जांचों के बाद, सफाई प्रक्रिया शुरू की गई, जिसमें निम्न शामिल थे:

• पीएच को कम करके ओवोमुसीन (अंडा प्रोटीन में ग्लाइकोप्रोटीन) का स्पष्टीकरण;
• एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करके ओवोमुसीन को हटाना;
• इंटरफेरॉन α2a की शुद्धिकरण कैप्चर हाईट्रैप ब्लू और आगे के आकार के बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग।

शुद्धिकरण की डिग्री (> 95%) की पुष्टि पॉलीक्रैलेमाइड जेल ( 1 डी ) में प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा की गई थी।

अंडे के सफेद रंग के 100 मिलीलीटर से 15 मिलीग्राम इंटरफेरॉन α2a प्राप्त करना संभव था, और यह एंजाइम इम्युनोसे ( 1e ) द्वारा पता लगाए गए इंटरफेरॉन α2a (25 मिलीग्राम) की मात्रा का लगभग 60% का प्रतिनिधित्व करता है।

आपके पास एक सवाल हो सकता है - लेकिन उन बीमारियों के बारे में जो इस इंटरफेरॉन α2a का उपयोग करके मुर्गियों से मनुष्यों में कूद सकते हैं। वैज्ञानिकों ने यह जाँच की है, और अधिक सटीक रूप से, α2a के एंटीवायरल गुणों को पहले α2a के साथ इलाज किया गया कोशिकाओं में टाइप ए H1N1 वायरस की शुरूआत करके। और इस विश्लेषण के परिणाम सकारात्मक (1 एफ ) से अधिक थे - अंडे के प्रोटीन से इंटरफेरॉन की एंटीवायरल गतिविधि 1x10 ⁹ यू / मिलीग्राम थी, जो कि बैक्टीरिया-निर्मित प्रोटीन की तुलना में अधिक परिमाण का एक आदेश है।


चित्र संख्या 2

मैक्रोफेज के भेदभाव, प्रसार और कामकाज में सबसे महत्वपूर्ण प्रोटीनों में से एक CSF1 है।

सुअर CSF1 कोडिंग अनुक्रम, F _c के साथ मिलकर, संश्लेषित किया गया था (pCSF1-F _c ) और EREOVA2 थ्रेसर के बीच lentiviral वेक्टर pLenti6 (HIV से पृथक) और वुडक हेपेटाइटिस वायरस ( 2a ) के बाद के ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटरी एलिमेंट में क्लोन किया गया था।

एफ _सी * (इम्युनोग्लोबुलिन का क्रिस्टलीकरण टुकड़ा) एक इम्युनोग्लोबुलिन अणु का एक हिस्सा है जो सेल की सतह पर एफ _सी रिसेप्टर के साथ और कुछ प्रोटीन के साथ बातचीत करता है।

नर (G0) को हटाने के बाद, जो कि वंश की एक नई रेखा का आधार बन गया, जिसके बीच दो महिलाओं और एक पुरुष में एक बरकरार ट्रांसजेन का पता चला था। बाद में इन व्यक्तियों ने अगली पीढ़ी के वंश (G2) के प्रजनन में भाग लिया। Polyacrylamide gel प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन में अंडे प्रोटीन ( 2b ) में pCSF1-F _c की उपस्थिति की पुष्टि की।

सुअर CSF1 को बा / एफ 3 कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था। इससे यह तथ्य सामने आया कि इन कोशिकाओं का बहुत अस्तित्व CSF1-F _c पर निर्भर था। इस प्रकार, परीक्षण अंडे प्रोटीन की सेल व्यवहार्यता का आकलन करना संभव था, जो नियंत्रण समूह (सामान्य अंडे से प्रोटीन) की तुलना में काफी अधिक था, जहां जीवित रहने की दर लगभग शून्य ( 2 सी ) थी।

इसके बाद, अंडों से pCSF1-F _से अंडा प्रोटीन को ओवोम्यूकिन _से शुद्ध किया गया और सतह पर तैरनेवाला राज्य (सतह पर तैरनेवाला, शुष्क अवशेषों के ऊपर तरल) में स्थानांतरित किया गया, जैसा कि छवि 2 डी में दिखाया गया है।

PCSF1-F _{c के} सक्रिय डिमेरिक रूप को MabSelect SuRe के आगे और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी ( 2e ) का उपयोग करके पॉलिशिंग द्वारा शुद्ध किया गया था। शुद्धता दर 97% से अधिक थी।

नतीजतन, औसत आणविक भार लगभग 95.1 केडीए (किलोडाल्टोन) था, प्रोटीन की मोनोडिस्पैरिटी भी संतोषजनक थी - एमडब्ल्यू / एमएन = 1.011 (एमडब्ल्यू वजन औसत आणविक भार है, एमएन संख्या औसत आणविक भार है)। कॉपोलीमर मॉडल के विश्लेषण से 85.6 केडीए प्रोटीन और 9.5 केडीए ऑलिगोसेकेराइड की उपस्थिति दिखाई दी।

सेल व्यवहार्यता का भी परीक्षण किया गया था - कुछ अंडे 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में रखे गए थे, और उसी अवधि के लिए भाग, लेकिन -80 डिग्री सेल्सियस पर। दोनों ही मामलों में, कोशिकाएं बच गईं ( 2 जी ), जो लंबी अवधि के भंडारण की संभावना और गतिविधि के नुकसान के बिना शुद्धि से पहले ही उनके आगे उपयोग का संकेत देती है।

CSF1 रिसेप्टर के साथ बातचीत करने के लिए शुद्ध प्रोटीन की क्षमता का विश्लेषण भी किया गया था। यह माउस बोन मैरो कोशिकाओं का उपयोग करके किया गया था, और परिणाम संतोषजनक ( 2h ) थे।


चित्र संख्या 3

इसके बाद, वैज्ञानिकों ने फील्ड स्थितियों के तहत अंडे के प्रोटीन से pCSF1-F _c की गतिविधि का परीक्षण करने का फैसला किया, अर्थात प्रयोगशाला चूहों में जिन्हें 1 μg / g नियंत्रण या शुद्ध pCSF1-F _c प्रोटीन के साथ इंजेक्ट किया गया था। उसके बाद, चूहों के जिगर, तिल्ली और रक्त के वजन और हिस्टोलॉजी की जाँच की गई। PCSF1-F _{c के} दोनों वेरिएंट्स ने रक्त में F4 / 80 ⁺ CD11b ⁺ कोशिकाओं की संख्या ( 3a ) और यकृत ( 3b ) में F4 / 80 ⁺ ऊतक के मैक्रोफेज की संख्या में वृद्धि की। यकृत और प्लीहा के वजन में उल्लेखनीय वृद्धि भी देखी गई ( 3 सी और 3 डी )।


चित्र संख्या 4

उपरोक्त परीक्षणों, विश्लेषणों और प्रयोगों ने बहुत अच्छे परिणाम दिखाए। अब यह केवल यह साबित करने के लिए बना हुआ है कि इस तरह के तरीके मानव साइटोकिन के उत्पादन की अनुमति दे सकते हैं, जिसका उपयोग दवाओं में किया जा सकता है।

वैज्ञानिक ध्यान दें कि pCSF1-F _c मानव कोशिकाओं में अच्छी गतिविधि दिखाता है और इम्यूनोजेनिक हो सकता है। इसकी पुष्टि करने के लिए, प्रयोगशाला चूहों को CSF1-F _c प्रोटीन के साथ प्रतिरक्षित किया गया था ताकि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन किया जा सके जो मानव CSF1 के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया करता है।

वास्तविक परीक्षण करने और उनके परिणामों का विश्लेषण करने से पहले, वैज्ञानिकों ने मानव CSF1-F _c प्रोटीन (hCSF1-F _c ) व्यक्त करने वाले मुर्गियों को तैयार किया। ऐसा करने के लिए, हमने पहले वर्णित तकनीक और वेक्टर प्रणाली का उपयोग किया। दो मुर्गियों में, एक अक्षुण्ण ट्रांसजीन का पता चला था जो आवश्यक प्रोटीन अभिव्यक्ति को 1 मिलीग्राम / एमएल ( 4 ए ) दिखाता है। उपरोक्त सफाई प्रक्रिया ( 4 बी ) द्वारा पीछा किया गया। वैक्यूम सुखाने और कटौती ( 4 सी ) के बाद भी शुद्ध एचसीएसएफ 1-एफ _सी की उत्तरजीविता दर अधिक थी।

अध्ययन की बारीकियों के साथ एक अधिक विस्तृत परिचित के लिए, मैं दृढ़ता से अनुशंसा करता हूं कि आप वैज्ञानिकों की रिपोर्ट देखें ।

उपसंहार

इस अध्ययन का परिणाम यह पुष्टि करता है कि इंटरफेरॉन α2a और CSF1-F _c नियमित रूप से अंडे के सफेद भाग के रूप में पूरी तरह संश्लेषित _{होते हैं} । इन प्रोटीनों के निष्कर्षण के लिए भी विशेष प्रयासों की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन केवल मानक क्रोमैटोग्राफिक तकनीक होती है। प्राप्त प्रोटीन प्रयोगशाला में और जीवित विषय (चूहों) के शरीर में दोनों सक्रिय हैं।

कई आनुवंशिक संशोधनों पर बहुत संदेह करते हैं। कुछ भी इस वाक्यांश से डरते हैं और सब कुछ जो इसके साथ जुड़ा हो सकता है। हालांकि, यह केवल इस बात की थोड़ी समझ के लायक है कि मानव जीन संशोधन क्या दृष्टिकोण दे सकते हैं, कैसे भय और पुरानी हठधर्मिता दूर हो जाती है। इस विशेष मामले में, हमने एक अध्ययन की जांच की जिसमें वैज्ञानिकों ने सचमुच मुर्गियों को मानव प्रोटीन के साथ अंडे देने के लिए मजबूर किया, जिसका उपयोग ड्रग्स बनाने के लिए आवश्यक घटकों को सस्ते, कुशलतापूर्वक और जल्दी से किया जा सकता है। हो सकता है कि ये मुर्गियाँ सुनहरे अंडे न लेती हों, लेकिन उनका मूल्य बहुत अधिक होता है।



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