घरेलू अनुक्रमण के कार्य (जून, 2019)

इस उन्नयन को पढ़ने से पहले, पहले प्रकाशित स्रोत कोड से खुद को परिचित करना उचित है।

ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज (ONT) द्वारा विकसित, रूस में बहुत पहले और सबसे लोकप्रिय नैनो पोर सीक्वेंसर मिनियन (यूके में न्यूनतम सेट $ 1000 है - 150 हजार रूबल), डिस्पोजेबल कोशिकाओं पर संचालित होता है, जिनमें से प्रत्येक $ 900 (में) है। रूस - 135 हजार रूबल)। ऐसी कोशिकाएं आपको 2 ... 3 दिनों में डीएनए 10 ... 20 जीबी को डिजिटल बनाने की अनुमति देती हैं। यह मानव जीनोम की अनुक्रमण के लिए बहुत कम है (आपको जरूरत है> 100 जीबी), लेकिन अन्य सभी नैदानिक ​​नैदानिक ​​उद्देश्यों (<1 जीबी पर्याप्त है) के लिए बहुत अधिक है।

हाल ही में अधिक उत्पादक (और अधिक महंगे) मॉडल बेचना शुरू किया - प्रोमेथियन 24/48 ($ 165,000 / $ 285,000), जिसका उद्देश्य मुख्य रूप से पूर्ण-जीनोम इन-लाइन अनुक्रमण है। अधिक महंगे उनके अधिक कुशल उपभोग्य हैं ($ 2,000 / यूनिट,> 100 जीबी)। सच है, वे थोक में सस्ता खर्च कर सकते हैं ($ 1,800,000 के लिए 2880 पीसी।, $ 625 / पीसी।), लेकिन इस तरह के अधिग्रहण (प्रति बैच 200 ... 250 मिलियन रूबल) रूसी बजट के लिए स्वीकार्य नहीं हैं।

और न केवल रूसी के लिए। इसलिए, हाल ही में ओएनटी सम्मेलन (22-24 मई) को आगंतुकों का ध्यान फ्लॉन्ग की बिक्री की शुरुआत की घोषणा से आकर्षित हुआ, जो मिनियन सीक्वेंसर के लिए एक एडेप्टर सम्मिलित है, जो कम कुशल (~ 1 जीबी) के साथ काम करने की अनुमति देता है, लेकिन अपेक्षाकृत सस्ती ($ 90) डिस्पोजेबल सेल।



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फ्लोंगल की उपस्थिति नैदानिक ​​अभ्यास में एनजीएस (अगली पीढ़ी के अनुक्रमण) के उपयोग में विस्फोटक वृद्धि का कारण बन सकती है और पारंपरिक पीसीआर डायग्नोस्टिक्स को विस्थापित कर सकती है, जिसका रूस में बाजार का आकार एक अरब रूबल से अधिक है, और दुनिया में इसे अरबों डॉलर में मापा जाता है। लेकिन अधिकांश रूसी रोगियों के लिए, एनजीएस डायग्नॉस्टिक्स अभी भी एक दुर्गम लक्जरी बने रहेंगे, क्योंकि घरेलू बाजार में फ्लॉन्ग के लिए कोशिकाओं की लागत 10 हजार रूबल से अधिक होगी। और अगर हम इसे खर्च करने योग्य अभिकर्मकों, परिवहन लागत और ओवरहेड की लागत में जोड़ते हैं, तो एक डीएनए / आरएनए नमूने के अनुक्रमण की अनुमानित लागत 20 हजार रूबल से कम नहीं होगी।
इसका मतलब है कि घरेलू नैनोपोर सीक्वेंसर विकसित करने और उन्हें सस्ते उपभोग्य सामग्रियों और अभिकर्मकों के साथ प्रदान करने की आवश्यकता है।

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गौरतलब है कि फ्लॉन्ग के लिए कोशिकाओं का पुन: उपयोग करके और उनके साथ काम करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों के आयात प्रतिस्थापन द्वारा नैनोपोर अनुक्रमण की लागत को कम करना संभव है। लेकिन पहले आपको एक परीक्षण उपकरण प्राप्त करने की आवश्यकता होती है जो आपको काम करने वाले सेल के 126 कुओं में बिलीयर लिपिड झिल्ली (बीएलएम) के गठन की निगरानी करने की अनुमति देता है, और इन झिल्ली में एम्बेडेड नैनोपोर्स की मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन करता है। इस तरह के एक उपकरण ("नैनोराइडर"?) को उन पर बीएलएम के गठन के दौरान व्यक्तिगत छिद्रों की विद्युत चालकता (और / या प्रतिबाधा) में परिवर्तन को ट्रैक करना चाहिए, और एकल आयन चैनलों के माध्यम से बहने वाले पिकोएम्परस धाराओं को पंजीकृत करना चाहिए।

मानक तत्वों से यूएसबी 2.0 के माध्यम से कंप्यूटर से जुड़े एक पाठक की रचना करना संभव है: FPGA (100 ... 200 $), वर्तमान एम्पलीफायरों (MAX9923FEUB - 200 ... 300 रूबल), एडीसी (1 ... 2 हजार रूबल), आदि ... केवल एक बोर्ड जिसमें गैर-मानक संपर्क पैड (10x13) प्रकार एलजीए (लैंड ग्रिड एरे) है, जो फ्लॉन्ग से एक सेल के साथ डॉकिंग के लिए है। या इसके सरलीकृत घरेलू समकक्ष के साथ सेंसर कुओं की एक छोटी संख्या (16 ... 32) है।



टच पैड सेल फ्लॉन्ग

कई समस्याओं को हल करने के लिए 4 ... 8 गुना (10 से 20 एमबी तक) की डिज़ाइन उत्पादकता को कम करना महत्वपूर्ण नहीं है (रोगजनकों का निर्धारण, एचएलए टाइपिंग, पितृत्व, पहचान, आदि की स्थापना), लेकिन यह आपको पारंपरिक एम्पलीफायरों पर एक नैनोकोर सीक्वेंसर इकट्ठा करने की अनुमति देता है। पिकोम्पेरे धाराओं। और विशेष 512-चैनल चिप्स के उपयोग के बिना, जिसके विकास में ऑक्सफोर्ड के लोगों ने लाखों डॉलर का निवेश किया है। सच है, प्रत्येक मल्टीचैनल नैनोरैडर में एक दर्जन से अधिक वर्तमान एम्पलीफायरों + एडीसी शामिल होने चाहिए, लेकिन यह अभी भी मालिकाना मिनियन + फ्लॉन्ग संयोजन (> 200 हजार रूबल) से कई गुना कम खर्च कर सकता है। के रूप में nanoreader के कम प्रदर्शन के लिए, रूसी उपयोगकर्ताओं के लिए जिनके पास सभ्य कंप्यूटर (डॉक्टर, जीवविज्ञानी, बायोहाकर आदि) नहीं हैं, यह भी उपयोगी हो सकता है।

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ऑक्सफोर्ड वासियों द्वारा विकसित 512-चैनल पिकोम्पेयर वर्तमान एम्पलीफायर मिनियन के लिए प्रत्येक डिस्पोजेबल सेल में निहित हैं। अपशिष्ट कोशिकाओं को दूर फेंका जा सकता है, लेकिन फ्लेन्गल एनालॉग्स का उत्पादन करने के लिए उनमें निहित चिप्स का उपयोग करना बेहतर होता है जो कि बढ़ी हुई उत्पादकता की विशेषता होती है। यदि ये चिप्स सतह के संपर्कों से लैस हैं, तो वे 2048 (512x4) सेंसर कुओं वाले संपर्क कोशिकाओं के साथ काम करने में सक्षम होंगे।
ऐसे एलजीए के साथ डिजाइनिंग कोशिकाएं आसान नहीं होंगी, लेकिन आपको यह ध्यान रखना होगा कि यहां संपर्क की आवश्यकताएं प्रोसेसर और मदरबोर्ड की तुलना में कम कठोर हैं, जिसमें एक बुरा संपर्क पूरे सिस्टम को अक्षम कर सकता है। एक सीक्वेंसर के लिए, सेल संपर्कों के आधे से भी अधिक की निष्क्रियता को स्वीकार्य माना जा सकता है। शेष आधा 5 ... 10 जीबी के स्तर पर प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है।

इस विचार का तार्किक विकास एक उपकरण में कई समान पाठकों का संयोजन होगा। यह आपको एक एनालॉग सीक्वेंसर ग्रिडियन एक्स 5 प्राप्त करने की अनुमति देगा, घरेलू उत्पादन की पांच (या अधिक) पुन: प्रयोज्य कोशिकाओं के साथ एक साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस तरह के एक सीक्वेंसर कई नैदानिक ​​नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में मांग में हो सकता है।



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डिस्पोजेबल प्रोमेथियन सीक्वेंसर कोशिकाओं में चिप्स पर 9,000 सेंसर कुएं हैं। और चिप्स स्वयं पिकोम्पेयर धाराओं के 3000-चैनल एम्पलीफायरों हैं। 24 (प्रोमेथियन 24) या 48 (प्रोमेथियन 48) सूचना कोशिकाओं के साथ सूचना देने की धारा इतनी बड़ी है कि कच्चे रूप में इसे नियमित बाहरी कंप्यूटर में स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रकार के सीक्वेंसर को अपने स्वयं के सुपर कंप्यूटर से लैस करना होगा। लेकिन अगर सिक्वेंसर केवल एक सेल के साथ काम करेगा, तो इसे थंडरबोल्ट 3.0 पोर्ट के साथ एक नियमित गेमिंग लैपटॉप से ​​जोड़ा जा सकता है।

संपर्क कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए ONT से मुक्त (बेदखल) चिप्स का परिवर्तन एक अघुलनशील समस्या नहीं है। लेकिन ऐसे चिप्स के उपयोग पर निर्मित सीक्वेंसर केवल ओएनटी सॉफ्टवेयर के साथ काम कर सकते हैं। और इन कार्यक्रमों के रीमेक पर खर्च करने के प्रयासों को ऑफ-द-शेल्फ चिप्स के उपयोग के लाभों को नकार सकते हैं। और इस तरह के चिप्स को खरोंच से विकसित करना बहुत महंगा है।

मेगा राइडर

इस साल, AXBIO (यूएसए) से नैनोपोर सीक्वेंसर का बीटा परीक्षण शुरू होने वाला है। यह इज़राइली कंपनी टॉवर सेमीकंडक्टर लिमिटेड द्वारा जापान में उत्पादित वर्तमान प्रवर्धन के एक लाख चैनलों के साथ चिप्स का उपयोग करता है ... उपभोगता और इन सीक्वेंसर की बिक्री AXBIO की चीनी शाखा द्वारा नियंत्रित की जाएगी।



संयुक्त राज्य अमेरिका और यूरोपीय संघ में, 7,000 से अधिक पेटेंट नैनोपोर अनुक्रमण के लिए समर्पित हैं, जो ऐसी प्रौद्योगिकियों से निपटने की कोशिश कर रही स्थानीय कंपनियों के लिए अप्रत्याशित वित्तीय जोखिम पैदा करता है। जाहिर है, इस विकास के इस तरह के उच्च अंतर्राष्ट्रीयकरण का मुख्य कारण है। और यह रूसी कंपनियों और प्रयोगशालाओं को AXBIO प्रौद्योगिकी के परीक्षण और सुधार में किसी भी प्रतिबंध के बिना भाग लेने की अनुमति देता है, साथ ही अपने क्षेत्र पर ऐसे सीक्वेंसर का उत्पादन (या संग्रह) करता है।
मेगापिक्सल चिप्स (मेगा रीडर) के साथ नैनोपोर सीक्वेंसर द्वारा प्राप्त कच्चे डेटा की टेराबाइट्स, इसे फ़िल्टर करना वांछनीय है। और केवल सबसे लंबे और उच्चतम-गुणवत्ता वाले कंप्यूटर पर कंप्यूटर पर स्थानांतरण। यह न केवल अनुक्रमण की गुणवत्ता में सुधार करेगा, बल्कि कंप्यूटर के लिए आवश्यकताओं को भी कम करेगा, जो कि बड़े पैमाने पर उत्पादन और जीनोमिक सीक्वेंसर के व्यापक उपयोग के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मेगा पाठकों की अत्यधिक उत्पादकता मानव जीनोम की अनुक्रमण की अवधि को 2 ... 3 दिन (ONT के लिए) से कई घंटों तक कम कर सकती है।

प्रौद्योगिकी योग

ओएनटी की सफलता को नैनोपोर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के पांच मुख्य तत्वों - मेम्ब्रेन, नैनोपोर्स, "मोटर" (हेलसेसे), अनुक्रमण स्थितियों और डिकोडिंग एल्गोरिदम को रीड सिग्नल के लिए समानांतर पाइपलाइन अनुकूलन के संगठन द्वारा सुविधा प्रदान की गई थी।



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नैनोपोर अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं की गारंटीकृत शेल्फ जीवन मुख्य रूप से बिलीयर लिपिड झिल्ली की स्थिरता पर निर्भर करता है। अब यह 6 सप्ताह है, हालांकि आमतौर पर ऐसे झिल्ली कुछ दिनों में नष्ट हो जाते हैं। उनके शैल्फ जीवन को बढ़ाने के लिए, हाइड्रोफोबिक बहुलक योजक, सतह-सक्रिय ब्लॉक कॉपोलिमर, कोलेस्ट्रॉल, एंटीऑक्सिडेंट, फैटी एसिड के क्रॉस-लिंकिंग आदि का उपयोग किया जाता है, और इस तरह के संशोधन आयन चैनलों के गठन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसलिए, बीएलएम स्थिरता प्राप्त करना बहुत मुश्किल है।
मौलिक रूप से इस समस्या को हल करने से सीक्वेंसर की कार्यशील कोशिकाओं में झिल्लियों के निर्माण और उपयोग के तुरंत बाद नैनोपोर्स की शुरूआत की अनुमति मिलती है। काम के लिए कोशिकाओं की स्व-तैयारी उनके उत्थान और पुन: उपयोग के लिए अवसर प्रदान करेगी। शेल्फ जीवन के लिए, शुष्क कोशिकाओं के लिए यह लगभग असीमित है, और उनके सक्रियण और उत्थान के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

नैनोवायर अनुक्रमण की तकनीक में अड़चन उसी समय नैनोपोर की अड़चन है, जिस पर पढ़ने की जानकारी की गुणवत्ता निर्भर करती है। इसलिए, ओएनटी का एक मुख्य कार्य एक झिल्ली प्रोटीन की खोज था, जो स्वीकार्य गुणवत्ता के परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देता है।

पहला ऐसा प्रोटीन था CsgG, एक बाहरी झिल्ली वाला प्रोटीन जो कई ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में पाया जाता है। इसके उपनिवेशों में से नौ विस्तृत प्रवेश द्वार और निकास वेस्टिब्यूल्स और एक अड़चन के साथ झिल्ली में एक आयन चैनल बनाते हैं। लेकिन सैकड़ों संशोधित CsgG वेरिएंट की गणना और विश्लेषण के बाद ही पर्याप्त रूप से उच्च-गुणवत्ता वाले नैनोपोर्स (R9, R9.4.1, R9.5.1) प्राप्त करना संभव था। इस गर्मी में, अगली पीढ़ी के छिद्रों (R10 या R10b) के साथ कोशिकाओं को बिक्री पर दिखाई देना चाहिए, जिसमें होमोपोलिमर रिपीट को पढ़ने में बढ़ी हुई सटीकता है।


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ONT, नैनोटोर अनुक्रमण तकनीक का एक अनिवार्य घटक है, एक हेलिकेज़, एक आणविक मोटर जो डबल-फंसे हुए डीएनए को खोल देता है और एक नैनोपोर के माध्यम से एकल-फंसे डीएनए की प्रगति को रोकता है। इस तरह की मोटर द्वारा डीएनए को बांधने की अधिकतम गति अब 450 न्यूक्लियोटाइड जोड़े प्रति सेकंड तक पहुंच जाती है, हालांकि मिनियन इलेक्ट्रॉनिक घटकों की गति इसे 1000 न्यूक्लियोटाइड प्रति सेकंड तक बढ़ाने की अनुमति देती है। सैद्धांतिक रूप से, हेलिकॉप्टर के काम में तेजी लाने से मिनियन का प्रदर्शन दोगुना हो सकता है, लेकिन व्यवहार में यह खराब अनुक्रमण का कारण बन सकता है। इसलिए, तेजी और अधिक कुशल हेलिकॉप्टरों से नैनोपोर सीक्वेंसर जैसे कि मिनियन और प्रोमेथियन के प्रदर्शन में सुधार की संभावना नहीं है।

अनुक्रमण की गुणवत्ता कई स्थितियों पर निर्भर करती है - झिल्ली पर लागू वोल्टेज की भयावहता, विद्युत चालकता और प्रतिक्रिया मिश्रण की आयनिक रचना, छिद्रों की मात्रा और प्रकृति अशुद्धियों को रोकती है, क्षमता की ध्रुवीयता को बदलने के लिए छिद्रित छिद्रों को साफ करने की क्षमता, उपयोग किए गए एडेप्टर की संरचना, आदि ... इसलिए, नैनोपोर। अनुक्रमण को इसके सभी मापदंडों और कार्य समाधानों की रचनाओं (रन कंडीशन) के सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के डिजिटलीकरण की गुणवत्ता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकते हैं। awns। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया था कि हेलिकॉप्टर द्वारा cleaved एटीपी की एकाग्रता में कमी धीरे-धीरे अनुक्रमण परिणामों की सटीकता कम हो जाती है, और अब ऑक्सफोर्ड के लोग प्रतिक्रिया मिश्रण में एटीपी पुनर्जनन प्रणाली शुरू करके इस समस्या को खत्म करने की कोशिश कर रहे हैं।

नैनोपोर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का पांचवा तत्व आवर्तक तंत्रिका नेटवर्क (RNN) पर निर्मित कृत्रिम बुद्धि है और कुछ विशेष एल्गोरिदम और कार्यक्रमों के उपयोग पर है जो सजातीय दोहराव (फ्लिप-फ्लॉप, मेडका) की मान्यता में सुधार करते हैं। जुलाई में, गुप्पी और मिनकोव कार्यक्रमों की अगली रिलीज दिखाई जानी चाहिए, जिसमें ऑक्सफोर्ड के लोग मिथाइलेटेड बेस (5mC और 6mA) निर्धारित करने की क्षमता जोड़ने का वादा करते हैं। यह न केवल एपिगेनोमिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि पारंपरिक आधारों की मान्यता में सुधार करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।

नैनोपोर सीक्वेंसर्स द्वारा पढ़ी जाने वाली जानकारी की बड़ी मात्रा और इसके प्रसंस्करण की जटिलता ने इस तरह के सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर सिस्टम के हार्डवेयर पर आवश्यकताएं बढ़ा दी हैं। इसलिए, हर कंप्यूटर मिनियन को जोड़ने के लिए उपयुक्त नहीं है, ग्राफिक्स त्वरक की नवीनतम पीढ़ी ग्रिडियन और प्रोमिथिओन में स्थापित है, और ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज जेत्सोन एजीएक्स ज़ेवियर (एनवीआईडीआईए) के एक बड़े बैच के पहले खरीदारों में से एक बन गई है जो कृत्रिम बुद्धि वाले उपकरणों के लिए इरादा है।

हाल ही में, नैनोपोर तकनीक को अधिक सटीक प्रतिदीप्ति और सेमीकंडक्टर अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए एक उपयोगी पूरक से अधिक कुछ नहीं माना जाता था। लेकिन पढ़ने योग्य डीएनए की सटीकता में एक क्रमिक वृद्धि, पठनीय अनुक्रमों की एक बड़ी लंबाई के साथ मिलकर, इसकी अनुमति दी, यदि सभी प्रतियोगियों से आगे नहीं निकलना है, तो कम से कम जीनोमिक अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास के मुख्य वेक्टर का निर्धारण करें।



नैनोपोर अनुक्रमण तकनीक के सभी तत्वों को मास्टर करने में काफी समय लग सकता है, लेकिन यह सबसे बड़ी समस्या नहीं है। मुख्य समस्या रूस में इस तरह के एकीकृत विकास के लिए लक्षित धन की कमी है। यह सच है, 2019-2027 के लिए जेनेटिक टेक्नोलॉजीज के विकास के लिए हाल ही में अनुमोदित संघीय वैज्ञानिक और तकनीकी कार्यक्रम (अनुभाग "कार्यक्रम कार्यान्वयन दिशा") का कहना है कि अल्पावधि (3 ... 6 वर्ष) में उच्च-प्रदर्शन जीनोमिक अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोटाइप डिवाइस विकसित किया जाएगा। लेकिन 30 पृष्ठों के पाठ पर इस एकल पंक्ति को खोजना इतना आसान नहीं है। AXBIO सीक्वेंसरों की खरीद पर चीनी के साथ बातचीत करने में आसान।

यहां तक ​​कि सरल उन शिल्पकारों को ढूंढना है जो सबसे सरल नैनोराइडर "घुटने पर" इकट्ठा कर सकते हैं। और फिर उन निवेशकों की तलाश में आगे बढ़ें, जो नैनोपोर अनुक्रमण की घरेलू तकनीक के विकास के लिए सहमत हैं।