डिड नोबेल लॉरी केरी मुल्ली - डीएनए पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन के आविष्कारक

कैलिफोर्निया में, 74 वर्ष की आयु में, रसायन विज्ञान केरी मुलिस में अमेरिकी नोबेल विजेता की मृत्यु हो गई। उनकी पत्नी के अनुसार, मृत्यु 7 अगस्त को हुई। इसका कारण निमोनिया के कारण दिल और सांस की विफलता है।

डीएनए अणु के खोजकर्ता जेम्स वॉटसन हमें जैव रसायन में उनके योगदान के बारे में बताएंगे और उन्हें नोबेल पुरस्कार मिला।

जेम्स वाटसन, एंड्रयू बेरी, केविन डेविस की पुस्तक के अंश

डीएनए। आनुवंशिक क्रांति का इतिहास

अध्याय 7. मानव जीनोम। जीवन लिपि

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पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का आविष्कार 1983 में बायोकेमिस्ट कैरी मुलिस द्वारा किया गया था, जिन्होंने सेतुस में काम किया था। इस प्रतिक्रिया की खोज काफी उल्लेखनीय थी। मुलिस ने बाद में याद किया: "अप्रैल 1983 में शुक्रवार की रात को एक बार, यह मुझे हल्का लग रहा था। मैं चला रहा था, उत्तरी कैलिफोर्निया के लिए चांदनी घुमावदार पहाड़ी सड़क के किनारे, लाल लकड़ी के जंगलों के किनारे। यह प्रभावशाली है कि यह ऐसी स्थिति में था कि उसे प्रेरणा से दौरा किया गया था। और यह बिल्कुल नहीं है कि उत्तरी कैलिफोर्निया में विशेष सड़कें हैं जो अंतर्दृष्टि को बढ़ावा देती हैं; यह सिर्फ इतना था कि उसके दोस्त ने एक बार मुली को बर्फीले दो रास्ते के साथ लापरवाही से भागते देखा था और इससे वह बिल्कुल परेशान नहीं हुआ था। एक मित्र ने न्यूयॉर्क टाइम्स को निम्नलिखित बातें बताईं: “मुलिस ने सपना देखा कि वह सीकोइया में दुर्घटनाग्रस्त होकर मर जाएगा। इसलिए, अगर रेडवुड सड़क के साथ नहीं बढ़ते हैं, तो वह कुछ भी ड्राइविंग करने से डरते नहीं हैं। " सड़क के साथ सीकोइया की उपस्थिति ने मुलिस को केंद्रित किया और ... यहाँ यह एक अंतर्दृष्टि है। 1993 में अपने आविष्कार के लिए, मुलिस को रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार मिला और तब से वह अपने कार्यों में भी अजनबी हो गया है। उदाहरण के लिए, वह संशोधनवादी सिद्धांत का समर्थक है कि एड्स एचआईवी से संबंधित नहीं है, जिसने अपनी प्रतिष्ठा को कम कर दिया और डॉक्टरों को रोका।

पीसीआर एक काफी सरल प्रतिक्रिया है। इसे बाहर ले जाने के लिए, हमें वांछित डीएनए टुकड़े के विभिन्न श्रृंखलाओं के विपरीत छोरों के पूरक दो रासायनिक रूप से संश्लेषित प्राइमर की आवश्यकता होती है। प्राइमर एकल-फंसे डीएनए के छोटे खंड होते हैं, प्रत्येक लगभग 20 बेस जोड़े लंबे होते हैं। प्राइमरों की ख़ासियत यह है कि वे डीएनए के उन क्षेत्रों से मेल खाते हैं जिन्हें आप बढ़ाना चाहते हैं, यानी डीएनए टेम्पलेट।


(छवि क्लिक करने योग्य) Cary Mullis, पीसीआर के आविष्कारक

पीसीआर की विशिष्टता मैट्रिक्स और प्राइमरों के बीच पूरक परिसरों के निर्माण पर आधारित है, लघु सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स। प्राइमरों में से प्रत्येक डबल-फंसे हुए मैट्रिक्स की श्रृंखलाओं में से एक का पूरक है और प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत को सीमित करता है। वास्तव में, परिणामस्वरूप "मैट्रिक्स" एक पूरे जीनोम का प्रतिनिधित्व करता है, और हमारा लक्ष्य यह है कि हम इसे से ब्याज के टुकड़े को अलग करें। इसके लिए, डबल-फंसे हुए डीएनए टेम्प्लेट को कई मिनट के लिए 95 ° C तक गर्म किया जाता है, ताकि डीएनए की चेन छितरी रहे। इस चरण को विकृतीकरण कहा जाता है, क्योंकि दो डीएनए श्रृंखलाओं के बीच हाइड्रोजन बांड नष्ट हो जाते हैं। जब चेन खुली होती है, तो तापमान कम हो जाता है ताकि प्राइमर सिंगल चेन टेम्प्लेट से संपर्क कर सकें। डीएनए पोलीमरेज़ एक न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला की लंबाई से बांधकर डीएनए प्रतिकृति शुरू करता है। डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम एक प्राइमर का उपयोग बीज या कॉपी उदाहरण के रूप में टेम्पलेट श्रृंखला की नकल करता है। पहले चक्र के परिणामस्वरूप, हम एक विशिष्ट डीएनए क्षेत्र के कई अनुक्रमिक दोहरीकरण प्राप्त करते हैं। अगला हम इस प्रक्रिया को दोहराते हैं। प्रत्येक चक्र के बाद, हम लक्ष्य क्षेत्र को दोगुनी मात्रा में प्राप्त करते हैं। पच्चीस पीसीआर चक्र (जो दो घंटे से कम समय में) के बाद, हमारे पास मूल से 225 गुना अधिक राशि में एक डीएनए क्षेत्र है (यानी, हमने इसे लगभग 34 मिलियन बार बढ़ाया है)। वास्तव में, प्रवेश द्वार पर हमें प्राइमर, टेम्पलेट डीएनए, डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम और फ्री बेस ए, सी, जी और टी का मिश्रण मिला, विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद (प्राइमरों द्वारा सीमित) की मात्रा तेजी से बढ़ती है, और "लंबी" डीएनए प्रतियों की संख्या रैखिक है, इसलिए प्रतिक्रिया उत्पादों पर हावी है।


एक वांछित डीएनए साइट का प्रवर्धन: पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

पीसीआर की भोर में, मुख्य समस्या निम्नानुसार थी: प्रत्येक हीटिंग-कूलिंग चक्र के बाद, डीएनए पोलीमरेज़ को प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाना था, क्योंकि यह 95 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय था। इसलिए, 25 चक्रों में से प्रत्येक से पहले इसे फिर से जोड़ना आवश्यक था। प्रतिक्रिया प्रक्रिया अपेक्षाकृत अप्रभावी थी, इसके लिए बहुत समय और पोलीमरेज़ एंजाइम की आवश्यकता थी, और सामग्री बहुत महंगी है। सौभाग्य से, माँ प्रकृति बचाव में आई। कई जानवर 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर सहज महसूस करते हैं। और 37 ° C का आंकड़ा हमारे लिए महत्वपूर्ण क्यों हो गया? यह इसलिए हुआ क्योंकि यह तापमान ई। कोलाई के लिए इष्टतम है, जिसमें से पीसीआर के लिए पोलीमरेज़ एंजाइम मूल रूप से प्राप्त किया गया था। प्रकृति में, सूक्ष्मजीव हैं जिनके प्रोटीन प्राकृतिक चयन के लाखों वर्षों में उच्च तापमान के प्रति अधिक प्रतिरोधी हो गए हैं। इसमें थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए पॉलिमरेज का उपयोग करने का प्रस्ताव किया गया है। ये एंजाइम थर्मोस्टेबल थे और कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम थे। उनके उपयोग ने पीसीआर को सरल और स्वचालित करना संभव बना दिया। पहले थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ में से एक थर्मस एक्वाटिकस जीवाणु से अलग था जो येलोस्टोन नेशनल पार्क के हॉट स्प्रिंग्स में रहता है और इसे टाक पोलीमरेज़ कहा जाता है।

पीसीआर तेजी से मानव जीनोम परियोजना का मुख्य कार्यक्षेत्र बन गया। सामान्य तौर पर, प्रक्रिया मुलिस द्वारा विकसित उस से अलग नहीं होती है, यह सिर्फ स्वचालित थी। अब हम नेत्रहीन स्नातक छात्रों की भीड़ पर निर्भर करते हुए दर्द निवारक रूप से प्लास्टिक की नलियों में तरल की बूंदे डाल रहे हैं। आणविक आनुवंशिक अनुसंधान को अंजाम देने वाली आधुनिक प्रयोगशालाओं में, यह काम रोबोट कन्वेयर पर किया जाता है। मानव जीनोम के रूप में बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजना में शामिल पीसीआर रोबोट लगातार गर्मी प्रतिरोधी पोलीमरेज़ के विशाल मात्रा के साथ काम कर रहे हैं। मानव जीनोम परियोजना में काम करने वाले कुछ वैज्ञानिक अनुचित रूप से उच्च योगदान से नाराज थे, जो कि पीसीआर पेटेंट धारक, यूरोपीय औद्योगिक और फार्मास्यूटिकल दिग्गज हॉफमैन-लॉरोचे, उपभोग्य सामग्रियों की लागत में जोड़ता है।

एक और "ड्राइविंग फोर्स" डीएनए अनुक्रमण विधि ही थी। उस समय इस पद्धति का रासायनिक आधार अब नया नहीं था: अंतरराज्यीय परियोजना मानव जीनोम (एचजीपी) ने उसी सरल विधि को अपनाया जो फ्रेड सेंगर ने 1970 के दशक के मध्य में विकसित किया था। नवाचार स्वचालन के पैमाने और डिग्री में था जो अनुक्रमण के दौरान हासिल किया गया था।

स्वचालित अनुक्रमण मूल रूप से कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान में ली हुड की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था। उन्होंने मोंटाना में हाई स्कूल से स्नातक किया और स्ट्राइकर के रूप में अमेरिकी फुटबॉल खेला; हुड की बदौलत टीम ने एक से अधिक बार राज्य चैम्पियनशिप जीती। टीमवर्क कौशल उनके वैज्ञानिक करियर में उनके काम आया। हूड की प्रयोगशाला ने रसायन विज्ञानियों, जीवविज्ञानी और इंजीनियरों की एक प्रेरक कंपनी को नियुक्त किया और जल्द ही उनकी प्रयोगशाला तकनीकी नवाचार में अग्रणी बन गई।

वास्तव में, स्वचालित अनुक्रमण की विधि का आविष्कार लॉयड स्मिथ और माइक हंकपिलर ने किया था। माइक हंकपिलर, जो तब हुड की प्रयोगशाला में काम करते थे, ने लॉयड स्मिथ की ओर रुख किया, उन्हें एक बेहतर अनुक्रमण विधि की पेशकश की जिसमें प्रत्येक प्रकार के ठिकानों को प्रत्येक अपने स्वयं के रंग में चित्रित किया जाएगा। इस तरह के विचार से सैंसर प्रक्रिया की प्रभावशीलता चौगुनी हो सकती है। सेंगर, जब डीएनए पोलीमरेज़ की भागीदारी के साथ चार ट्यूबों (बेस की संख्या के अनुसार) में से प्रत्येक में अनुक्रमण, एक प्राइमर अनुक्रम सहित विभिन्न लंबाई के ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का एक अनूठा सेट बनाता है। इसके बाद, चेन को अलग करने के लिए ट्यूबों में फॉर्मामाइड मिलाया गया और चार पटरियों पर पॉलीक्रायमलाइड जेल वैद्युतकणसंचलन किया गया। स्मिथ और हंकपिलर संस्करण में, डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स को चार अलग-अलग रंगों के साथ लेबल किया जाता है और एक ट्यूब में पीसीआर किया जाता है। फिर, पॉलीक्रैलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान, जेल में एक विशिष्ट स्थान पर एक लेजर बीम डाई की गतिविधि को उत्तेजित करता है, और डिटेक्टर निर्धारित करता है कि वर्तमान में कौन से न्यूक्लियोटाइड जेल के माध्यम से पलायन कर रहा है। सबसे पहले, स्मिथ निराशावादी था - उसे डर था कि डाई की अल्ट्रा-लो खुराक का उपयोग इस तथ्य को जन्म देगा कि न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र अप्रभेद्य होंगे। हालाँकि, लेज़र तकनीकों में पारंगत होने के कारण, उन्होंने जल्द ही एक विशेष फ्लोरोक्रोम रंजक का उपयोग करके एक रास्ता खोज निकाला जो कि लेज़र विकिरण के प्रभाव में फ़्लॉरेस करता है।


( क्लिक करके पूर्ण संस्करण - 4.08 एमबी) छोटा प्रिंट: एक स्वचालित अनुक्रमण मशीन से प्राप्त एक स्वचालित अनुक्रमक का उपयोग करके डीएनए अनुक्रम डिकोड किया गया। प्रत्येक रंग में चार आधार होते हैं।

सेंगर विधि के शास्त्रीय संस्करण में, विश्लेषण किए गए डीएनए के किस्में में से एक एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा पूरक स्ट्रैंड के संश्लेषण के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में कार्य करता है, फिर एक जेल में आकार के आधार पर डीएनए टुकड़े के अनुक्रम को क्रमबद्ध किया जाता है। प्रत्येक टुकड़ा जो डीएनए में संश्लेषण के दौरान शामिल होता है और बाद में प्रतिक्रिया उत्पादों के दृश्य को टर्मिनल बेस के अनुरूप एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ चिह्नित किया जाता है (यह पृष्ठ 124 पर चर्चा की गई थी); इसलिए, इस टुकड़े की प्रतिदीप्ति किसी दिए गए आधार के लिए एक पहचानकर्ता होगी। फिर यह केवल पता लगाने और प्रतिक्रिया उत्पादों की कल्पना करने के लिए बनी हुई है। परिणामों का विश्लेषण एक कंप्यूटर का उपयोग करके किया जाता है और चार न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप बहु-रंगीन चोटियों के अनुक्रम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इसके अलावा, सूचना सीधे कंप्यूटर सूचना प्रणाली में प्रेषित की जाती है, जो समय लेने वाली और कभी-कभी दर्दनाक डेटा प्रविष्टि प्रक्रिया को समाप्त करती है, जो बहुत जटिल अनुक्रमण है।

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