Bagaimana DNA diurutkan

Pengurutan DNA dalam beberapa dekade terakhir telah berevolusi dari bidang sempit, yang ditangani oleh sejumlah kecil ilmuwan, menjadi salah satu teknologi yang paling cepat berkembang. Pertumbuhan produktivitas dan penurunan biaya bahkan di atas hukum Moore, dan, karena persaingan yang kuat di pasar dan permintaan yang besar, pengembangan akan berlanjut dengan kecepatan tinggi. Selain itu, pengembangan pengurutan menyebabkan ledakan yang sama dalam bioinformatika dan biologi yang berubah secara radikal, dan, secara bertahap, juga secara mendasar mengubah obat-obatan.



Oleh kat, saya memberi tahu Anda lebih banyak tentang bagaimana mereka melakukannya.

Apa itu DNA
Sebagai permulaan, untuk memahami proses itu sendiri, sedikit teori yang diperlukan.
DNA adalah rantai polimer yang terdiri dari empat jenis monomer yang disebut nukleotida, urutan yang mengkodekan informasi tentang tubuh. Dengan kata lain, DNA dapat direpresentasikan sebagai teks yang ditulis dalam alfabet empat huruf. DNA adalah molekul yang terdiri dari dua rantai, dan meskipun urutan nukleotida berbeda, urutan satu rantai dapat dipulihkan secara ambigu jika urutan yang lain diketahui. Oleh karena itu, rantai disebut saling melengkapi. (Ind. Komplemen - suplemen) Properti ini digunakan ketika menyalin sel ketika untai DNA tidak dibungkus, dan pada masing-masing, seperti pada matriks, yang kedua disintesis, dan masing-masing dari dua sel anak menerima DNA untai ganda. Seluruh urutan DNA suatu organisme disebut genom. Sebagai contoh, genom manusia terdiri dari 46 kromosom.

Terlepas dari sejumlah besar beragam, baik metode eksperimental maupun usang, metode komersial arus utama cukup mirip, dan agar tidak membuat reservasi setiap saat, saya akan segera mengatakan bahwa ini akan membahas metode arus utama ini.

Bagaimana kelihatannya secara umum
Sebelum menjelaskan teknologi pengurutan, untuk pemahaman intuitif, saya akan menggambar analogi berikut: mereka meledakkan setumpuk surat kabar yang identik sehingga mereka terbang terpisah menjadi potongan-potongan kecil dengan potongan-potongan teks, dan kemudian masing-masing bagian ini dibaca dan, dari bacaan-bacaan ini, teks dikembalikan koran asli.

Untuk mengurutkan DNA, pertama-tama diisolasi dari sampel uji, kemudian dipotong menjadi fragmen kecil secara acak, fragmen tersebut disebut reads. Satu rantai dibiarkan dari setiap pembacaan, dan yang kedua disintesis pada rantai ini, seperti pada matriks, dan jenis dari masing-masing nukleotida berikutnya yang terpasang entah bagaimana terdeteksi. Dengan demikian, merekam urutan nukleotida yang bergabung, kembalikan urutannya di setiap pembacaan. Kemudian, genom direkonstruksi dari pembacaan komputer menggunakan program komputer.

Poin penting. Panjang total bacaan harus berkali-kali lebih besar dari panjang DNA yang diteliti. Ini dilakukan karena ketika DNA diekstraksi dari sampel, dan ketika dipotong, sebagian hilang, sehingga tidak ada yang menjamin bahwa setiap bagiannya akan jatuh ke dalam setidaknya satu pembacaan. Oleh karena itu, agar setiap bagian dijamin untuk dibaca, DNA diambil dengan margin yang besar. Selain itu, kesalahan dapat terjadi selama pengurutan, dan untuk dapat membaca DNA dengan lebih andal, setiap bagian harus dibaca beberapa kali.


DNA dipotong menjadi bacaan yang membaca, dan dari mereka mengembalikan urutan aslinya

Teknik ini tidak digunakan untuk kehidupan yang baik. Ini menambah banyak kesulitan, dan jika para peneliti dapat mengambil dan membaca seluruh urutan genom pada suatu waktu, mereka akan bahagia, namun, ini tidak mungkin saat ini.
Ada 2 alasan untuk ini. Yang pertama adalah kesalahan yang terjadi saat membaca setiap nukleotida. Mereka berakumulasi secara bertahap, dan setiap nukleotida berikutnya dibaca lebih buruk daripada yang sebelumnya, dan pada titik tertentu kualitas bacaannya sangat berkurang sehingga tidak ada gunanya untuk melanjutkan proses. Untuk metode pengurutan yang berbeda, panjang bacaan, yang dapat mereka baca dengan baik, ada di urutan puluhan atau ratusan nukleotida. Yang kedua adalah bahwa DNA adalah molekul yang sangat panjang, dan, dengan pembacaan yang cermat dari setiap huruf setelah teman, pengurutan akan memakan waktu yang tidak senonoh, dan dalam hal ini proses ini mudah diparalelkan, dan jutaan serta milyaran bacaan dapat dibaca pada saat yang sama.



Illumina
Skema semacam itu menguraikan semua teknik urutan populer. Mereka berbeda hanya dalam metode deteksi nukleotida bergabung selama sintesis, dan dalam metode persiapan bahan.

Sampai saat ini, metode yang paling umum digunakan dalam sequencer Illumina. Dalam metode ini, pertama, banyak bacaan yang berbeda dilampirkan ke piring kaca. Kemudian, dari masing-masing bacaan, banyak salinan dibuat di permukaan piring sehingga hanya salinan identik yang terletak di setiap bagian kecilnya. Hal ini dilakukan agar selama pengurutan berikutnya menerima sinyal bukan dari satu molekul, tetapi dari sekelompok molekul identik yang terletak di dekatnya. Jadi sinyalnya lebih mudah dibaca, dan keandalan pembacaan meningkat. Molekul-molekul ini adalah untai beruntai tunggal, dan rantai komplementer disintesis selama proses sequencing. Reaksi sintesis dilakukan sebagai berikut: Satu nukleotida melekat pada awal setiap molekul. Nukleotida ini secara kimia tersumbatbahwa setelah penambahannya, sintesis tidak berjalan lebih jauh. Selain itu, tag melekat padanya, yang di bawah aksi luminesces laser. Selain itu, untuk setiap jenis nukleotida, warna pendaran berbeda. Setelah nukleotida terpasang, pelat diterangi dengan laser dan kamera menangkap warna yang digunakan pelat. Setelah ini, kuncinya dilepas, label juga dilepas, dan nukleotida berikutnya dilampirkan dengan cara yang sama. Urutan sinyal cahaya pada setiap bagian pelat di komputer diterjemahkan ke dalam urutan nukleotida, dan, pada output, file yang berisi urutan bacaan diperoleh.Setelah nukleotida terpasang, pelat diterangi dengan laser dan kamera menangkap warna yang digunakan pelat. Setelah ini, kuncinya dilepas, label juga dilepas, dan nukleotida berikutnya dilampirkan dengan cara yang sama. Urutan sinyal cahaya pada setiap bagian pelat di komputer diterjemahkan ke dalam urutan nukleotida, dan, pada output, file diperoleh yang berisi urutan bacaan.Setelah nukleotida terpasang, pelat diterangi dengan laser dan kamera menangkap warna yang digunakan pelat. Setelah ini, kuncinya dilepas, label juga dilepas, dan nukleotida berikutnya dilampirkan dengan cara yang sama. Urutan sinyal cahaya pada setiap bagian pelat di komputer diterjemahkan ke dalam urutan nukleotida, dan, pada output, file diperoleh yang berisi urutan bacaan.


Illumina
1 — 2 — 3 — , 4 — 5 — 6 — 7 —


Jika genom organisme dekat belum diurutkan sebelumnya, maka dari bacaan, kemudian, menggunakan program, mereka mencoba untuk merakit urutan nukleotida tunggal. Buluh sebagian tumpang tindih, dan, menggunakan tumpang tindih ini, mereka mencoba untuk membangun satu urutan. Ada banyak poin yang memperumit masalah ini. Misalnya, Anda dapat mencemari sampel, dan program akan mencoba membangun satu urutan DNA dari berbagai organisme. Sequencer dapat membuat kesalahan ketika membaca pembacaan, atau secara tidak sengaja menghubungkan dua tempat dalam genom karena mereka sangat mirip. Faktanya, ada begitu banyak kesulitan sehingga Anda tidak akan mencantumkan semua orang di sini. Dan, beberapa di antaranya sangat sulit untuk dihilangkan sehingga genom manusia, genom yang paling penting dan banyak dipelajari, masih belum diurutkan sampai akhir.


membaca dan di bawah urutan genom, yang direkonstruksi berdasarkan mereka.

Ketika urutan genom berkumpul, Anda perlu memahami apa artinya. Di atasnya ditemukan daerah yang terlihat seperti gen. Hal ini dilakukan sebagai berikut: Pada awal dan akhir gen ada "label" nukleotida tertentu, dan jika DNA mengandung sekuens sedemikian jauh sehingga gen dapat masuk di antara mereka, maka tempat ini dimasukkan dalam daftar gen potensial. Kemudian, pemohon ini dibandingkan dengan database gen yang sudah diketahui dari organisme lain, dan jika gen ditemukan di dalamnya yang sangat mirip dengan situs ini, maka ia ditugaskan fungsi gen ini.

Jika genom organisme lain dari spesies ini telah diurutkan, maka ia digunakan untuk perakitan. Karena genom organisme berbeda dari spesies yang sama hanya sedikit berbeda, untuk setiap pembacaan mereka menemukan tempat pada genom berurutan yang terdekat, dan yang baru disusun berdasarkan genom ini.

Source: https://habr.com/ru/post/id385865/