Rekayasa genetika bakteri: cara mendapatkan protein yang kita butuhkan dari bakteri

Jadi, dalam dua artikel sebelumnya tentang rekayasa genetika bakteri ( sekali dan dua kali ) kami menemukan cara mengumpulkan gen yang kami butuhkan, dalam bentuk apa mereka dapat dimasukkan ke dalam bakteri, dan bagaimana tepatnya mereka dapat diperkenalkan di sana. Misalkan kita melakukan semua manipulasi ini untuk membuat biofactory untuk produksi protein. Maka sekarang ini adalah usaha kecil - untuk mendapatkan protein kami dari bakteri dalam bentuk yang paling murni.
Ada banyak metode untuk menyelesaikan masalah ini, sebagian besar berhubungan dengan kromatografi. Baca cara kerja metode ini di bawah kucing.

Fase diam “menangkap” molekul yang melewati kelompok (-OH) mereka.

Jadi, kami mendapatkan strain yang kami butuhkan dan meningkatkan biomassa. Sekarang kita perlu menghapus protein kita dari itu.

Pertama-tama, kami mengambil budaya kami dan menuangkannya ke botol centrifuge. Bakteri adalah benda yang cukup besar dan berat, oleh karena itu, untuk mengendapkannya, nilai kelebihan yang sangat besar tidak diperlukan selama sentrifugasi: 10000g akan lebih dari cukup selama 20 menit. Hasilnya, kita mendapatkan sedimen di bagian bawah botol dan cairan (disebut supernatan). Kami menuangkan cairan, karena protein kami ada dalam bakteri yang ada di sedimen. Anda dapat melanjutkan lebih lanjut sesuai dengan keadaan: baik langsung bekerja dengan endapan yang diperoleh, atau membekukan dan menyimpan sampai diperlukan. Itu dapat disimpan untuk waktu yang sangat lama. Prosedur lebih lanjut untuk bekerja dengan lumpur tidak tergantung pada apakah kita menyimpannya di freezer atau tidak.

Katakanlah sudah waktunya bekerja dengan sedimen. Apa selanjutnya

Pertama-tama, kita perlu menghancurkan sel-sel agar protein bisa keluar. Untuk melakukan ini, gunakan metode berikut:

• Bekukan beku-mencair. Bukan alat yang paling efektif untuk penghancuran membran sel, tetapi aman untuk protein, jadi sering mulai dengan beberapa siklus seperti itu, dan kemudian beralih ke metode yang lebih efektif;
  
• Perawatan USG (sonication). Metode ini banyak digunakan, sederhana dan efektif. Ultrasound biasanya dikirim langsung ke volume air dengan bantuan "speaker" yang memanjang, yang dimasukkan ke dalam cairan dengan sel-sel sehingga ujung "speaker" hampir mencapai bagian bawah. Ini adalah metode yang cukup sulit. Ada juga alternatif yang lebih lembut - USG dimasukkan ke dalam bak air di mana tabung mengambang.
  
  
  
  
  Lulusan MIT memperingatkan - awasi sonator Anda dengan cermat.
  
  Saat melakukan penghancuran sel secara ultrasonik, penting untuk memantau suhunya: air memanas dengan cepat di bawah pengaruh ultrasound, dan kita tidak perlu mendenaturasi protein kita, dan terlebih lagi kita tidak ingin mendidihkannya. Oleh karena itu, dalam kasus pertama (dengan "kolom memanjang"), tabung reaksi dengan sel dimasukkan ke dalam cangkir dengan es dan air, dan harus ada banyak es. Air dalam hal ini bertindak sebagai antarmuka termal antara es dan tabung reaksi yang didinginkan olehnya. Dalam kasus "alternatif lunak", es ditambahkan langsung ke bak air.
  
  
  Demonstrasi pemrosesan ultrasonik "keras". Perhatikan kebisingan mengerikan yang berdiri di dekat instalasi, terutama terdengar pada 2:06 video ini. Seseorang diselamatkan sebaik mungkin: seseorang mencoba untuk keluar dari ruangan selama sonication, seseorang memakai headphone khusus peredam suara.
  
  
  Demonstrasi perawatan ultrasonik "lunak".
  
• Menambahkan agen lysing ke media. Ini terutama deterjen, yaitu, "sabun" (secara umum, kata "deterjen" dalam bahasa Inggris berarti "deterjen"). Deterjen pada dasarnya terkait dengan lipid dalam membran sel. Begitu berada di lingkungan dengan sel, deterjen mulai berintegrasi ke dalam membran, yang mengarah pada kehancurannya. Dan kita hanya perlu ini. Kadang-kadang lisozim juga ditambahkan - suatu enzim yang menghancurkan dinding sel bakteri.
  
• Pers Perancis. Suspensi sel dihisap melalui katup inlet ke dalam silinder yang berfungsi, dari mana ia diperas oleh pers melalui slot yang sempit. Gaya transversal yang timbul dari penurunan tekanan ke tekanan atmosfer ketika sel melewati celah mengarah pada penghancuran dinding dan membran sel.

Dari pengalaman saya sendiri, saya dapat mengatakan bahwa sonikasi dalam kombinasi dengan deterjen biasanya lebih dari cukup.

Jadi, kita mendapatkan sel lisat - "sup", yang terdiri dari protein yang kita butuhkan dan sejumlah besar "sampah" (DNA kromosom dan plasmid, potongan-potongan dinding sel, berbagai protein, dll.). Bagaimana cara menyingkirkan semua ini?

Pertanyaan pertama yang harus dijawab adalah: "Dalam bentuk apa protein kita ada di dalam sel?" Ada dua opsi utama:

• Protein larut sebelum lisis dan, dengan probabilitas yang sangat tinggi, tetap demikian setelah itu, yang berarti kita tidak dapat mengendapkannya dengan sentrifugasi. Tetapi kita dapat mengendapkan "sampah" besar yang tersisa setelah lisis: dengan cara ini kita akan menyingkirkan potongan-potongan dinding sel, DNA kromosom dan fragmen besar lainnya. Endapan dibuang, dan supernatan dikirim untuk kromatografi;
  
• Protein dalam kondisi sitoplasma bakteri tidak dapat larut dan membentuk apa yang disebut "Badan inklusi" dipertahankan setelah lisis. Badan inklusi adalah manik-manik protein yang terbentuk jika protein selama sintesis tidak memiliki waktu untuk melipat (mis., Mengambil bentuk terlarut normalnya) sebelum bertabrakan dengan protein non-lipatan serupa lainnya. Protein terbuka hampir selalu memiliki bercak hidrofobik mencuat, dengan bantuan yang menempel satu sama lain. Setelah dua tupai “saling menempel” mereka tidak lagi memiliki derajat kebebasan yang cukup untuk menyelesaikan lipatan mereka. Kemudian berenang ketiga, keempat, kelima hingga mereka .... Akibatnya, butiran protein terbentuk. Biasanya ini terjadi ketika kita mensintesis protein eukariotik pada bakteri (seperti yang saya tulis sebelumnya, bakteri tidak dapat melipatnya). Hasilnya, kami memiliki massa protein dengan struktur tata ruang yang “buruk”. Tetapi setiap awan memiliki garis perak, karena pada akhirnya butiran terbentuk, hampir seluruhnya terdiri dari protein yang kita butuhkan!
  
  Karena dalam hal ini protein kita tidak dapat larut, maka ketika disentrifugasi, ia, bersama dengan "sampah", ada di sedimen. Kami membuang supernatan, dan mayat-mayat di endapan dicuci dari semua yang tidak perlu sebagai berikut:
  
  1. Buffer pencuci No. 1 dituangkan, di mana “komponen sampah sedimen No. 1” dibubarkan;
  2. Aduk endapan sampai rata dan letakkan di atas shaker (alat yang bergetar);
  3. Supernatan disentrifugasi dan dituangkan. Akibatnya, apa yang dilarutkan dalam buffer pencuci No. 1 dipisahkan dari endapan;
  4. Buffer pencuci No. 2 dituangkan, di mana “komponen sampah sedimen No. 2” dibubarkan;
  5. Baik dan sebagainya. Sebanyak sekitar 5 mencuci biasanya diperlukan.
  
  Izinkan saya mengingatkan Anda sekali lagi bahwa jika kita berurusan dengan badan inklusi, maka kita berurusan dengan protein yang tidak dilipat , yang berarti tidak dapat memenuhi fungsi yang ditetapkan di dalamnya. Oleh karena itu, sebelum pembersihan berikutnya, itu refolding, yaitu dibawa ke bentuk aktif. Metode refolding paling umum terdiri dari langkah-langkah berikut:
  
  1. Larutkan tubuh dalam kondisi "non-fisiologis". Biasanya, tubuh larut dengan baik pada pH tinggi (sekitar 12) di hadapan urea bipolar. Gagasan dari metode ini adalah bahwa pada pH tinggi dalam medium ada sangat sedikit proton dan setiap orang yang dapat menyingkirkannya dengan mudah melakukannya. Proton bermuatan positif, yang berarti bahwa semua donor proton menerima muatan negatif, dan kemudian hukum Coulomb melakukan segalanya - protein yang bermuatan negatif besar mulai saling tolak;
     
  2. Setetes demi setetes tambahkan seluruh volume "larutan protein" dari paragraf pertama ke volume buffer aktif yang jauh lebih besar dengan kondisi yang nyaman bagi protein. Gagasan dari tahap ini adalah bahwa, pada konsentrasi protein rendah, ia jauh lebih mungkin untuk dilipat sebelum ia bertemu rekannya yang tidak dilipat. Biasanya, transfer tetesan larutan protein dilakukan dalam volume buffer melebihi volume larutan itu sendiri setidaknya 10 kali.

Jadi, kami siap untuk beberapa volume larutan protein dalam keadaan terlipat. Prosedur selanjutnya adalah sama untuk "kondisi awal" apa pun - kami menyaring solusi kami melalui filter dengan ukuran pori 100-450 nm (agar tidak menyumbat kolom kromatografi dan kromatografi itu sendiri), dan kemudian melakukan kromatografi.

Jenis Kromatografi

Prinsip dari setiap kromatografi adalah bahwa berbagai komponen solusi bergerak melalui kolom dengan kecepatan yang berbeda, sebagai akibatnya, komponen yang pergi "di pintu masuk ke kolom" datang ke pintu keluar pada waktu yang berbeda.

Tapi pertama-tama, mari kita ingat metode lain - elektroforesis protein dalam gel.

Metode ini memungkinkan pemisahan protein sesuai dengan massa mereka. Untuk melakukan ini, buffer yang mengandung SDS dan pewarna (biasanya biru bromphenol) ditambahkan ke sampel. Pada saat yang sama, densitas buffer lebih tinggi daripada densitas air, hal ini dilakukan agar campuran sampel dan buffer lebih mudah ditambahkan ke sumur pada gel. Pewarna ditambahkan untuk mengontrol prosedur untuk memasukkan sampel ke dalam sumur, dan itu juga berfungsi sebagai indikator bahwa sudah waktunya untuk menyelesaikan phoresis: cat bergerak lebih cepat dari protein, sehingga ketika mencapai akhir gel, phoresis dihentikan. Ini sangat nyaman, karena kita tidak melihat pergerakan protein di sepanjang gel.


Elektroforesis SDS-PAGE. Lebih baik membaca dan melihat sekali daripada membaca seratus kali. Penanda berat molekul diterapkan pada sumur pertama pada foresik dalam video, dan sampel yang diteliti diterapkan pada sumur yang tersisa.

SDS adalah komponen kunci: deterjen bermuatan negatif ini (surfaktan) mendenaturasi protein, setelah itu "mengelilingi" mereka, dan ternyata jumlah molekul SDS yang melekat pada protein berbanding lurus dengan massanya. Kemudian mengikuti dari hukum Coulomb bahwa, dengan tidak adanya perlawanan terhadap gerakan, semua protein yang dikelilingi oleh molekul SDS akan memiliki percepatan yang sama dalam medan listrik (gaya tumbuh secara linear dengan meningkatnya muatan, tetapi massa bertambah secara linier dengan muatan).


Skema aksi SDS deterjen bermuatan negatif pada protein. Pertama, dia mencela itu, dan kemudian "membungkusnya". Akibatnya, protein terdiri dari kulit bermuatan negatif yang terdiri dari SDS, yang muatannya berbanding lurus dengan massa protein.

Dan inilah PAAG (PAAG - gel poliakrilamida) yang membantu kami. Selama polimerisasi, ia membentuk jaringan saluran dengan diameter yang kira-kira sama, yang melaluinya, ceteris paribus, benda-benda kecil bergerak lebih cepat daripada yang besar. Jelas, protein berat lebih besar dari cahaya, sehingga protein ringan bergerak lebih cepat.

Setelah prosedur elektroforesis selesai, gel ternoda. Lebih tepatnya, tempat-tempat di mana protein berada di gel ternoda - garis-garis biru (atau hitam, tergantung pada apa yang akan dicat) diperoleh. Untuk memahami apa yang sesuai dengan massa satu atau pita lainnya, Anda perlu membandingkannya dengan sesuatu, sehingga gel yang disebut diaplikasikan pada setiap gel. "Penanda berat molekul" adalah campuran komponen dengan massa yang diketahui.


Contoh strip penanda berat molekul. Penanda ini juga nyaman karena dua garisnya dicat dalam warna tersendiri: merah (70 kilodalton) dan hijau (10 kilodalton). Ini membantu eksperimen untuk menavigasi di penanda itu sendiri. 1 dalton, ini adalah satuan massa atom, didefinisikan sebagai 1⁄12 dari massa atom karbon-12 istirahat bebas, yang berada dalam keadaan dasar.

Tampaknya keajaiban, bukan metode - strip tidak tumpang tindih, yang berarti bahwa protein dibagi sempurna! Namun pada kenyataannya, para ilmuwan belum belajar bagaimana melakukan elektroforesis protein pada skala industri dan oleh karena itu kami masih menggunakan kromatografi kolom.


Skema perkiraan kromatografi apa saja. Kolom adalah silinder yang diisi dengan sesuatu. "Sesuatu" ini disebut "fase diam", dan "fase bergerak" adalah solusi yang komponennya perlu kita pisahkan. Komponen bergerak dengan kecepatan berbeda dan karenanya keluar dari kolom secara terpisah.

Kebanyakan teknik kromatografi didasarkan pada fakta bahwa tupai yang lewat dengan berpegangan pada pengisi kolom yang diam “dengan antusiasme yang berbeda”: mereka yang “berpegang teguh” sering dan bergerak jauh lebih lambat daripada semua orang, dan mereka yang tidak “berpegang teguh” pada apa pun meninggalkan kolom dengan cepat. Akibatnya, sebagian besar campuran sering meninggalkan kolom tanpa "menangkap" di atasnya - mereka keluar bersama pada awal kromatografi (fraksi ini disebut "slip", karena mereka menyelinap melalui kolom tanpa "menangkap" di atasnya). Tetapi apa yang harus dilakukan dengan mereka yang "ketagihan"?

Pertama, mari kita cari tahu apa yang terjadi di kolom dengan mereka yang "menempel". "Pengait" itu sendiri terjadi karena ada sesuatu pada permukaan fase diam yang mampu "menangkap" sementara protein yang lewat (tentang bagaimana ini terjadi, sedikit lebih rendah). Yaitu, protein "kemelekatan" menghabiskan beberapa waktu di negara bagian yang terkait dengan fase padat, kemudian melepaskan diri dari itu (karena gerakan termal sendiri, tabrakan, dll.), Mengapung, kembali mengikat ke fase padat, lagi-lagi menjauh dan seterusnya sampai dia meninggalkan kolom. Jelas bahwa semakin sering dan semakin kuat ikatannya dengan fase diam, semakin lambat bergerak di sepanjang kolom.


Prinsip kromatografi. Apa yang tidak mengikat ke kolom (slip) bergerak dengan kecepatan fase gerak (disesuaikan dengan ukuran). Komponen yang mengikat memiliki kecepatan yang berbeda, yang mengarah ke pemisahannya pada output.

Secara umum, hanya dalam kasus banyak nasib buruk dalam campuran akan ada komponen berbeda yang bergerak dengan kecepatan yang sama, jadi kita bisa menunggu sampai mereka keluar dari kolom. Tetapi seringkali itu “hanya menunggu” untuk waktu yang sangat lama, karena komponen-komponennya bergerak lambat. Dalam hal ini, mereka harus "disesuaikan", dan cara mereka "disesuaikan" tergantung pada jenis kolom.

Akhirnya, mari kita periksa sendiri metode kromatografi, yang cocok untuk produksi industri kulit putih.

1. Kromatografi penukar ion. Gagasan metode ini adalah bahwa fase diam memiliki muatan di bawah kondisi kromatografi. Jika muatannya positif, maka mereka berbicara tentang "kromatografi penukar anion", jika negatif, kemudian tentang "pertukaran kation".
   
   Logikanya sederhana, mari kita pertimbangkan menggunakan penukar anion sebagai contoh: komponen bermuatan negatif dari campuran "menempel" ke fase padat kolom yang bermuatan positif. Selain itu, jika kita mengikuti kelompok bermuatan positif tertentu pada permukaan fase padat, maka satu atau komponen negatif lainnya akan "menempel" padanya dan lepas. Dengan demikian, semacam pertukaran anion terjadi antara fase diam dan bergerak, karenanya dinamai - “anion-exchange chromatography”.
   
   Jelas, jika kita ingin menggunakan kromatografi penukar anion, maka kita harus melakukan pemisahan campuran dalam kondisi seperti itu di mana fase padat bermuatan positif. Pada saat yang sama, kami memiliki dua pilihan pilihan untuk pengembangan lebih lanjut, tergantung pada muatan apa yang dimiliki protein dalam kondisi ini: jika "-", maka ia akan "duduk" di kolom, dan jika "+", akan tergelincir.
   
   Bagaimana mempercepat output komponen terkait, yaitu, bagaimana melakukan "elusi"? Anda dapat bertindak dalam dua cara:
   
   • Anda dapat mengubah muatan fase diam dan komponen terikat dengan mengubah pH fase gerak. Penting untuk melakukan proses perubahan pH secara bertahap, maka komponen akan mempercepat pergerakannya, tetapi mereka tidak akan “rontok” pada saat yang bersamaan sekaligus;
     
   • Tambahkan anion lain ke kolom. Memang, kolom memiliki jumlah terbatas tempat anion dapat menempel dan jika kita menempati semua tempat ini dengan sesuatu, maka komponen campuran akan bergerak lebih cepat. Untuk kromatografi penukar anion, penambahan anion klorin adalah tipikal. Pengenalan anion yang bersaing juga harus dilakukan secara bertahap.
   
   Prosedur untuk pertukaran kation kromatografi umumnya sama, hanya kebalikannya.
   
   
   
   
   Kromatografi pertukaran kation dengan elusi karena perubahan pH fase gerak.
   1 - pada pH = 2 ada banyak proton dalam fase gerak, oleh karena itu, semua komponen campuran diambil dari cairan, sambil menerima muatan positif;
   2 - pada pH = 5, jumlah proton dalam fase gerak menurun dan komponen "ungu" tidak lagi bertindak sebagai akseptor, tetapi sebagai donor proton, oleh karena itu, pada nilai pH ini, muatannya negatif dan ia meninggalkan kolom. Komponen "hijau" masih bertindak sebagai akseptor proton dan itu mempertahankan muatan positif pada nilai pH tertentu, yang berarti masih memegang kolom;
   3 - pada pH = 9 ada sangat sedikit proton dalam fase gerak, komponen "hijau" juga menjadi donor proton, memperoleh muatan negatif dan meninggalkan kolom terakhir.
   
   Secara umum, pilihan jenis penukar ion dan kondisi untuk pemisahan tergantung pada apa yang ingin kita isolasi dan apa lagi yang ada dalam campuran kita.
   
2. Metode pemisahan lain didasarkan pada hidrofobisitas (~ non-polaritas) dan hidrofilisitas (~ polaritas) zat-zat tertentu. Idenya di sini persis sama seperti dalam kasus penukar ion: sesuai dengan sifat fisiknya, komponen “tergesa-gesa” antara media hidrofobik dan hidrofilik, beberapa berlama-lama lebih, beberapa lebih sedikit.
   
   Pertama-tama, saya ingatkan Anda bahwa non-polar larut dalam non-polar, dan polar di kutub. Seringkali "hidrofobik" dan "non-polar" adalah satu dan sama dengan "hidrofilik" dan "polar", meskipun dalam kasus umum hal ini tidak demikian. Etanol adalah contoh dari pelarut non-polar, dan air adalah contoh dari polar.
   
   
   
   
   , , . «» .
   
   . , (). (). «» , «». , . «» . , . .
   
3. (His-tag). , ( — 20 ) . , , , .
   
   
   
   
   .
   
   , , . 6 , . , , , : .
   
   
   
   
   . , -« » His- . -« » .
   
   «» . , — His- ( , ). , .
   
   
   
   
   .
   1 — «» ; 2 — ; 3 4 — ; — ; 5-10 — . . , , «». . .
   
   , . , , . : , ( 75 100 , ), . , .
   
   His- - . , ( « < 1»), , . .
   
4. -. , : , - , , .
   
   « » , . - : , , . , - - , ( , ), . : - 1-2% . , , , 10 400 : , . - .
   
   
   
   
   -: , .
   
   - ? , , . , , , . - , .
   
   
   
   
   -. . , . — . .
   
   -, . , , , . - — , .

Baiklah kalau begitu. Jadi kami mengisolasi protein kami dan sekarang dapat digunakan untuk studi struktural atau fungsional, sebagai reagen di laboratorium ilmiah atau untuk analisis lingkungan, untuk keperluan medis atau dalam industri.