Halo semuanya, nama saya Alexander Sokolov, dan saya ingin memberi tahu Anda cara membuat sequencer di rumah - alat untuk mendekode DNA. Harga pasar perangkat semacam itu adalah sekitar 10 juta rubel.
Tamasya singkat ke dalam genetika. Jika Anda tiba-tiba ingat, pada tahun 2003 sebuah pernyataan sensasional dibuat: para ilmuwan akhirnya menguraikan genom manusia. Genom dibangun dari DNA, dan DNA adalah kode sumber tubuh. DNA adalah rantai ganda yang terdiri dari 4 jenis nukleotida, yang diulang dalam genom manusia sekitar 3 miliar kali. Sama seperti semua informasi di komputer Anda dienkripsi dalam bit, instruksi untuk mengumpulkan semua protein tubuh manusia dienkripsi dalam nukleotida. Yaitu, mengetahui dalam urutan apa nukleotida dalam DNA berada, kita secara teoritis dapat mengumpulkan semua protein yang diperlukan dan mendapatkan model manusia. Jadi, dalam pengertian standar, para ilmuwan tidak menguraikan DNA, tetapi hanya menerjemahkan urutan kimia menjadi seperangkat nol dan yang di komputer. Apa yang harus dilakukan selanjutnya adalah percakapan terpisah. Misalnya, saat ini kami jelas tentang fungsi hanya 5% dari seluruh susunan genom (ini adalah pengkodean protein). Apa yang dilakukan 95% sisanya, orang hanya bisa berspekulasi.
Pada tahun 2003, biaya sekuensing DNA manusia sekitar $ 100 juta. Seiring waktu, angka ini telah menurun dan sekarang mendekati seribu dolar. Anda membayar, DNA Anda diurutkan dan diberikan kepada Anda hard drive dengan 3 GB informasi - genom Anda dalam bentuk digital.
Ada tiga sequencer utama di pasaran saat ini. Yang paling produktif, Hiseq, dan penerima NovaSeq, memberikan urutan (fluorescent) termurah. Salah satu peluncurannya berlangsung beberapa hari, dan selama ini genom dari beberapa orang diproses sekaligus. Namun, biaya peluncurannya sendiri sekitar sepuluh ribu dolar. Omong-omong, perangkat itu sendiri berharga sekitar $ 1 juta, dan karena itu menjadi usang dalam waktu sekitar 3 tahun, agar dapat melunasi, itu harus membawa Anda $ 1000 per hari.
Perangkat kedua muncul di pasar musim panas lalu. Itu disebut Nanopore dan didasarkan pada teknologi yang sangat menarik ketika DNA diurutkan dengan melewati nanopore. Varian Nanopore termurah diposisikan sebagai sekuens rumah sekali pakai dan biaya $ 1000.
Perangkat ketiga adalah PGM, sequencer semikonduktor yang berharga $ 50.000 di tanah airnya dan sekitar 10 juta rubel (dengan pengiriman, bea cukai, dll.) Di Rusia. Proses pengurutannya memakan waktu sekitar beberapa jam.
Ya, saya tidak punya sepuluh juta, tetapi saya menginginkan PGM. Saya harus melakukannya sendiri. Pertama, secara singkat tentang bagaimana sequencing semikonduktor terjadi. Seluruh rantai DNA dibagi menjadi fragmen dengan panjang 300-400 nukleotida, yang disebut reads. Kemudian bacaan dilampirkan ke bidang kecil dan disalin berkali-kali - sebagai akibatnya, sejumlah besar fragmen DNA yang identik "hang" di setiap bidang. Menyalin diperlukan untuk memperkuat sinyal dari setiap pembacaan tertentu. Seperangkat area yang berbeda disebut perpustakaan DNA.
Inti dari PGM adalah chip satu kali - sebuah matriks yang mirip dengan matriks di kamera, tetapi alih-alih piksel yang merespons cahaya, berikut adalah transistor pH yang merespons perubahan keseimbangan asam-basa. Perpustakaan DNA yang dihasilkan dimuat ke chip yang berisi 10 juta sumur, di bagian bawah masing-masing adalah transistor pH. Hanya satu bola yang cocok dalam lubang dan, karenanya, hanya membaca satu jenis (dengan satu urutan nukleotida tertentu). Kemudian reagen diumpankan ke chip sehingga DNA mulai menyalin dirinya sendiri. Dan itu disalin secara linear, yaitu, nukleotida melekat pada rantai yang baru dibuat dalam urutan di mana mereka berada dalam rantai induk. Oleh karena itu, satu jenis nukleotida diumpankan ke chip - dan perubahan pH di beberapa sumur segera dicatat (ini berarti bahwa nukleotida melekat padanya). Kemudian jenis nukleotida yang berbeda diumpankan dan perubahan pH di dalam sumur, dll, direkam. Dengan demikian, dengan mengaplikasikan ke chip keempat jenis nukleotida berkali-kali, kita dapat memperoleh informasi tentang urutan nukleotida di setiap pembacaan. Kemudian, dengan metode matematika, segmen pendek baca dikumpulkan di komputer dalam satu rantai. Untuk mengumpulkannya kurang lebih dengan percaya diri, setiap bacaan harus dibaca sekitar 100 kali.
Fig. 1. Urutan semikonduktorSekarang mari kita cari tahu dari apa perangkat itu sendiri terdiri. Ada, seperti yang kita sudah tahu, sebuah chip, serta sistem pasokan reagen dan motherboard. Semua pengurutan dilakukan dengan tepat pada chip - perangkat lainnya hanya mentransmisikan sinyal tertentu, memberikan reagen, membaca sinyal analog dari itu, mendigitalkannya dan mendorong aliran informasi yang diterima ke komputer, tempat data dikumpulkan dan diproses.
Fig. 2. Perangkat SequencerChip diposisikan sebagai satu kali dan dibuang setelah digunakan. Dengan demikian, di mana PGM bekerja, chip tersebut dapat diperoleh secara gratis dalam jumlah berapa pun. Mengapa mendapatkannya, Anda bertanya? Faktanya adalah saya sudah berhasil menggunakan chip berulang kali. Bahkan, itu abadi: bilas cukup baik - dan dapat digunakan lagi dan lagi. Dalam akurasi, itu tidak akan berbeda dari yang baru. Ide saya adalah membuat perangkat untuk chip shareware ini.
Jadi, saya menghadapi tugas rekayasa balik chip. Tentu saja, tidak ada dokumentasi untuk sirkuit mikro yang didambakan dapat ditemukan - pabrikan tidak akan berbagi rahasia produksi, tetapi ingin menjual perangkat mereka dengan tenang seharga $ 50.000. Untuk memulai, saya melakukan yang paling jelas dan sederhana: kontak berdering dengan tester. Menjadi jelas di mana I / O digital dan analog, daya, dan banyak lagi berada. Beberapa informasi diperoleh dari paten pada chip. Tetapi semua ini, tentu saja, tidak cukup untuk menciptakan produk yang lengkap. Saya masih mengutak-atik chip, memeriksa berbagai tebakan saya, bereksperimen dengan memberikan sinyal, tetapi pada dasarnya tidak maju di mana pun. Saya harus menghentikan proyek.
Fig. 3. ChipDan kemudian tiba-tiba di Habrahabr saya
menemukan sebuah artikel oleh blogger terkenal
BarsMonster tentang bagaimana ia melakukan reverse engineering chip! Dia terinspirasi, menulis kepadanya, menulis kepada penggemar lain, mengirim permintaan ke Kiev, di mana ia terlibat dalam memotret keripik. Mereka menjawab dari Kiev bahwa mereka tidak tahu cara memoles lapisan, mereka hanya bisa menembak lapisan atas, dan karena chip saya multi-layer, tidak akan jelas ke mana trek dari kontak pergi. Kemudian dia bertemu dengan seorang Amerika yang juga terlibat dalam rekayasa balik chip, mengirimnya sirkuit mikro, tetapi bahkan di sini, itu tidak melampaui memotret lapisan atas. Lalu saya menemukan sebuah artikel di Internet tentang mereka yang mampu membalikkan chip Sony PlayStation, dll. ("Glory to the heroes!" Dan itu saja, jika ada yang tahu). Saya memutuskan untuk menulis mereka dengan pertanyaan, menemukan nama julukan mereka - dan kemudian saya menyadari bahwa salah satu dari mereka akrab bagi saya. Baru-baru ini, seorang teman membawa saya ke seorang teman yang juga "terlibat dalam genetika di tingkat amatir", kami berbicara dengan teman ini di Skype dan kami menyelesaikan dialog ini. Dan sekarang saya mengerti bahwa teman baru saya adalah seorang mega-cool master dari chip reverse engineering. Saya menulis kepadanya di sana. Namun, ternyata, meskipun dia siap membantu, dia tidak memiliki mikroskop. Jalan buntu lagi.
Beberapa bulan kemudian, mikroskop yang diperlukan ditemukan di laboratorium terdekat! Benar, kamera yang dibangun di dalamnya mengerikan, saya mengambil gambar di ponsel melalui lensa mata dan menerima gambar dengan kualitas ini:
Fig. 4. Chip di bawah mikroskopKemudian, pada Tahun Baru terakhir, sebuah mikroskop yang sangat baik untuk 130 ribu muncul di tempat kerja saya (saya seorang spesialis dalam kriptografi kuantum). Mimpi menjadi kenyataan. Akhirnya, saya bisa memotret chip dari atas.
Fig. 5. Mikroskop kerja sayaDan kemudian ... Lalu aku masih harus menguasai teknik memolesnya sendiri. Kesulitan memoles adalah untuk menghapus lapisan logam dengan ketebalan urutan 1 mikron - sedangkan lebar chip adalah 1 sentimeter. Sebagai perbandingan, saya akan mengatakan bahwa ini hampir sama dengan membiarkan kesalahan tidak lebih dari 10 cm per 1 km. Saya berusaha sangat keras. Hasil pekerjaan saya disajikan dalam foto berikut:
Fig. 6. Rekayasa terbalik di bawah mikroskop optikLapisan silikon bawah, lapisan atas dengan transistor, lapisan logam pertama, kedua, ketiga dan keempat cukup jelas terlihat.
Chip terdiri dari zona berulang (seperti register geser), dan dari gambar seperti itu sangat mudah untuk menganalisisnya: segera menjadi jelas apa yang terjadi pada lapisan yang berbeda. Saya "membalik" bagian yang paling "diisi" dengan banyak logika, yang diulang berkali-kali. Tetapi hal yang paling sulit adalah melacak jejak yang berjalan di sepanjang chip, untuk memahami apa yang dimaksud dengan kontak eksternal. Dari liburan Tahun Baru hingga akhir Februari, saya, bersenjatakan mikroskop baru yang indah, meneliti tugas ini - saya duduk di tempat kerja sampai jam sepuluh malam, "terbalik", pikir saya. Dan kemudian keajaiban baru terjadi: seorang teman dapat mengatur pemotretan chip secara gratis di mikroskop elektron di MIREA. "Photosession" hancur di kuartal pertama cm adalah 50 GB foto hitam putih.
Sekarang semua foto individu ini harus digabungkan menjadi satu gambar utuh. Hampir pada hari yang sama saya menulis sebuah program tentang python yang menghasilkan file HTML - ketika saya membukanya di browser, saya mendapatkan apa yang saya butuhkan. (Omong-omong, Opera ke-10 tertua yang melakukan yang terbaik, saya merekomendasikannya!) Lalu saya menulis program lain pada javascript yang memungkinkan Anda untuk membandingkan lapisan, transisi dengan lancar di antara mereka, menyelaraskannya, memilih skala, dll. Akhirnya, di tangan saya ada semua alat untuk memecahkan masalah utama. Saya melacak jalur yang menembus chip, dan mengembalikan seluruh strukturnya ke transistor terakhir.
Foto lain dari potongan chip yang diambil di bawah x-ray (dalam MIREA):
Fig. 7. Mikroskop elektronSumur terlihat di mana bola dengan bacaan jatuh. Di bawah ini adalah tiga lapisan logam, dan bahkan lebih rendah - lapisan dengan transistor.
Tahap selanjutnya dalam perjuangan untuk masa depan yang lebih cerah adalah penciptaan motherboard untuk chip tersebut. Mendesainnya dan mengirim pesanan produksi. Sementara itu, pengadilan dan kasing menggunakan papan Mars Rover-2 dengan FPGA untuk bekerja dengan chip tersebut. (FPGA, secara umum, adalah array 10.000 elemen logika universal; dengan memprogram FPGA, kita dapat memperoleh logika apa pun yang dapat dengan mudah memproses aliran informasi gigabit.) Saya menulis sendiri firmware untuk FPGA, dan selain itu, saya menulis perangkat lunak untuk mengontrol sistem secara dinamis sistem yang mengatur seluruh konfigurasi untuk FPGA. Kemudian istirahat setengah tahun muncul kembali (dia melakukan perjalanan bisnis ke Danau Baikal, menyiapkan pabrik di laboratorium, yang diperlihatkan kepada Putin). Tetapi pada akhirnya bintang-bintang bersatu: Saya punya waktu, papan siap pakai tiba - dan saya menyusun sistem saya.
Fig. 8. Penciptaan "besi"Dia memberikan semua sinyal yang diperlukan dan - oh, keajaiban! - Saya melihat sinyal dari chip pada osiloskop. (Saya pernah membeli osiloskop seharga 6.000 rubel di eBay, satu lagi senilai firmware 1.000 untuknya.) Bintik-bintik itu terlihat jelas dalam gambar - tetesan beberapa reagen.
Fig. 9. Sinyal dari chip pada osiloskopSekarang saya perlu mencari cara untuk mendigitalkan gambar ini dan mentransfernya ke komputer. Saya mengumpulkan pengaturan ini:
Gbr. 10. Sirkuit instrumen
Fig. 11. Instalasi siapAda komputer yang memasok data kontrol ke board dengan FPGA. Papan menghasilkan sinyal digital dan mengirimkannya ke chip. Sinyal dari chip masuk ke amplifier, lalu ke ADC di papan, itu didigitalkan dan ditransmisikan melalui port COM ke komputer. Secara umum, bandwidth port COM kecil: 15 kilobit per detik (karena ada dari 1 juta hingga 10 juta "piksel" dalam satu chip, dan kecepatan transmisi maksimum adalah 115200 baud). Namun demikian, gambar akhirnya sampai ke komputer.
Fig. 12. Sinyal yang diproses di komputer.Foto di atas menunjukkan bahwa ketika pustaka DNA disuplai ke chip yang digunakan, chip tersebut akan terisi tidak merata: sampai ke ujung - ke tingkat yang lebih rendah. Warna yang berbeda disebabkan oleh perbedaan voltase pada transistor pH. Artinya, kita dapat dengan jelas membedakan lubang-lubang di mana bola dengan bacaan mengenai - kemudian ini akan membantu kita mengontrol pembilasan chip.
Dengan demikian, tugas selanjutnya adalah membilas chip. Itu perlu untuk memastikan bahwa dia menjadi seperti baru. Untungnya, saya memiliki chip yang sama sekali baru sebagai sampel referensi. Dalam Fig. Dan dapat dilihat bahwa di wilayah aktif chip tersebut hampir berwarna sama (garis-garis vertikal hanya kebisingan, gangguan).
Fig. 13. Membilas chipDalam gbr. 13 B Chip tidak dicuci dengan baik - multi-warna. Dalam Gambar 13, D adalah chip yang digunakan tetapi dicuci dengan baik. Terlihat bahwa gradien di sepanjang tepi telah menghilang. Namun demikian, akan bermanfaat untuk membuktikan bahwa itu benar-benar bersih dan dapat digunakan kembali.
Karena pustaka DNA melekat pada lapisan tantalum chip di lingkungan yang asam dan terlepas dalam alkali (mis., Pada pH tinggi), chip dicuci menggunakan pipet semi-otomatis khusus dengan solusi dengan pH berbeda. Sampai saat ini, saya berhasil mencapai pembersihan chip yang hampir lengkap.
Saya tertarik pada mengapa, ketika saya benar-benar memahami struktur chip, saya tidak memesan pembuatannya, tetapi lebih memilih untuk terus mencari dan membiasakan diri, untuk mengotak-atik pencucian mereka, dll. Ya, karena pengembangan sirkuit mikro biaya banyak uang, jutaan dolar, dan sebagian besar dari jumlah ini masuk ke debugging fisik produk yang dihasilkan: pemasangan, penyetelan semua parameter transistor, dll. Artinya, hanya menyalin rangkaian logika tidak cukup. Oleh karena itu, saya mengambil microcircuit gratis yang dirancang dan dibuat siap pakai, dirancang, didebit dan dengan demikian menghemat uang yang signifikan, dengan murah meringankan proyek.
Tugas saya berikutnya adalah merakit perangkat yang lebih canggih, yang memungkinkan transfer informasi lebih cepat ke komputer dan pada saat yang sama tidak akan terdiri dari sejumlah besar papan yang terpisah.
Gbr. 14 Pengembangan versi perangkat selanjutnyaSaya mengambil motherboard baru dengan FPGA - pada chip yang sama ada 2 ARM-core dengan Linux, ada Gigabit Ethernet dan "barang" lainnya, tetapi, tidak seperti versi sebelumnya, tidak ada ADC. Belakangan dia merancang papan lain, dengan ADC kecepatan tinggi dan semua elemen lain yang diperlukan. Diluncurkan - semuanya bekerja.
Apa yang masih harus dilakukan untuk penampilan perangkat akhir? Hanya tiga hal.
Yang pertama. Butuh gigabit internet, transfer data cepat ke komputer. Saya baru menyadari ini kemarin.
Yang kedua. Sistem pasokan reagen. Merancang katup khusus sudah dalam proses.
Yang ketiga. Perangkat lunak untuk memproses informasi dari chip. Saya masih memiliki pertanyaan dengan perangkat lunak, jadi saya mengundang programmer untuk berkolaborasi.
Perangkat terakhir berharga 10 juta rubel. Biaya pengurutan beberapa ribu dolar. Keripik berharga mulai dari $ 100 hingga $ 1.000 - tergantung pada jumlah "piksel" di dalamnya. (Omong-omong, restorasi chip itu sendiri bisa menjadi penghasilan yang baik, terutama mengingat hanya beberapa klik yang diperlukan untuk pembilasan.) Reagen juga dibeli, tetapi di masa depan mereka akan dibuat.
Secara umum, semua ini sangat menarik, tetapi yang utama adalah masa depan. Saat ini, bioteknologi menempati tempat yang sama di dunia, kemajuan sains dan teknologi seperti teknologi komputer di tahun 80-an. abad terakhir. Selain itu, pengurutan merupakan salah satu bidang utama untuk biologi dan kedokteran modern. Dan, tentu saja, bioteknologi sangat menguntungkan.
Baru-baru ini, sequencer semikonduktor S5 telah muncul di pasaran, dan dalam waktu dekat saya berencana untuk beralih ke sana.
Saya akan senang mengobrol dengan semua orang yang ingin berpartisipasi dalam satu atau lain cara dalam pengembangan proyek ini!
Proyek ini tidak akan mungkin terjadi tanpa pelatihan teoretis
Vladimir Zubov . Saya mengucapkan terima kasih padanya.
Terima kasih atas perhatian anda!