Secara umum, kami mendaki Filipina dan mencari bakteri licik. Kemudian kami pergi ke Islandia dengan ahli kimia, dan mereka berbicara tentang ekspedisi ahli biologi ke pegunungan untuk bakteri termofilik (yang tinggal di dekat mata air panas) - dan ternyata keseluruhan cerita ini diperlukan untuk reaksi berantai polimerase. Menjadi sangat menarik bagi saya apa hubungan laboratorium dengan tes darah dengan sumber panas bumi, dan sekarang saya akan menceritakan kisah menarik ini kepada Anda.
Ini berarti bahwa kemarin di Vladivostok, Rospotrebnadzor dan Universitas Federal Timur Jauh membuka pusat pelatihan PCR. Saya pergi ke sana bersama wartawan dan menemukan ilmuwan gila normal yang menjelaskan semuanya dengan jari. Karena inilah yang akan mereka lakukan di sana - mengajar bahasa Vietnam dan Cina. Pada dasarnya - belajar untuk berurusan dengan bio-ancaman.
Jadi apa itu PCR?
Ini adalah kisah tentang cara membuat beberapa juta sama persis dari satu molekul DNA.
Dasar adalah reaksi tiga langkah: melepaskan DNA ke heliks terpisah, kemudian mencari dan menandai awal dan akhir situs yang diinginkan, kemudian menyelesaikan molekul berlabel menggunakan polimerase untuk menyelesaikan. Artinya, itu adalah semacam replikasi DNA dalam tubuh kita, hanya dilakukan secara in vitro. Dan sangat cepat.
Yaitu, kita memotong semua DNA menjadi dua bagian, kita hanya menemukan separuh dari patogen, tandai mereka, kemudian polimerase dibangun ke pasangan yang ditandai. Kami ulangi Kami ulangi
Reaksi modern menggandakan jumlah DNA dalam labu setiap 40 detik. Lebih tepatnya, efisiensi siklus sedikit kurang - dari 78% menjadi 99%, karena tidak semuanya dan tidak selalu terhubung di dunia nyata.
Mengapa ini dibutuhkan?
Jika ada patogen yang mengapung dalam darah Anda, maka Anda dapat membangun reaksi khusus untuknya, yang akan memperbesar (menambah jumlah) DNA-nya. Pada titik tertentu, akan ada begitu banyak dari mereka di dalam minuman sehingga Anda bisa melihatnya. Dan di sini robot akan berteriak: "Ya, saya mengerti!", Dan hasilnya akan "positif".
Sebagai starter, kita hanya membutuhkan 50 molekul per mililiter dalam kasus umum. Sebagai perbandingan, virus flu bahkan tidak ada dalam darah, tetapi dalam air liur pasien dengan gejala pertama - sekitar 10 ribu keping per mililiter.
Mengapa ini masih dibutuhkan?
Anda benar-benar dapat membeli beberapa DNA dari mumi firaun, mammoth atau kulit harimau dan mengurutkannya dengan genom. Artinya, sangat mungkin untuk benar-benar mempertimbangkannya, karena dari jumlah bahan yang dapat diabaikan untuk penelitian Anda akan mendapatkan banyak molekul DNA. Oleh karena itu aplikasi dalam ilmu forensik - Anda dapat menentukan mana dari raja-raja yang sudah meninggal kepada siapa seorang putra. Atau oleh sepasang molekul air liur di TKP untuk menemukan pelaku (langsung Gattaka). Atau bahkan lebih dingin - Anda dapat mereplikasi molekul dengan perubahan, dan Anda mendapatkan mutagenesis yang terkontrol. Tetapi yang terakhir sulit.
Dan PCR adalah reaksi yang sama yang mengubah perilaku sosial masyarakat. Karena dengan bantuannya, ayah ditentukan - Anda hanya dapat memilih bagian DNA yang berbeda dan mengevaluasi di mana dan apa yang berbeda (dan berapa banyak), yaitu mencari kerabat dekat. Nah, atau hanya urut dan evaluasi perbedaannya.
Tetapi kemudian kita berbicara tentang diagnosis infeksi virus dan bakteri - ini adalah penggunaan yang paling luas. Dan di sini mereka mengajarinya di Vladivostok.
Bagaimana PCR secara umum?
Kami mengambil materi, seperti darah atau sesuatu yang lain. Kami dengan hati-hati menyiapkan obat (biasanya 1/3 dari bahan diambil, sehingga dalam kasus kesalahan dalam analisis, dua dosis lagi tetap dalam arsip sampai akhir penelitian). Obat dicampur dengan sistem tes. Dalam labu tertutup kita menempatkan "sup" ini di perangkat untuk menjalankan reaksi.
Selanjutnya, siklus pelepasan DNA, pelekatan primer padanya dan penyelarasan molekul lengkap menggunakan polimerase dimulai. Metode PCR real-time modern menunjukkan bahwa label yang diinginkan menumpuk dan bersinar. Ini luar biasa karena Anda tidak perlu membuka tabung untuk bereaksi terhadap isolasi urutan DNA yang diinginkan. Ketika cahaya dapat direkam, keputusan dibuat bahwa strain yang diinginkan dalam materi itu.
Beberapa siklus lagi memungkinkan Anda untuk menilai tingkat perubahan sinyal dan berhipotesis berapa banyak molekul DNA pada materi awalnya, yaitu, dengan akurasi yang cukup untuk menentukan konsentrasi patogen.
Bagaimana primer tahu apa yang harus melekat?
Primer adalah kotoran yang menempel pada apa yang cocok dengan kode nukleotida-nya. Jika Anda membutuhkan virus rabies, Anda perlu mengurutkannya dengan genom (lebih tepatnya, kami tertarik pada awal dan akhir DNA) dan mencatat tempat-tempat di kedua sisi molekul di mana rantai nukleotida unik. Dan membuat primer untuk mereka. Primer menempel pada bagian DNA, dan polimerase akan mulai bekerja dari atas.
Maka tidak ada yang menempel pada DNA sel darah, hanya untuk rabies.
Primer rabies hanya akan melekat pada rabies. Untuk mendiagnosis sapi Anda terkena rabies dan flu, Anda membutuhkan dua dosis darah dan dua reaksi berbeda.
Sekarang bagian yang menyenangkan. Kita tidak memerlukan awal dan akhir molekul DNA yang tepat untuk diagnosis. Kami hanya perlu banyak situs yang bisa dikenali. Yaitu, pada genom lengkap, misalnya, flu burung, dua fragmen unik harus dibedakan - awal penyalinan dan akhir penyalinan. Sehingga di antara mereka ada sesuatu yang dapat dengan jelas diidentifikasi sebagai flu burung tanpa pemicu positif palsu dan negatif palsu.
Selanjutnya, matematika ikut berperan - perlu untuk membedakan tempat-tempat yang unik dengan genom, dan agar mereka sangat pendek, idealnya dari 15 hingga 30 nukleotida. Dan agar di antara mereka adalah hal yang benar. Dua primer memberikan sesuatu seperti hash dari molekul DNA, yaitu, mereka membiarkannya dijelaskan dalam 30-60 nukleotida.
Dalam situs-situs minimum yang cukup untuk pengakuan dan primer terpasang. Jika mereka berpegang teguh pada sesuatu yang lain - itu adalah target yang buruk, dan akurasi menurun.
Jadi apa hubungannya mata air panas dengan itu?
Faktanya adalah bahwa reaksi terjadi pada suhu tinggi, jika tidak, DNA tidak mengalami denaturasi. Polimerase pada suhu ini biasanya rusak. Biasanya - karena secara khusus dengan bakteri termofilik yang dia khawatirkan dengan tenang. Oleh karena itu, ada ekspedisi ke Kamchatka pada abad terakhir, di mana ahli geologi mencari cara untuk pengobatan molekuler, menembakkan beruang. Dan di Eropa mereka berkendara ke Islandia.
Yang lucu adalah bahwa pada tahun 1976 dan pada tahun 1980 ada publikasi tentang polimerase (kita dan Amerika), tetapi bagi semua orang tampaknya sebagai fakta lucu, dan mereka tidak menemukan aplikasi praktis.
Sekarang Ternyata Taq polimerase dari Thremus aquaticus bekerja sesuai dengan protokol seperti UDP, yaitu, tanpa koreksi kesalahan. Umumnya. Kumpulkan apa yang terjadi - dan jalani saja sendiri. Tapi cepat.
Pfu dan Pwo polimerase diisolasi dari archaea - mereka bekerja dengan koreksi kesalahan, yaitu, mereka tidak memberikan mutasi dalam proses replikasi (oke, mereka hampir tidak), tetapi mereka bertindak jauh lebih lambat.
Sebelumnya, stok haus ini diambil langsung dari sumber, sekarang polimerase dibiakkan di laboratorium. Dan mereka membuat campuran rumit Pfu, Pwo dan Taq - ternyata kilat cepat dan relatif benar.
Seperti apa bentuknya di dunia nyata
Di dunia nyata, Anda memiliki sekotak sistem pengujian dengan tulisan “sifilis” yang menarik, misalnya. Atau flu. Di dalam satu sistem pengujian - semua komponen untuk PCR, kecuali untuk matriks DNA, yaitu darah pasien. Atau bagian lain di mana patogen dicari.
Selanjutnya, Anda perlu mencampur darah dan sistem pengujian, panas dan dingin berkali-kali di bawah tekanan, dan komponen katalis, primer, polimerase dan tambahan akan melakukan semuanya sendiri. Outputnya adalah tabung reaksi dengan 10 molekul DNA kedua belas per mililiter.
Bisakah itu dilakukan di dapur?
Secara teori. Perangkat itu sendiri sangat sederhana, semua teknologi tinggi dalam sistem pengujian - dan sedikit perangkat lunak yang merekam perubahan sinyal cahaya label. Masih membutuhkan akurasi suhu mulai dari 0,1 derajat dan program untuk perubahannya. Ditambah sensor foto. Artinya, zat besi tidak terlalu kompleks. Oleh karena itu, ada begitu banyak laboratorium ini - sangat murah untuk digunakan.
Tetapi di dapur, itu tidak akan berhasil, karena kisah terburuk adalah pencemaran sampel (polusi). Protokol kemurnian adalah apa yang diajarkan lebih dari reaksi itu sendiri. Jika salah satu tabung yang dihasilkan dengan DNA patogen pecah di laboratorium, semuanya akan ditutup dengan lapisan yang rata dari hasil positif palsu. Artinya, semua analisis saat ini - segera oleh hutan, kemudian pembersihan panjang, verifikasi, lalu pengambilan darah yang diarsipkan dan lagi peluncuran garis.
Nah, ini, saya ingatkan Anda, bahwa DNA patogen dan patogen itu sendiri adalah dua hal yang berbeda, seperti kode sumber dan kode yang dikompilasi. Dan bahaya bahwa Anda memecahkan tabung tes dengan 10 pada DNA kedua belas dari patogen tuberkulosis hampir sama dengan menyebarkan sebungkus lembar kode sumber untuk meluncurkan hulu ledak nuklir di lantai.
4-7% dari hasil mungkin palsu positif karena pekerjaan yang ceroboh dan fitur dari dunia nyata. Oleh karena itu, verifikasi menyeluruh atas keandalan hasil dilakukan, khususnya, menggunakan metode matematika.
Seiring dengan bahan PCR konvensional, tabung reaksi dengan air dikenakan. Jika sesuatu mulai menguat di sana, teknisi akan dicabut tangannya pada amandel.
Ini bukan brankas, ini adalah pintu gerbang untuk mentransfer materi ke laboratorium. Personel dipindahkan ke laboratorium di area yang bersih setelah mandi, berganti pakaian dan beberapa prosedur martabat manusia yang lebih merendahkan martabat manusia.Bagaimana Anda bisa mengerti bahwa ada yang salah dengan reaksinya?
Dengan sifat perkembangannya. Reaksi yang biasa dimulai lamban, kemudian fase pertumbuhan eksponensial, kemudian di daerah siklus terakhir - keluar ke dataran tinggi. Jumlah DNA tidak meningkat dengan siklus baru karena berbagai alasan mulai dari penipisan primer hingga penyelesaian salah satu sumber daya, terakumulasi pirofosfat. Plus, belahan DNA yang belum bereaksi sebelum berenang di sup dan memanjat satu sama lain untuk pelukan. Sebagai hasilnya, Anda dapat mengidentifikasi artefak dan reaksi atipikal - ini sudah membuat perangkat lunak untuk penambangan data kecil. Domestik, gratis, diperbarui secara berkala, tetapi bukan open source.
Dan mengapa Anda perlu meningkatkan jumlah DNA dalam obat, jika semua yang Anda butuhkan adalah meningkatkan metode deteksi?
Ada jalur pengembangan seperti itu. Metode fisikokimia sedang diperbaiki, tetapi sejauh ini tidak cukup. Pengalaman terbaru - mereka mengambil plasma darah, disentrifugasi, virus "berat" jatuh ke dasar tabung. Kemudian mereka digoreng dengan spektograf massa laser. Nifiga. Ini bekerja dengan koloni bakteri (mereka sudah melakukannya di laboratorium Moskow sejak lama), tetapi tidak bekerja dengan virus. Dan koloni masih perlu ditanam. Oleh karena itu, sejauh ini (dan, sepertinya, sepuluh tahun ke depan), PCR akan menjadi hal tercepat untuk analisis.
Omong-omong, analisis lengkap dilakukan dalam waktu sekitar 45 menit (dengan persiapan bahan), yaitu, setengah hari
cito atau 4 hari jika laboratorium ada di kota dan Anda berada di desa.
Untuk beberapa penyakit menular, konsentrasi virus sangat rendah. Misalnya, ada kasus ensefalitis - dokter melihat gejala fokal (kerusakan sistem saraf pusat), mengambil darah - bahkan PCR masih tidak menunjukkan apa-apa, dan antibodi sudah dikerahkan. Artinya, PCR akan memberikan hasil lebih lambat dari analisis antibodi, dan spektrografi massa - bahkan kemudian, itu masih pesanan besarnya kurang akurat daripada PCR.
Artinya, hanya satu genom spesifik yang diamplifikasi?
Dalam kasus biasa, ya. Strain paling maju dari penyakit ini ditemukan yang relevan untuk wilayah tersebut, dan primer menargetkan DNA-nya. Tetapi ini adalah situasi yang sedikit utopis, karena pada saat yang sama Anda perlu mencari enam jenis strain yang berbeda sekaligus. Untuk melakukan ini, primer yang berbeda ditambahkan ke set, ditambah sejumlah perubahan yang dilakukan. Secara alami, sistem pengujian lebih mahal. Atau Anda perlu melakukan beberapa reaksi untuk berbagai patogen.
Bisakah saya mengalikan RNA?
Ya, Anda hanya perlu membuat DNA darinya. Reaksi ini lebih kompleks, tetapi menarik karena memungkinkan Anda untuk memisahkan sel-sel mati dari sel-sel hidup. DNA sangat kuat, sehingga bahkan bisa dikupas dari mammoth. Jika virus telah terbunuh, DNA sampel yang mati akan "bersinar" selama 3 minggu. Dan RNA akan hancur lebih cepat. Oleh karena itu, metode NASBA (mencari virus RNA, misalnya) jauh lebih akurat dalam beberapa kasus. Tetapi jauh lebih mahal.
Beberapa hal yang lebih indah
Seluruh sejarah implementasi PCR setelah penemuan teori ini secara langsung menyulitkan masalah fisik dan kimia. Misalnya, bagian DNA yang tidak diketahui dapat diamplifikasi. Untuk melakukan ini, molekul dipotong di area yang diketahui, lalu sisa-sisa direkatkan. Beberapa membalik untuk membentuk molekul dengan kode yang diketahui di awal dan akhir. Primer berpegang teguh - dan pada yang memiliki awal dan akhir, dan bukan hanya satu penanda, amplifikasi dilakukan.
Cerita yang sangat lucu dengan cara menghindari langkah reaksi yang tidak perlu saat memanaskan tabung. Faktanya adalah bahwa bagian pertama dari reaksi berlangsung pada suhu tinggi, tetapi sementara tabung reaksi memanas, Anda dapat secara tidak sengaja mulai dari ketukan yang salah - ini akan secara tajam meningkatkan kebisingan dan kemungkinan kesalahan. Oleh karena itu, opsi dengan fakta bahwa salah satu reagen sistem ditempatkan dalam kapsul lilin (meleleh hanya setelah melewati titik yang diinginkan dan melepaskan komponen tepat waktu) sampai pada pilihan ketika suatu zat ditambahkan ke solusi yang menghalangi reaksi, tetapi rusak pada suhu tinggi.
Ada perlindungan terhadap polusi - molekul pada amplifikasi dapat diberi label dengan cara tertentu, dan kemudian pada awal reaksi, hancurkan semua yang diberi label dengan cara ini. Artinya, jika sesuatu dari satu tabung merangkak ke yang lain, itu akan secara otomatis mengisi reaksi utama.
Fluoresensi juga dingin: suatu zat dimasukkan ke dalam reagen, yang dihancurkan sebagai akibat dari reaksi dengan DNA. Artinya, semakin banyak DNA terbentuk, semakin banyak molekul zat ini rusak. Keseluruhan itu tidak bersinar, tetapi dalam beberapa bagian itu dimulai. Dan semakin banyak molekul DNA bereaksi selama replikasi, semakin banyak tabung bercahaya.
Mengingat bahwa kompleksitas sistem pengujian terus berkembang, peretasan kehidupan dan solusi elegan adalah yang utama.
Mengapa pusat pelatihan PCR di universitas?
Karena ini masih menjadi cerita utama tentang diagnosa penyakit, dan belum tentu pada manusia. Di sini, di Timur Jauh, misalnya, fokusnya mungkin pada phytovirus. Ada virus biner di tempat sampah ibu pertiwi dengan rempah-rempah beras (lebih tepatnya, dua virus yang cocok) yang dapat mengambil dan menempatkan seluruh tanaman di seluruh Asia untuk distribusi. Secara alami, hal seperti itu bukan hanya milik kita - dan itu tidak harus dilepaskan dengan jahat, itu dapat berkembang sesuai dengan kebodohan atau hanya dalam perapian alami. Seperti ensefalitis Jepang di Primorye, fokus musiman nyamuk terus-menerus muncul di sini. Dan kematian dari itu adalah 60 persen.
Musuh yang diduga juga memiliki virus pada hewan dan manusia.
Jadi, spesialis dalam PCR mewakili keamanan negara. Mereka memantau infeksi, menangkap semua penumpang di pesawat, di mana beberapa orang batuk, dan sebagainya. Michael, misalnya, terbang dengan ebola, flu burung dan banyak lagi. Dia mengurutkan genom lengkap dari satu-satunya salinan virus rabies rabies yang ada di dunia.
Mikhail Shchelkanov, Profesor, FEFU, Kepala Pusat Penelitian Federal Virologi untuk Keanekaragaman Hayati, Cabang Timur Jauh dari Akademi Ilmu Pengetahuan RusiaDengan beruang pada umumnya kisah yang luar biasa. Beruang itu mengangkat 5 anjing dan kemudian menyerang nenek. Dia membalikkan paru-parunya dan menarik kulit kepalanya, ditambah seluruh tubuh yang berlumur darah. Para pemburu memutuskan tentang binatang itu bahwa itu adalah jenis beruang yang salah. Dan mereka memberikan jenazahnya kepada para ilmuwan untuk percobaan.
Berikut ini rincian lebih lanjut.
Mikhail juga adalah penggemar anjing laut bulu, karena ia mencintai pulau-pulau dengan benteng-benteng baru. Mereka menularkan virus dan parasit dengan sangat cepat ke seluruh populasi. Mereka menemukan pada kucing di lubang hidung kutu dingin dengan bakteri yang tidak kalah keren. Saat seekor anjing laut menyelam, dia menutup lubang hidungnya. Kutu di dalamnya terasa hangat dan menawan.
Selain keamanan hayati, cerita kedua adalah pelatihan spesialis asing. Ada dua hal penting: pertama, mereka mempelajari sistem pengujian kami (dan kemudian mereka akan cenderung membelinya), dan ini penting untuk ekspor - kami adalah pemimpin dalam CIS (sekitar 25 juta reaksi per tahun), tetapi tidak di dunia. . Kedua, keseragaman pengalaman memungkinkan pemantauan yang sama oleh protokol umum, yaitu, kemudian mengubah database dan pengalaman. Basa, tentu saja, lebih penting. Ini berarti respons yang jauh lebih konsisten terhadap kemungkinan epidemi.
Di Vladivostok, pembukaan resmi tidak bersamaan dengan pembukaan teknis - sekelompok dokter Vietnam sedang menyelesaikan pelajaran terakhir mereka. Dua tahu bahasa Rusia, sisanya belajar melalui mereka. Ada kursus bahasa Inggris sepenuhnya. Pusat yang sama berfungsi di Novosibirsk untuk dokter dan dokter Rusia dari negara-negara CIS, dan spesialis telah lulus di sana selama setahun sekarang.Kami juga melakukan segalanya untuk sistem pengujian kami di Rusia, dan dalam biologi molekuler praktis adalah beberapa yang paling kuat di dunia (secara teori, tidak, tetapi kami dengan cepat dan teknis mengimplementasikan semuanya). Karena itu, pendidikan akan membantu memperluas pasar ini untuk kita. Secara total, 3881 spesialis dilatih di pusat-pusat semacam itu (kelompok-kelompok kecil, karena ada banyak latihan), dan sekarang tugasnya adalah pergi secara luas untuk melatih spesialis asing.
Ini sepenuhnya disebut Pusat Pelatihan Internasional Rospotrebnadzor di Sekolah Biomedik Universitas Far Eastern Federal. Itu sebenarnya dibuka oleh Mikhail Shchelkanov dengan foto di atas dan German Shipulin (FBUN CRI dari Rospotrebnadzor di Moskow). Bukti di media akan besok, rupanya. Yah, saya bukan ahli mikrobiologi, jadi jika saya membuat kesalahan di atas, tolong.
UPD: inilah berita tentang
RG , yang masih memiliki sudut pandang pada cerita ini.