SENS Diagnostics. Biomarker glikasi protein

Pengembangan terapi penuaan tidak mungkin dilakukan tanpa diagnosis penuaan yang dapat diandalkan. Tampaknya tidak masuk akal untuk mengharapkan kematian seseorang atau timbulnya penyakit mematikan untuk memahami: apakah kita memperlambat proses penuaan atau tidak, dengan terapi ini atau itu. Kita harus segera melihat gambaran objektif yang disebabkan oleh intervensi anti-penuaan kita.

Dalam praktik klinis, belum ada "diagnosis penuaan yang besar." Artinya, tidak mungkin bagi pasien dan dokter yang hadir untuk mendeteksi perubahan terkait usia pada tingkat molekuler sebelum timbulnya penyakit. Kami ingin menjembatani kesenjangan ini dengan pertama-tama menggambarkan semua penanda utama perubahan terkait usia dan tingkat teknologi yang tersedia untuk mengukurnya.

Kami akan melanjutkan presentasi konsep SENS-diagnosa penuaan, berdasarkan pada kenyataan bahwa hari ini program SENS (mencapai penuaan yang diabaikan dengan metode rekayasa) paling lengkap menggambarkan pendekatan untuk meningkatkan umur manusia.

Banyak yang telah mendengar tentang glikosilasi protein, produk akhir glikasi (CNG, AGE), dan kerusakan yang mereka lakukan pada tubuh. Namun, perlu dicatat bahwa penambahan gula ke molekul lain jauh dari selalu patologi. Glikosilasi itu sendiri adalah proses fisiologis yang sangat umum dan penting dalam organisme hidup. Jadi, bagian penting dari semua protein yang disintesis dalam sel menjalani glikosilasi enzimatik, yang diperlukan untuk fungsi normalnya.

Pada dasarnya, dua glikans (bagian karbohidrat dari ligamentum adalah molekul organik) berpartisipasi dalam glikosilasi: N-glikans (terkait dengan kelompok amida asparagin) dan O-glikans (dihubungkan dengan gugus hidroksil serin atau treonin). Karena penuaan, kami lebih tertarik pada N-glycans. Dijelaskan bahwa dengan bertambahnya usia, spektrum perubahan rantai gula, yang melekat pada protein imun selama N-glikosilasi. Dan perubahan seperti itu memainkan peran kunci dalam peningkatan peradangan umum yang berhubungan dengan usia dalam tubuh. Dengan demikian, tingkat antibodi IgG glikosilasi dapat memprediksi usia biologis seseorang bahkan lebih akurat daripada panjang telomer [1].

Selain itu, dua glikans lagi, NGA2F dan N2AF, terbukti menjadi biomarker penuaan yang menjanjikan. Sebagai bagian dari program penelitian MARK - AGE Eropa tentang penuaan biomarker, yang berakhir pada 2013, tes GlycoAgeTest dikembangkan untuk menentukan usia biologis seseorang. Hal ini didasarkan pada rasio jumlah glycans NGA2F (meningkat seiring bertambahnya usia) dan N2AF (level yang menurun dengan bertambahnya usia). Potensi biomarker lain dari penuaan dan penyakit terkait usia (kardiovaskular dan diabetes) yang dijelaskan dalam studi MARK - AGE adalah glikoprotein clusterin, yang terlibat dalam stabilisasi struktur protein [2].

Kita sekarang beralih ke pertimbangan bagian patologis dari fenomena ini. Selain enzim glikosilasi yang diatur oleh tubuh, ada bentuk non-enzimatik dari proses ini, yang disebut Reaksi Maillard, yang hasilnya adalah penampilan dalam tubuh berbagai produk glikasi. Perlu dicatat bahwa proses glikosilasi non-enzimatik praktis tidak diatur. Meskipun ada kemungkinan "menahan" glikosilasi melalui transglasi, di mana glutathione, poliamina, tiol, asam amino bebas, seperti taurin, lisin, dikonsumsi. Dan juga melalui inaktivasi methylglyoxal oleh sistem glyoxalase: glyoxalase I mengubah methylglyoxal dan mengurangi glutathione menjadi lactoylglutathione, yang kemudian dimetabolisme menjadi D-laktat oleh glyoxalase II.

Struktur metilglioksal

Di antara produk-produk glikasi, produk-produk glikasi awal (Amadori) dan akhir (atau akhir) dibedakan. Glikosilasi non-enzimatik terjadi dalam beberapa tahap. Proses ini dimulai dengan fakta bahwa glukosa dan gula sederhana lainnya bergabung dengan gugus amino dan memicu rantai reaksi lebih lanjut. Pada awalnya, selama reaksi antara gugus gula aldehida dan gugus amino, terbentuk suatu gugus aldimin (basa Schiff) yang tidak stabil, yang dapat berubah menjadi sejumlah senyawa lain yang lebih stabil, produk glikosilasi awal, yang disebut Produk Amadori. Salah satu produk paling awal dari penambahan glukosa pada protein adalah Ne - fruktosil - lisin, yang, pada gilirannya, menurunkan berbagai produk akhir glikasi (CNG). Hydroimidazolones, turunan residu arginin yang dimodifikasi oleh glioksal, metilglioksal, dan 3-deoksiglukoson (3-DG), diproduksi dalam jumlah terbesar sebagai CNG. CNG lain yang dipelajari dengan baik adalah Nδ - karboksimetil - lisin (CML) dan Nδ - karboksetil - lisin (CEL), serta glukosepana dan pentosidin, yang merupakan karakteristik dari ikatan silang protein [3]. Salah satu jenis CNG yang paling mudah didefinisikan adalah pentosidin, yang terakumulasi, misalnya, dalam tendon otot-otot besar seseorang (yaitu, di mana kecepatan pergantian kolagen melambat) dari usia 20 dan konsentrasinya meningkat secara linear ke usia tua.

Sampai saat ini, diyakini bahwa glukosa adalah zat utama untuk pembentukan CNG. Tetapi pembentukan yang tepat dari tingkat yang berbeda dari pembentukan CNG intra dan ekstraseluler menunjukkan bahwa hal ini tidak terjadi. Gula seperti fruktosa, glukosa-6-fosfat dan gliseraldehida-3-fosfat memiliki tingkat pembentukan CNG intraseluler yang lebih tinggi. Efek negatif gliseraldehida pada molekul aktin kontraktil dan protein sitoskeletal utama telah dijelaskan, yang mengarah pada pembentukan ikatan silang pentosidin dan bithyrosine dan hilangnya fungsi aktin [4].


Ikatan silang molekul kolagen dengan glukosepan.

Glikosilasi non-enzimatik dan CNG sekarang dianggap terkait erat dengan berbagai penyakit yang tergantung pada usia, seperti diabetes, rheumatoid arthritis, aterosklerosis, penyakit Parkinson dan Alzheimer, sklerosis lateral amyotrophic, katarak dan kanker [5]. Protein yang mengalami glikasi dalam reaksi Maillard menjadi ikatan silang secara apologis, sementara kehilangan sifatnya. Ini menyajikan masalah besar terutama untuk protein berumur panjang (misalnya, molekul kolagen kulit, menurut sejumlah penelitian, memiliki paruh 15 tahun, dan tulang rawan lebih dari 100 tahun), yang merupakan bagian penting dari semua protein dalam tubuh - sekitar sepertiga. Menghasilkan ikatan silang tambahan antara molekul melanggar fungsi protein ini, yang menyebabkan hilangnya elastisitas jaringan dan sering diamati dengan penuaan dan patologi. Glycation juga menyebabkan protein kolagen yang sudah diperbarui secara perlahan menjadi lebih lama - setelah glikasi ia memperoleh resistensi terhadap aksi fisiologis kolagenase endogen, yang menyediakan pembaruan jaringan.


Gambar (a) menunjukkan diagram fibril kolagen dan pembentukan glukosa, yang secara kovalen mengikat rantai samping lisin dan arginin. (B) Struktur kimia glukosopan ditunjukkan, yang menghubungkan silis lisin (biru) dengan arginin (merah). (c) Model molekul glukosopana diperlihatkan.

Partisipasi faktor pertumbuhan fibroblast terglikasi β-FGF dalam pembentukan fibrosis dijelaskan. Glikasi urutan arg-gli-asp dari protein fibronektin mengarah pada pelanggaran kemampuan regeneratif vaskular dan perkembangan patologi vaskular. CNG menumpuk di lensa dan retina seiring bertambahnya usia. Kristal, protein struktural utama lensa mata, rentan terhadap glikasi dan ikatan silang. Glikasi protein lensa menyebabkan katarak. Glycated hemoglobin, yang digunakan untuk menentukan tingkat glikemia rata-rata selama 3 bulan terakhir, kehilangan kemampuan untuk mentransfer oksigen ke jaringan, yang secara negatif mempengaruhi banyak proses kimia.

Diketahui juga bahwa glikasi protein dan pembentukan CNG disertai dengan peningkatan aktivitas radikal bebas dan peroksidasi lipid, yang berkontribusi pada perkembangan penyakit terkait usia. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa dalam proses glikasi protein, proses oksidasi otomatis gula diluncurkan, disertai dengan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS). Selain itu, pengikatan CNG ke reseptor CNG (RAGE) juga mengarah pada pembentukan ROS reaktif dan aktivasi selanjutnya faktor transkripsi sensitif stres oksidatif NF-kB yang terkait dengan peradangan dan atherogenesis.

Pada gilirannya, aktivasi NF-κB meningkatkan ekspresi RAGE, menciptakan siklus umpan balik positif yang meningkatkan produksi promotor inflamasi. Selain itu, interaksi CNG-RAGE mengaktifkan NADPH oksidase (kompleks enzim yang menghasilkan superoksida), yang meningkatkan stres oksidatif intraseluler. Dan peningkatan stres oksidatif oleh NADPH oksidase sebagai respons terhadap interaksi AGE-RAGE mengaktifkan, pada gilirannya, NF-κB. Dan di sini kita dapat mengamati sejumlah "lingkaran setan" - siklus dengan umpan balik positif.

Glikasi protein rantai pernapasan mitokondria juga berkontribusi pada proses ini: gangguan rantai pernapasan berfungsi sebagai sumber radikal superoksida yang konstan. Selain itu, pembentukan mitokondria dan struktur lain di bawah pengaruh glikasi CNG yang tidak dapat didompos dapat bertanggung jawab atas implementasi fenomena seperti "memori metabolik". Ketika pada pasien dengan diabetes tipe 2, kontrol glikemik yang ketat tidak lagi mencegah perkembangan komplikasi yang terkait dengan penyakit kardiovaskular. Diasumsikan bahwa CNG yang tidak dapat dikompos memainkan peran utama dalam fenomena ini [6].

Juga, dengan glikasi, peningkatan proses inflamasi terjadi. Jadi, selama glikosilasi kolagen, produk akhir dari proses ini terakumulasi dalam matriks ekstravaskular, yang dirasakan tubuh sebagai benda asing. Karena itu, respons imun akan muncul selama sel-sel kekebalan - makrofag - akan meningkatkan sekresi sitokin pro-inflamasi (TNF-α, interleukin-6, dll.), Yang dikenal karena kemampuannya untuk secara negatif mempengaruhi resistensi insulin dan atherogenesis [7].

Selain itu, protein "cross-linked" mengubah struktur (nanotopografi) dan meningkatkan kekakuan matriks ekstraseluler dan, melalui sensororeseptor membran dan sitoskeleton sel, bersama-sama dengan molekul pensinyalan, memengaruhi ekspresi gen, memengaruhi ekspresi gen, fungsi sel, jaringan, dan tubuh secara keseluruhan. Selain itu, berkat prolin, molekul kolagen melakukan gelombang elektromagnetik lemah yang dihasilkan oleh sel dan jaringan, dan, mungkin, di samping sinyal mekanik dan kimia, membentuk sistem sinyal bioelektrik tunggal tubuh. Sangat menarik untuk dicatat bahwa dengan mengubah topografi medium atau radiasi elektromagnetik, Anda tidak hanya dapat mengendalikan siklus sel, tetapi juga mengubah sel somatik dewasa menjadi sel punca tanpa bantuan virus dengan vektor faktor Yamanaka.

Bahkan perubahan kecil dalam modulus geser dan viskoelastisitas media antar sel memiliki efek yang kuat pada sel - matriks ekstraseluler "lama" dapat secara signifikan membatasi efektivitas penggunaan senolitik dan terapi sel induk. Jadi, fibroblast "muda" dengan cepat menua dalam matriks lama dan sebaliknya - sel "tua" kehilangan tanda-tanda fenotip sekresi terkait penuaan dalam matriks "muda".

Apa penyebab protein terglikasi dan CNG? Diyakini bahwa yang utama bagi manusia modern saat ini adalah junk food. Kerak coklat-hitam goreng pada produk mewakili koleksi CNG, terbentuk karena proses termal produk (menggoreng daging, kentang, dll) pada suhu tinggi. Bacon goreng dianggap sebagai pemegang rekor jumlah CNG yang terbentuk. Selain itu, konsumsi makanan yang mengandung banyak karbohidrat cepat (gula-gula, minuman manis, dll.) Juga dapat berkontribusi terhadap glikasi protein dan pembentukan CNG. Ada produk yang diketahui yang, sebaliknya, membantu menahan akumulasi CNG - lobak hitam, lobak, brokoli, berkat zat sulforaphane yang terkandung di dalamnya. Tidak mengherankan, tetapi bersama dengan gourmets, perokok secara teratur memasok diri mereka dengan dosis tinggi CNG. Asap tembakau mengandung glikotoksin yang bereaksi dengan residu lisin dan arginin membentuk CNG. Ini mungkin mengapa perokok memiliki peradangan kronis pada organ pernapasan [8].

Seperti yang telah disebutkan, di samping pengaruh faktor-faktor eksternal, pembentukan CNG juga biasanya terjadi secara endogen (yaitu di dalam tubuh) di bawah kondisi fisiologis. Meskipun proses ini lambat dan tidak signifikan, proses ini meningkat secara signifikan dengan peningkatan konsentrasi radikal bebas, dengan resistensi insulin, diabetes mellitus dan peningkatan glukosa darah. Akumulasi dalam tubuh, CNG menarik seseorang ke dalam "rawa" proses patologis, yang darinya tidak mudah untuk keluar.

Dalam ekspresi figuratif dari penulis SENS, protein cross-linking bertindak sebagai "borgol" molekuler yang mengikat molekul protein, sehingga melanggar fungsinya. SENS penulis melihat solusi untuk masalah ini dalam pengembangan obat yang dapat bereaksi dengan cross-linking dan memecahnya tanpa merusak fitur struktural lain dari molekul. Menurut pendapat mereka, keadaan yang menguntungkan dalam proses ini adalah bahwa ikatan silang yang terjadi sebagai kecelakaan kimia dalam struktur molekul protein kita memiliki struktur kimia yang sangat tidak biasa, yang biasanya tidak terjadi pada zat yang diproduksi oleh tubuh. Apa yang harus memfasilitasi pencarian dan pembuatan agen terapeutik.

Selain itu, penulis SENS mengidentifikasi sejumlah pendekatan yang menjanjikan untuk menyelesaikan masalah ini. Seperti menemukan atau mengembangkan enzim, alih-alih obat, untuk memecah ikatan silang. Serta pengembangan protein "sekali pakai" yang akan menghancurkan ikatan silang, dan kemudian diri mereka sendiri akan hancur dalam proses tersebut. Diketahui bahwa protein tersebut ada untuk tujuan lain, misalnya, protein regenerasi DNA MGMT [9]. Dalam mendukung pendekatan untuk mencari enzim, fakta bahwa enzim dehidrasi dijelaskan dalam organisme hidup. Jadi, pada jamur dan bakteri, enzim tahan glikasi amadoriasis, fructosolysin-6-kinase frlD dan fructosolysin-6-phosphate deglycase frlB, yang bekerja pada senyawa asam amino berat molekul rendah dengan gula, ditemukan [10]. Dalam vertebrata, enzim fructosamine-3-kinase (FN3K) dan protein terkait FN3K-RP ditemukan, yang mampu memecah produk glikasi secara intraseluler dalam proses yang bergantung pada ATP [11].

Dipercayai bahwa glucepane memiliki efek terbesar pada perjalanan penyakit pada manula dan karenanya merupakan target prioritas untuk terapi anti-penuaan.

Sayangnya, glukosepane tidak dipilih sebagai target untuk obat anti-silang yang dikembangkan sebelumnya, seperti Alagebrium / ALT-711 (Wolffenbuttel et al., 1998), C36 (Cheng et al., 2007), TRC4149 (Pathal et al., 2008 ), dan dia hanya perlu membuktikan perannya dalam mekanisme penuaan. Zat-zat ini ditujukan untuk menetralkan karboksimetilmisilin, produk reaksi Maillard terlambat paling umum yang terakumulasi dalam tubuh dengan diabetes.

Saat ini, sekelompok David Spiegel dari Universitas Yale sedang mengerjakan sintesis antibodi terhadap protein yang mengandung glukosa. Aubrey de Grey mengonfirmasi pentingnya penelitian glyepane dan baru-baru ini mengumumkan pendaftaran Revel, atas dasar di mana penelitian dimulai di universitas mungkin akan dilanjutkan.

Namun, ada kemungkinan bahwa antibodi maupun enzim, karena ukurannya, tidak akan dapat menembus di antara fibril kolagen. Selain itu, ikatan silang sobek kolagen dipulihkan setelah mengambil obat, yang akan membutuhkan terapi kedua.

Oleh karena itu, katalis mirip enzim buatan, yang ukurannya bisa beberapa kali lebih kecil dari ukuran enzim asli, tampaknya menjadi alternatif yang lebih menarik. Molekul serupa dengan aktivitas katalitik tertentu - spiroligomer - sedang dikembangkan oleh sekelompok Christian Schaffmeister dari Temple University.

Seperti disebutkan sebelumnya, karena produk akhir glikasi menumpuk selama penuaan, kuantifikasi mereka dapat menjadi penanda penuaan yang akurat dan dapat diandalkan. Namun, baik deteksi CNG dalam tubuh maupun diagnosis dini perubahan komposisi dan struktur matriks antar sel sulit dilakukan karena sifat perubahannya, dibatasi oleh organ dan sistem, dan kebutuhan akan biopsi multipel. Bahkan dalam satu organisme, hasilnya sangat bervariasi tergantung pada lokasi biopsi dan jenis produk akhir glikasi yang sedang diperiksa.

Metode yang tersedia untuk menentukan produk glikasi akhir di kulit, seperti autofluoresensi, yaitu, tanpa menggunakan pewarna khusus (perangkat AGE-READER yang diproduksi oleh perusahaan Belanda DiagnOptics BV) tidak memberikan data yang akurat dan banyak faktor yang dapat mempengaruhi hasil pengukuran, misalnya, perubahan dalam air - .

– . - .

. ( , .). , –. . ( , ) .

, , , - (). , , . , , (RAGEs). RAGE , Nf-κB (, -, -6 C- ). , . , - , [12].

, - , . 6- Invecchiare in Chianti, 1.013 65 , , , , , , [13]. 2018 , D1-B2, , . [14]

- (, DOGDIC, MODIC GODIC), [15]. , – GOLD MOLD [16].

: , .