Analisis kecepatan mikromotor molekuler untuk diagnosis HIV

Human immunodeficiency virus atau hanya HIV adalah wabah abad ke-20. Judul yang cukup keras, tetapi tidak dibesar-besarkan. Penyakit ini merenggut jutaan nyawa. Dan setiap tahun jumlah korban penyakit berbahaya ini terus bertambah, serta jumlah penelitian yang bertujuan untuk mengobati dan mendiagnosis HIV. Setiap penyakit, dan HIV tidak terkecuali, paling mudah diobati pada tahap awal perkembangan. Tetapi ini membutuhkan cara untuk mengenalinya sedini mungkin, bahkan sebelum gejala pertama mulai terwujud. Ketika Anda, katakanlah, potong jari, Anda melihat luka, yaitu, Anda jelas tahu apa yang harus dirawat. HIV dapat hidup dalam tubuh manusia tanpa memanifestasikan dirinya, yaitu tanpa gejala, untuk beberapa waktu. Hari ini kami akan mempertimbangkan penemuan baru yang dapat dengan cepat dan akurat menentukan keberadaan virus imunodefisiensi melalui perangkat kecil yang terhubung ke smartphone. Bagaimana inovasi ini bekerja, seberapa akurat hasilnya dan apa yang direncanakan oleh para peneliti di masa depan? Kami akan mencari jawaban untuk ini dan pertanyaan lain dalam laporan kelompok penelitian.

Dasar teoretis

Berbicara tentang penyakit itu tidak menyenangkan, tetapi perlu. Semakin kita tahu tentang mereka, semakin baik kita melindungi diri kita sendiri dan orang-orang yang kita kasihi dari pengaruh mereka.



Virus HIV-human immunodeficiency pertama kali menunjukkan seringai mengerikan pada awal 80-an abad terakhir. Kemudian tidak ada yang tahu apa itu, dan virus itu sendiri bahkan tidak punya nama. Penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa HIV adalah retrovirus yang menginfeksi sel-sel dalam sistem kekebalan tubuh, salah satu sistem yang paling penting. Efek virus ini adalah penekanan pertahanan kekebalan dan pengembangan sindrom defisiensi imun yang didapat. Dalam keadaan ini, tubuh tetap tak berdaya, dan infeksi apa pun, bahkan yang paling ringan sekalipun (serta sel kanker) dapat memengaruhinya secara dramatis. Intinya, HIV menghancurkan pertahanan kita dan musuh dalam menghadapi infeksi dengan tenang mengambil alih tubuh.

HIV memiliki mekanisme kontak penularan. Infeksi dapat terjadi melalui kontak dengan darah, air mani, ASI, cairan pra-seeded, atau cairan vagina. Dengan kata lain, hubungan seksual tanpa kondom, instrumen medis yang terinfeksi, dan bahkan jarum yang tidak terinfeksi di salon tato adalah cara yang bagus untuk menyebarkan virus. Pada periode kemunculan HIV, ketika kepanikan menyebar di antara populasi lebih cepat daripada informasi yang dapat dipercaya tentang apa itu HIV dan bagaimana penyebarannya, diyakini bahwa infeksi dapat berasal dari jabat tangan sederhana. Ini adalah mitos, karena virus tidak menyebar melalui sentuhan sederhana dengan orang yang terinfeksi. Namun, opsi infeksi ini juga mungkin, tetapi hanya dalam kasus luka terbuka di tangan orang yang terinfeksi dan kemungkinan korban infeksi. Saya tidak berbicara tentang fakta bahwa beberapa nyamuk dianggap menularkan HIV (nyamuk meminum darah pasien dan, setelah menggigit orang yang sehat, dapat menularkannya) juga merupakan mitos.


Prevalensi HIV di seluruh dunia menurut Organisasi Kesehatan Dunia (2017).

Saya tidak akan menjelaskan secara rinci virus dan konsekuensi perkembangannya di dalam tubuh, karena kita akan membahas virus itu sendiri bukan sebagai metode baru untuk diagnosisnya. Tetapi perlu dicatat bahwa HIV adalah virus pasien yang dapat bermutasi dalam tubuh orang yang terinfeksi dari waktu ke waktu, yang membuatnya semakin kebal terhadap berbagai metode penahanan atau perawatan. Ini adalah alasan lain mengapa harus dideteksi sedini mungkin. Semakin banyak waktu virus, semakin kuat, dan semakin lemah orang yang terinfeksi.

Terdiri dari apa perangkat itu?

Para ilmuwan yang terlibat dalam penelitian ini mengatakan bahwa salah satu masalah dan hambatan paling serius dalam diagnosis dini HIV, seperti penyakit lain, di dunia adalah kurangnya kondisi yang sesuai: laboratorium, personel, fasilitas medis. Itulah sebabnya mereka memutuskan untuk membuat perangkat yang dapat secara akurat menunjukkan apakah ada virus di dalam tubuh atau tidak. Kadar gula darah sudah dapat diperiksa untuk waktu yang lama menggunakan perangkat compact portable (glukometer), yaitu, tanpa harus mengunjungi laboratorium dan menunggu hasil tes selama beberapa hari. Biaya perangkat semacam itu cukup rendah, yang juga menyertai distribusi mereka.

Perangkat yang akan kita kenali hari ini dapat secara singkat dijelaskan sebagai berikut: penganalisis bergerak untuk penentuan molekul HIV-1 berdasarkan loop isothermal amplification (LAMP) dan nanomotors (CALM). Dan sekarang, secara berurutan.

Nanomotors

Nanomotors (juga disebut mikromotor) disebut perangkat molekuler mikroskopis yang mampu mengubah energi dalam gerakan. Jika mereka ditempatkan dalam larutan kimia tertentu, mereka mulai bergerak secara independen di sepanjang rute tertentu, yang dapat digunakan dalam diagnostik, dan bahkan dalam pasokan energi perangkat teknologi nano.


Skema pembentukan motor kecil untuk penguji HIV.

Mikromotor adalah bidang yang terbuat dari polistiren yang dilapisi dengan partikel nano Pt (platinum) dengan kepadatan 1,04 g / cm. Selanjutnya, Au (emas) nanopartikel juga digunakan untuk memodifikasi mikrometer dengan probe DNA (dalam diagram di atas, mereka disajikan sebagai "tentakel" merah).

TEM (mikroskop elektron transmisi) menunjukkan bahwa platinum dan nanopartikel emas yang digunakan dalam pelapisan mikrometer berbentuk bola dan berdiameter 57,721 ± 5,181 nm (Pt) dan 3,43 ± 1,336 nm (Au).


Di atas adalah gambar TEM, labu foto dengan nanopartikel disiapkan dan hasil spektroskopi optik.

Itu perlu untuk memeriksa seberapa efisien suatu penyelidikan DNA dari motor kecil yang terbentuk dapat menangkap molekul DNA. Untuk ini, teknik elektroforesis gel agarose * (C ₁₂ H ₁₈ O ₉ ) digunakan.

Agarose * adalah polisakarida linier yang dibentuk oleh sekuens residu β-D-galaktopiranosa dan 3,6-anhidrida-α-L-galaktopiranosa yang dihubungkan oleh ikatan 1 → 4. Diperoleh dari agar-agar.

Teknik ini memungkinkan kami untuk mengkonfirmasi bahwa mikromotor memiliki probe DNA di permukaannya, karena mereka dapat melampirkan molekul DNA buatan sekitar 180 bp (pasangan berpasangan), yang merupakan hasil yang sangat baik untuk sampel (buatan) semacam itu (gambar di sebelah kiri). Tingkat efisiensi penangkapan selama tes pertama adalah sekitar 30%, yang dikonfirmasi oleh fluorimetri (gambar di sebelah kiri).


Di sini kita melihat bagaimana mikrometer bergerak dalam larutan dengan konsentrasi H ₂ O _{2 yang berbeda} (0, 5, 10 dan 15%).

Itu juga perlu untuk memeriksa fitur paling penting dari mikrometer - gerakan. Untuk ini, solusi dengan dan tanpa H ₂ O _{2 digunakan} (perbandingan lintasan pada gambar d di bawah). Ketika hidrogen peroksida tidak ada, mikromotor bergetar, yang disebabkan oleh gerakan Brown. Ketika H2O2 mulai dimasukkan ke dalam larutan, kecepatan mikromotor meningkat sekitar 0,7 μm / s untuk setiap 1% hidrogen peroksida dalam larutan.


Pengukuran kecepatan mikromotor dalam larutan uji.

Gambar a menunjukkan ketergantungan kecepatan mikrometer dengan diameter 6 μm dan konsentrasi H ₂ O ₂ dalam larutan. Juga (di sebelah kanan) adalah snapshot dari motor kecil dan lintasannya. Diagram b menunjukkan tingkat stabilitas mikromotor pada berbagai suhu dalam larutan hidrogen peroksida 5%. Di bawah ini (grafik dan foto) kita melihat bagaimana indikator stabilitas berubah dari waktu ke waktu (120 detik), serta lintasan pergerakan yang sudah ada dalam solusi 15%. Pemindahan rata-rata akar kuadrat dari waktu ke waktu ditunjukkan dalam grafik e : titik hitam - solusi tanpa H ₂ O ₂ , merah - 5% H ₂ O ₂ .

Di bawah ini, dalam gambar f , kita melihat bahwa tidak hanya keadaan solusi di mana mikrometer terletak mempengaruhi perilaku mereka, tetapi mikromotor itu sendiri, dan lebih tepatnya struktur mereka, juga secara signifikan mengubahnya. Kita melihat bagaimana mikromotor dengan diameter 3 μm tanpa pengendapan platinum dan emas bergerak (garis biru) dibandingkan dengan mikrometer penuh yang diuji dengan diameter 6 μm (garis merah). Di sebelah kanan perbandingan lintasan adalah perbandingan perpindahan kuadrat rata-rata mikrometer (diameter 3 μm dan 6 μm).

Perangkat seluler

Motorola XT1575 (Android OS) digunakan untuk memvisualisasikan dan melacak mikromotor (yaitu, untuk memantau bagaimana diagnosa terjadi).


Tampilan dan detail perangkat.

Komponen penting dari perangkat ini adalah chip yang diperlukan untuk memeriksa pergerakan mikrometer. Itu terbuat dari polimetil metakrilat (Plexiglas). Dasar kaca dengan "saluran" laser-potong selebar 2 mm dilekatkan padanya menggunakan lapisan lem 80 μm.


Tampilan chip dan dimensinya.

Seperti dapat dilihat dari gambar di atas, chip bukan satu-satunya bagian dari perangkat. Kasing biru yang dapat dilepas terbuat dari bahan yang tidak mahal pada printer 3D. Di dalam case ini ada LED putih, baterai 3,3 V, saklar dan lensa optik murah. Juga dalam kasus ini ada tempat sampel yang memungkinkan Anda untuk menempatkannya di antara lensa dan kamera ponsel.

Dan sekarang tentang komponen perangkat lunak. Perangkat lunak ini dibuat di Android Studio menggunakan pustaka OpenCV 3.1.0. Antarmuka, menurut para ilmuwan, telah dibuat sejelas dan sepraktis mungkin bagi pengguna.


Antarmuka penguji HIV.

Ketika sampel ditempatkan di perangkat, program merekam video (30 fps, 320x240 piksel), yang menunjukkan pergerakan mikromotor, menghitung kecepatan gerakan mereka dan dalam 1 menit memberikan hasil analisis.

Loop Isothermal Amplification (LAMP)

Seberapa efektif sistem mikromotor dalam mengenali HIV-1? Jawaban untuk pertanyaan ini terletak pada reaksi LAMP. Untuk pengujian, beberapa sampel disiapkan dengan konsentrasi RNA HIV-1 (asam ribonukleat) yang berbeda. Hasil amplifikasi dievaluasi dengan elektroforesis gel agarosa.


Pengujian LAMP.

Hasil elektroforesis menunjukkan pembentukan bertahap amplikon DNA besar (urutan DNA, hasil amplifikasi). Jumlah amplikon sebanding dengan konsentrasi RNA HIV-1.

Mikrometer dicampur dengan amplikon RNA HIV-1, sehingga memungkinkan untuk menjalani proses hibridisasi (pada suhu 80 ° C). Selanjutnya, "campuran" yang dihasilkan diuji dalam larutan 5% dari H2O2. Ketika amplikon RNA HIV-1 hadir dalam sistem, kecepatan mikrometer sangat berkurang, sekitar 95,26%. Penurunan laju diamati bahkan pada konsentrasi rendah amplikon (sekitar 3,394 ± 0,245 ng / μl).


Demonstrasi pergerakan motor kecil tanpa adanya RNA HIV-1.


Demonstrasi gerakan mikromotorik di hadapan RNA HIV-1.

Para ilmuwan juga berhasil memulihkan mikromotor dan kecepatannya. Untuk ini, sampel "terinfeksi" dengan mikromotor dan amplikon diinkubasi selama 30 detik pada suhu 90 ° C. Ini memungkinkan untuk membebaskan amplikon dari probe DNA motor kecil. Ini diikuti oleh sentrifugasi pada 6000 x g selama 5 menit. Verifikasi sampel yang diperoleh dalam larutan 5% H ₂ O ₂ menunjukkan bahwa kecepatan mikromotor dipulihkan ke level 75,52% dari aslinya, sebelum pengujian dengan partisipasi amplikon RNA HIV-1.

Reaksi sistem terhadap jenis lain dari virus yang ditularkan secara seksual juga diuji: hepatitis C dan B, herpes, papillomavirus 16 (HPV-16). Karena seringnya kasus infeksi paralel dengan HIV dan beberapa virus di atas, tes ini juga sangat penting. Hasilnya memuaskan - amplikon DNA hanya terbentuk di hadapan HIV. Artinya, keberadaan virus lain dalam sampel uji tidak memengaruhi proses memeriksanya.

Kesimpulannya sederhana - metode ini dapat menentukan keberadaan HIV. Tetapi sekarang perlu dilakukan kalibrasi agar sistem dapat membedakan ada dan tidaknya virus dalam sampel, dengan fokus pada konsentrasi standar 1000 partikel / ml. Jika konsentrasi di bawah indikator ini, maka hasilnya negatif (tidak ada virus), jika konsentrasi lebih tinggi, itu positif. Untuk melakukan kalibrasi, perlu ditentukan kecepatan mikromotor sesuai dengan konsentrasi apa. Untuk ini, PBS - buffer natrium fosfat (solusi khusus untuk penelitian) dan plasma pasien dengan dan tanpa HIV digunakan.

Kalibrasi dilakukan menggunakan PBS, di mana konsentrasi RNA HIV-1 yang distabilkan secara sintetis berkisar dari 0 hingga 107.

Setelah kalibrasi, menjadi jelas bahwa kecepatan mikromotor rata-rata pada konsentrasi HIV 1000 adalah 0,705 ± 0,082 μm / s.


Hasil menentukan konsentrasi RNA HIV-1.

Para ilmuwan juga menganalisis sistem menggunakan kurva ROC, yang menunjukkan hasil yang sangat menggembirakan. Sensitivitas * dari sistem yang diuji adalah sekitar 94,6% dengan CI * 81,8-99,3%, dan spesifisitas * 99,1% dengan CI 80,5-100%.

Sensitivitas * - indikator yang mencerminkan bagian dari hasil positif (dalam hal ini, adalah probabilitas bahwa konsentrasi HIV dalam sampel di atas 1000).

Spesifisitas * adalah indikator yang mencerminkan bagian dari hasil negatif (dalam hal ini, adalah probabilitas bahwa konsentrasi HIV dalam sampel di bawah 1000).

DI * - interval kepercayaan, yaitu interval yang mencakup parameter yang tidak diketahui dengan keandalan yang diberikan.

Scatterplot dari hasil sistem juga menunjukkan hasil yang luar biasa. Dengan demikian, akurasi penentuan sampel dengan konsentrasi tinggi HIV sebagai positif adalah 100%, dan akurasi penentuan sampel negatif adalah 90%.



Mereka yang ingin membiasakan diri dengan studi ini secara lebih rinci dapat melihat laporan para ilmuwan dan materi tambahan untuk itu.

Epilog

Para ilmuwan yang menciptakan perangkat luar biasa ini tidak menyangkal bahwa mereka belum melakukan banyak pengujian, kalibrasi, dan peningkatan. Tapi mereka jelas di jalur yang benar. Perangkat semacam itu dapat secara signifikan mengurangi penyebaran HIV, terutama di antara orang-orang di tempat-tempat di mana laboratorium dengan staf dan banyak peralatan medis tidak tersedia.

Ya, perangkat ini belum terlihat sangat ringkas dan fakta bahwa itu membutuhkan penggunaan smartphone dapat mendorong seseorang menjauh. Namun, di masa depan, teknologi semacam itu untuk diagnosis dini HIV akan terus meningkat, tidak hanya dalam hal efisiensi dan akurasi, tetapi juga dalam hal kenyamanan dan keterjangkauan.

HIV adalah wabah abad ke-20, seperti yang saya tulis di awal cerita ini. Namun, sayangnya, virus ini tidak begitu jauh dari judul "wabah abad XXI." Saat ini, beberapa penyakit sudah mengklaim gelar yang keras (misalnya, depresi, diabetes, dll). Dan masing-masing penyakit ini membutuhkan perhatian besar. Dan sementara tidak ada pil ajaib yang dapat menyembuhkan penyakit apa pun, kami hanya dapat meningkatkan metode diagnostik yang tersedia, yang memberi kami waktu tambahan untuk mencari pengobatan atau mengandung penyakit. Seperti yang mereka katakan, semakin cepat kita tahu tentang suatu masalah, semakin besar peluang kita untuk menyelesaikannya.

Poin penting lainnya adalah aktivitas sosial, keterbukaan dan diskusi. Masalahnya harus didiskusikan, karena meskipun menakutkan untuk membicarakannya, bagaimana masyarakat berniat memeranginya?

Bagaimanapun, itu saja untuk saya. Jaga dirimu dan orang yang kamu cintai.

Terima kasih telah tinggal bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikannya kepada teman-teman Anda, diskon 30% untuk pengguna Habr pada analog unik dari server entry-level yang kami temukan untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps dari $ 20 atau bagaimana membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps hingga Desember secara gratis ketika membayar untuk jangka waktu enam bulan, Anda dapat memesan di sini .

Dell R730xd 2 kali lebih murah? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 249 di Belanda dan Amerika Serikat! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?